Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تحريض وتحليل الإجهاد التأكسدي في الجمال النائم Transposon-Transfected الخلايا الظهارية صبغة الشبكية البشرية

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/61957
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

نقدم بروتوكول لتطوير واستخدام نموذج الإجهاد التأكسدي عن طريق علاج الخلايا الظهارية الصباغية الشبكية مع H2O2، وتحليل مورفولوجيا الخلايا ، وقابلية البقاء ، والكثافة ، الجلوتاثيون ، ومستوى UCP-2. وهو نموذج مفيد للتحقيق في التأثير المضاد للأكسدة من البروتينات التي تفرزها الخلايا المتحولة جنسيا لعلاج الانحطاط العصبي الشبكي.

Abstract

يلعب الإجهاد التأكسدي دورا حاسما في العديد من الأمراض التنكسية ، بما في ذلك الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو مرض يصيب حوالي 30 مليون مريض في جميع أنحاء العالم. وهو يؤدي إلى انخفاض في ظهارة صبغ الشبكية (RPE) توليفها العوامل العصبية، على سبيل المثال، عامل مشتق من ظهارة الصباغ (PEDF) وعامل تحفيز مستعمرة الحبيبية الضامة (GM-CSF)، تليها فقدان خلايا RPE، وفي نهاية المطاف مستقبلات ضوئية وخلية العقدة الشبكية (RGC) الموت. نحن نفترض أن إعادة تشكيل بيئة الشبكية العصبية والعصبية من خلال زرع تحت الشبكية لخلايا RPE المصابة التي تفرط في التعبير عن PEDF و GM-CSF لديه القدرة على منع انحطاط الشبكية من خلال التخفيف من آثار الإجهاد التأكسدي ، وتثبيط الالتهاب ، ودعم بقاء الخلية. باستخدام نظام الإرسال والاستقبال الجمال النائم (SB100X)وقد تم تحويل خلايا RPE الإنسان مع الجينات PEDF وجنرال موتورز-CSF وأظهرت التكامل الجيني مستقرة، والتعبير الجيني على المدى الطويل، وإفراز البروتين باستخدام qPCR، وصمة عار الغربية، ELISA، و immunofluorescence. لتأكيد وظائف وفعالية PEDF و GM-CSF التي تفرزها خلايا RPE المصابة ، قمنا بتطوير اختبار في المختبر لتحديد الحد من الإجهاد التأكسدي H2O2- الناجم عن خلايا RPE في الثقافة. تم تقييم حماية الخلايا من خلال تحليل مورفولوجيا الخلايا والكثافة ومستوى الجلوتاثيون داخل الخلايا والتعبير الجيني UCP2 وقابلية بقاء الخلية. وأظهر كل من خلايا RPE المصابة التي تزيد من التعبير عن PEDF و / أو GM-CSF والخلايا غير المصابة ولكن المعالجة مع PEDF و / أو GM-CSF (المتاحة تجاريا أو النقية من الخلايا المصابة) حماية كبيرة للخلايا المضادة للأكسدة مقارنة بالضوابط غير المعالجة. النموذج الحالي H2O2هو نهج بسيط وفعال لتقييم التأثير المضاد للأكسدة للعوامل التي قد تكون فعالة لعلاج AMD أو الأمراض العصبية المماثلة.

Introduction

النموذج الموصوف هنا، يقدم نهجا مفيدا لتقييم كفاءة العوامل الصيدلانية الحيوية للحد من الإجهاد التأكسدي في الخلايا. لقد استخدمنا النموذج للتحقيق في الآثار الوقائية ل PEDF و GM-CSF على الإجهاد التأكسدي H2O2- بوساطة على الخلايا الظهارية الصباغية الشبكية ، والتي تتعرض لمستويات عالية من O2، والضوء المرئي ، وداء البلعومية لأغشية الجزء الخارجي مستقبلات ضوئية ، مما يولد مستويات كبيرة من أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS)1، 2. وهي تعتبر مساهما رئيسيا في الإمراض من الضمور البقعي المرتبط بالعمر الوعائي (aAMD)3،4،5،6،7،8. الى جانب ذلك ، هناك انخفاض في العوامل العصبية المركبة RPE ، وتحديدا عامل الصباغ المشتقة من الظهارة (PEDF) ، وعوامل النمو الشبيهة بالإنسولين (IGFs) ، وعامل تحفيز مستعمرة الماكروفولسيتي الحبيبي (GM-CSF) مما يؤدي إلى خلل وفقدان خلايا RPE ، تليها خلية الشبكية والشبكية العقدية (RGC) وفاة3و4و5 . AMD هو مرض معقد ينتج عن التفاعل بين العوامل الأيضية والوظيفية والوراثية والبيئية4. عدم وجود علاجات لAMD هو السبب الرئيسي للعمى في المرضى الذين تزيد أعمارهم عن 60 سنة في البلدان الصناعية9،10. إعادة تشكيل بيئة الشبكية العصبية والعصبية المنشأ عن طريق زرع تحت الشبكية من خلايا RPE المعدلة وراثيا الإفراط في التعبير PEDF وجنرال موتورز-CSF لديه القدرة على منع انحطاط الشبكية عن طريق التخفيف من آثار الإجهاد التأكسدي, تثبيط التهاب ودعم بقاء الخلية11,12,13,14,15,16 . على الرغم من أن هناك العديد من المنهجيات لتسليم الجينات إلى الخلايا، اخترنا غير الفيروسية فرط النشاط الجمال النائم transposon نظام لتسليم PEDF والجنرال موتورز-CSF الجينات إلى خلايا RPE بسبب ملفها الشخصي السلامة، ودمج الجينات في جينوم الخلايا المضيفة، وميلها لدمج الجينات تسليمها في مواقع نشطة غير النسخ كما أظهرنا سابقا17، 18،19.

يمكن أن يسبب الإجهاد التأكسدي الخلوي في الخلايا المستزرعة في المختبر من قبل العديد من العوامل التأكسدية، بما في ذلك بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)،4-هيدروينونال (HNE)، tertbutylhydroperoxide (tBH)، وارتفاع التوترات الأكسجين، والضوء المرئي (الطيف الكامل أو الأشعة فوق البنفسجية)20،21. تتطلب التوترات العالية للأوكسجين والضوء معدات وظروف خاصة، مما يحد من إمكانية النقل إلى أنظمة أخرى. عوامل مثل H2O2، HNE ، و tBH تحفز تداخل الإجهاد التأكسدي التغيرات الجزيئية والخلوية. اخترنا H2O2 لاختبار النشاط المضاد للأكسدة من PEDF و GM-CSF لأنه مناسب وذي صلة بيولوجيا لأنه يتم إنتاجه من قبل خلايا RPE كأوكسجين تفاعلي وسيط أثناء مستقبلات ضوئية الجزء الخارجي phagocytosis22 ويوجد في الأنسجة العينية في الجسم الحي23. منذ أكسدة الجلوتاثيون قد تكون مسؤولة جزئيا عن إنتاج H2O2 في العين، قمنا بتحليل مستويات GSH / الجلوتاثيون في دراساتنا، والتي ترتبط H2O2-الناجم عن الإجهاد التأكسدي والقدرة التجديدية للخلايا21،22. تحليل مستويات الجلوتاثيون ذات صلة خاصة لأنه يشارك في آليات الحماية المضادة للأكسدة في العين24. يستخدم التعرض ل H2O2 بشكل متكرر كنموذج لفحص قابلية الإجهاد التأكسدي والنشاط المضاد للأكسدة لخلايا RPE1و25و26و27و28و29و30، بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يظهر أوجه تشابه مع تلف الإجهاد التأكسدي الناجم عن الضوء ، وهو مصدر "فسيولوجي" للإجهاد التأكسدي21.

لتقييم وظائف وفعالية العوامل العصبية، قمنا بتطوير نموذج في المختبر يسمح للتحليل بتحديد التأثير المضاد للأكسدة لعوامل النمو التي تعبر عنها الخلايا المعدلة وراثيا للتعبير المفرط عن PEDF و GM-CSF. هنا، نظهر أن خلايا RPE المصابة بجينات PEDF و GM-CSF أكثر مقاومة للآثار الضارة ل H2O2 من خلايا التحكم غير المصابة، كما يتضح من مورفولوجيا الخلية، والكثافة، والبقاء، ومستوى داخل الخلايا من الجلوتاثيون، والتعبير عن الجين UCP2، الذي رموز للبروتين الميتوكوندريا فك 2 التي ثبت للحد من أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS)31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافقت اللجنة الأخلاقية للبحوث الكانتونية (رقم 2016-01726) على إجراءات جمع العين البشرية واستخدامها.

1. عزل الخلية وظروف الثقافة

  1. خط الخلية ARPE-19 البشري
    1. الثقافة 5 × 105 خلايا ARPE-19، خط الخلية RPE الإنسان، في دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة / المغذيات خليط F-12 لحم الخنزير (DMEM / هام F-12) تكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 80 U/mL البنسلين، 80 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين، و2.5 ميكروغرام/مل أمفوتريسين B (متوسط كامل) عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 5٪ CO2 و95٪ هواء في قارورة T75 (لكثافة الخلايا الأخرى انظر الجدول 1).
    2. تغيير المتوسط ثلاث مرات في الأسبوع.
    3. مرة واحدة تزرع الخلايا إلى ما يقرب من 90٪ التقاء (تقييم نوعيا)، يستنشق المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x عقيمة.
    4. احتضان الخلايا مع حل EDTA 5٪ تريبسين-2٪ لمدة 7-10 دقيقة في 37 درجة مئوية (لمجلدات انظر الجدول 1). مراقبة انفصال بصريا.
    5. إيقاف المحاولة بإضافة وسيطة كاملة تحتوي على 10٪ FBS (لوحدات التخزين راجع الجدول 1).
    6. قم بإعادة إصابة الخلايا (انظر الخطوة 2. من البروتوكول) أو زراعة الخلايا بنسبة 1:10 (مرة واحدة في الأسبوع) أو البذور في لوحة 96 بئرا كما هو مفصل أدناه (انظر الخطوتين 3.3 و 3.4 من البروتوكول).
متوسط (مل)
المساحة (سم²) كثافة البذر لخلايا ARPE-19 (خلايا / بئر) تطبيق لثقافة الخلية لإيقاف التريبسين حجم التريبسين (مل)
قارورة T75 75 5,00,000 ARPE-19 نمو الخلايا 10 7 3
6 لوحة بئر 9.6 1,00,000 بذر خلايا ARPE-19 المصابة 3 1 0.5
24 لوحة بئر 2 50,000 بذر خلايا hRPE المصابة 1 0.8 0.2
96 لوحة بئر 0.32 5000 لتجارب الإجهاد التأكسدي مع الخلايا المصابة (الشكل 1) تجارب الإجهاد التأكسدي 0.2
3000 لتجارب الإجهاد التأكسدي مع الخلايا غير المصابة بالإضافة إلى البروتينات (الشكل 1)

الجدول 1: وحدات تخزين ثقافة الخلية. مجلدات الوسائط الموصى بها لوحات ثقافة الخلية وقوارير لثقافة ARPE-19 والخلايا RPE البشرية الأولية.

  1. خلايا RPE البشرية الأساسية
    1. عزل خلايا RPE البشرية الأولية كما وصفها Thumann et al.17, وخلايا الثقافة في المتوسط الكامل تكملها 20٪ FBS.
    2. تغيير المتوسط مرتين في الأسبوع. بمجرد وصول الخلايا إلى التقاء (رصد بصريا)، والحد من FBS إلى 1٪ لتجنب فرط النمو.
    3. إعادة إصابة الخلايا (انظر الخطوة 2 من البروتوكول)، أو البذور في لوحة 96 جيدا كما هو مفصل أدناه (انظر الخطوتين 3.3 و 3.4 من البروتوكول).
      ملاحظة: جمعت البيانات المعروضة هنا من ثقافة خلايا RPE التي تم الحصول عليها من عيون أربعة متبرعين بشريين. الجدول 2 تفاصيل التركيبة السكانية للمتبرعين من الليونز هدية البصر بنك العين (سانت بول، MN). تم تلقيح العينين 12.7 ± 5.7 ساعة (متوسط ± SD) بعد الحصول على موافقة مستنيرة وفقا لإعلان هلسنكي.
لا عمر جنس الموت إلى الحفظ (ساعات) الموت إلى العزلة حرث حرث رمز في الرسم البياني
(أيام) قبل العدوى (أيام) بعد العدوى (أيام)
2 80 M 20.7 8 140 36 Symbol 1
3 86 F 12.8 8 85 45 Symbol 2
4 86 F 8.5 5 26 133 Symbol 3
8 83 F 8.9 6 18 27 Symbol 4
دني 83.8 12.7 6.8 67.3 60.3
SD 2.9 5.7 1.5 57.0 49.1

الجدول 2: التركيبة السكانية للمتبرعين البشريين للخلايا الظهارية الصباغية الشبكية.

2. الكهرومبوريشن ARPE-19 والخلايا البشرية الأولية RPE

  1. جرب خلايا ARPE-19 أو خلايا RPE البشرية الأساسية كما هو موضح في الخطوات 1.1.3-1.1.5 من البروتوكول.
  2. إجراء عملية الصعق الكهربائي باستخدام مجموعة أجهزة التحويل المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
    1. وبالنسبة لإصابة خلايا ARPE-19، تشير إلى Johnen et al.32 و hRPE الأولي إلى الخميسوآخرين. باختصار، resuspend 1 × 105 ARPE-19 خلايا أو 5 × 104 خلايا hRPE الأولية في 11 ميكرولتر من R العازلة وإضافة 2 ميكرولتر من خليط البلازميد التي تحتوي على 0.03 ميكروغرام pSB100X نقل33 و 0.47 ميكروغرام pT2-CMV-PEDF-له أو pT2-CMV-GMCSF-جهاز الإرسال والاستقبال له (نسبة transposase:transposon 1:16). بالنسبة للخلايا المتحولة المزدوجة PEDF و GM-CSF، استخدم نسبة 1:16:16 (0.03 ميكروغرام pSB100X، 0.47 ميكروغرام pT2-CMV-PEDF-His، و0.47 ميكروغرام pT2-CMV-GMCSF-His). استخدم معلمات الكهربوين التالية: نبضتان 1,350 فولت ب 20 مللي ثانية (عرض النبض) لخلايا ARPE-19؛ نبضات 150 فولت ب 20 مللي ثانية (عرض النبض) لخلايا ARPE-19؛ نبضات 150 فولت(2005) لخلايا ARPE-19؛ نبضات 150 فولت(2005) لخلايا ARPE-19. نبضتان من 1100 فولت لمدة 20 مللي ثانية للخلايا الأولية.
  3. البذور 1 × 105 ARPE-19 أو 5 × 104 خلايا hRPE الأولية المصابة في 6-جيدا و 24-جيدا لوحات، على التوالي، في المتوسطة تكملها مع 10٪ FBS دون المضادات الحيوية أو مضادات المخدرات. إضافة البنسلين (80 U/mL)، الستربتومايسين (80 ميكروغرام/مل)، والأمفوتريسين B (2.5 ميكروغرام/مل) مع أول تبادل متوسط بعد 3 أيام من العدوى.
  4. تحديد نمو الخلايا عن طريق الرصد المجهري الأسبوعي للخلايا. يتم رصد كفاءة العدوى عن طريق تحليل التعبير الجيني عن طريق RT-PCR، وإفراز البروتين من قبل ELISA وWB (الأساليب الموضحة في المواد التكميلية).
    ملاحظة: يمكن تقييم كفاءة العدوى لأول مرة بمجرد وصول الخلايا إلى الالتقاء، أي عند ~7 أيام و4 أسابيع بعد العدوى لخلايا ARPE-19 وخلايا hRPE الأولية، على التوالي.
  5. خلايا البذور في لوحة 96 جيدا كما هو مفصل أدناه (انظر الخطوة 3.5 من البروتوكول).

3. تحريض الإجهاد التأكسدي (H2O2 العلاج) و neuroprotection (PEDF و / أو العلاج GM-CSF)

  1. إعداد المتوسطة مشروطة من الخلايا ARPE-19 المصابة
    1. استخدام ARPE-19 خلايا مصابة بالجينات PEDF، GM-CSF ، أو كليهما (انظر الخطوة 2 من البروتوكول) ؛ الخلايا الموروثة لمدة 28 يوما كما هو موضح في الخطوة 1.1 من البروتوكول.
    2. في 28 يوما بعد العدوى، حاول تثقيب الخلايا (انظر الخطوات 1.1.3-1.1.5 من البروتوكول)، عد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور34،35،والبذور 5 × 105 خلايا في قوارير T75 في وسط كامل كما هو موضح في الخطوة 1.1.1 من البروتوكول. تبادل المتوسطة عندما ثقافة الخلية هو التقاء 80٪ تقريبا (تقريبا بعد 1 أسبوع؛ التحقق نوعيا). جمع المتوسطة بعد 24 ساعة.
    3. تخزين المتوسطة في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: تم التحقق من تركيز كاف من PEDF المؤتلف وGM-CSF في الوسط المكيف من قبل البنك الدولي وتم قياسه كميا من قبل ELISA كما هو موضح في المواد التكميلية.
  2. تنقية PEDF و GM-CSF من المتوسطة المكيفة من خلايا ARPE-19 المصابة
    1. الطرد المركزي الوسط الذي تم جمعه من الخطوة 3.1.2 عند 10000 × غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    2. استخدم التدفق الفائق Ni-NTA (انظر جدول المواد)وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة لتنقية البروتينات الموسومة به كما هو موضح أدناه.
      1. ماصة 30 ميكرولتر من خليط Ni-NTA في أنبوب 1.5 مل وطارد مركزي في 2600 × غرام لمدة 30 ثانية والتخلص من التدفق من خلال. غسل بيليه مرتين مع 200 ميكرولتر من العازلة حضانة 1x.
      2. جهاز الطرد المركزي في 2600 س غ لمدة 30 s والتخلص من تدفق من خلال. إضافة 40 ميكرولتر من العازلة حضانة 4x وإعادة الإنفاق.
      3. إضافة 900 ميكرولتر من المتوسطة المكيفة الطرد المركزي واحتضان في 70 دورة في الدقيقة (شاكر المداري) لمدة 1 ساعة في RT. الطرد المركزي في 2600 × غرام لمدة 1 دقيقة والتخلص من التدفق من خلال.
      4. غسل بيليه مرتين مع 175 ميكرولتر من العازلة الحضانة 1x. جهاز الطرد المركزي في 2600 س غ لمدة 30 s والتخلص من تدفق من خلال.
      5. لeute له الموسومة PEDF وجنرال موتورز - CSF البروتينات ، إضافة 20 ميكروغرام من العازلة Elution واحتضان في 70 دورة في الدقيقة (شاكر المدارية) لمدة 20 دقيقة في RT. الطرد المركزي في 2600 × ز لمدة 30 ثانية. الحفاظ على supernatant التي تحتوي على PEDF المؤتلف أو GM-CSF.
    3. قياس إجمالي البروتين باستخدام مجموعة اختبار البروتين BCA المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    4. تخزين محلول البروتين في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت للحضانة (4x) على 200 mM NaH2PO4و 1.2 M NaCl و 40 mM Imidazol؛ يحتوي المخزن المؤقت Elution على 50 mM NaH2PO4و 300 mM NaCl و 250 mM Imidazol.
  3. علاج الخلايا غير المصابة ARPE-19/primary hRPE مع المتوسطة مشروطة بالإضافة إلى H2O2 (الشكل 1A)
    1. البذور 3000 ARPE-19 غير المصابة (من الخطوة 1.1.6 من البروتوكول) أو hRPE الأولية (من الخطوة 1.2.3 من البروتوكول) الخلايا لكل بئر في لوحة 96 جيدا والثقافة في 200 ميكروغرام من المتوسطة مكيفة من الخلايا ARPE-19 المصابة.
    2. زراعة الخلايا لمدة 10 أيام عند 37 درجة مئوية في جو رطب من 5٪ CO2 و 95٪ الهواء. تغيير المتوسطة مشروطة كل يوم. تعريض الخلايا إلى 350 ميكرومتر H2O2 لمدة 24 ساعة.
    3. تقييم أضرار الإجهاد التأكسدي وتحديد التأثير المضاد للأكسدة من PEDF و GM-CSF عن طريق تحديد كمي لمستويات الجلوتاثيون (انظر الخطوة 4.1 من البروتوكول)، المجهر (انظر الخطوة 4.2 من البروتوكول)، وتقيس السمية الخلوية (انظر الخطوة 4.2 من البروتوكول).
      ملاحظة: مدة التجربة 12 يوما. وتستخدم لوحات واضحة مسطحة أسفل microwell لتقييم التلألؤ وكذلك مورفولوجيا الخلية. لإجراء السمية الخلوية و المقايسة الجلوتاثيون في نفس الوقت، يجب أن تكون بذر صفيحتين مع الخلايا في نفس اليوم.
  4. علاج الخلايا غير المصابة ARPE-19/primary hRPE مع PEDF وعوامل النمو GM-CSF بالإضافة إلى H2O2 (الشكل 1B)
    1. البذور 3000 ARPE-19 غير المصابة (من الخطوة 1.1.6 من البروتوكول) أو hRPE الأولية (من الخطوة 1.2.3 من البروتوكول) خلايا لكل بئر (لوحات 96 بئر مع أسفل مسطحة واضحة) في 200 ميكرولتر من متوسطة الثقافة الكاملة التي تحتوي على 500 نانوغرام /مل PEDF المؤتلف و / أو 50 نانوغرام / مل المؤتلف GM-CSF، وتنقيتها من وسط خلايا ARPE-19 المصابة أو المتاحة تجاريا. خلايا زراعة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو رطب من 5٪ CO2 و 95٪ من الهواء. تجديد المتوسط بما في ذلك PEDF وعوامل النمو GM-CSF يوميا.
      ملاحظة: إضافة عوامل النمو جديدة إلى الوسيطة.
    2. بعد 48 ساعة من علاج الخلايا مع عوامل النمو، وإزالة المتوسط وإضافة وسيطة كاملة تحتوي على 350 ميكرومتر H2O2 بالإضافة إلى 500 نانوغرام / مل PEDF و / أو 50 نانوغرام / مل GM-CSF.
    3. تقييم أضرار الإجهاد التأكسدي وتحديد التأثير المضاد للأكسدة من PEDF و GM-CSF عن طريق تحديد كمي لمستويات الجلوتاثيون (انظر الخطوة 4.1 من البروتوكول)، المجهر (انظر الخطوة 4.2 من البروتوكول)، وتقيس السمية الخلوية (انظر الخطوة 4.2 من البروتوكول).
      ملاحظة: مدة التجربة هي 3 أيام.
  5. علاج الخلايا المضادة للإصابة ARPE-19/الأولية HRPE مع H2O2 (الشكل 1C)
    1. تحقق من التعبير الجيني الكافي وإفراز البروتين للخلايا المصابة من قبل البنك الدولي و ELISA كما هو موضح في المواد التكميلية.
    2. إزالة الوسيطة من الآبار التي تحتوي على الخلايا المصابة (انظر الخطوة 2 من البروتوكول).
    3. حاول تكبير الخلايا كما هو موضح في الخطوات 1.1.3-1.1.5 من البروتوكول. عد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور34،35.
    4. البذور 5000 الخلايا المصابة / جيدا في لوحة 96 جيدا في 200 ميكروغرام من المتوسطة كاملة. خلايا زراعة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو رطب من 5٪ CO2 و 95٪ من الهواء. بعد 24 ساعة، يعرض الخلايا إلى 350 ميكرومتر H2O2 لمدة 24 ساعة.
    5. تقييم تلف الإجهاد التأكسدي وتحديد التأثير المضاد للأكسدة من PEDF و GM-CSF عن طريق تحديد كمي لمستويات الجلوتاثيون (انظر الخطوة 4.1 من البروتوكول)، المجهر (انظر الخطوة 4.2 من البروتوكول)، فحص السمية الخلوية (انظر الخطوة 4.2 من البروتوكول)، وتحديد التعبير الجيني UCP2 (انظر الخطوة 4.3 من البروتوكول).
      ملاحظة: مدة التجربة يومين.

Figure 1
الشكل 1: الجداول الزمنية للH2O2 المقايسة في ثلاثة نهج تجريبية مختلفة. تم بذر 3000 خلية غير مصابة بالبروتينات المتوسطة /المؤتلفة أو 5000 خلية مصابة في 96 بئرا للعلاج باستخدام H2O2. لتحديد تأثير المتوسطة مشروطة، تم استزراع الخلايا في المتوسط 100٪ مثقف لمدة 10 أيام متتالية، وتغيير المتوسطة كل يوم. لتحديد تأثير عوامل النمو المؤتلفة، تم استزراع الخلايا بإضافة الكمية المناسبة من عوامل النمو كل يوم لمدة 3 أيام متتالية. لاحظ أن الخلايا غير المصابة تم زرعها في 3000 خلية لكل بئر لتجنب فرط النمو خلال فترة الثقافة الأطول مقارنة بالخلايا المصابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. تحليل مستوى الإجهاد التأكسدي والقدرة المضادة للأكسدة

  1. فحص الجلوتاثيون
    1. قياس مستويات الجلوتاثيون (GSH) باستخدام عدة المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لفترة وجيزة، وإعداد وحجم مناسب من مزيج كاشف 1x (100 ميكرولتر كاشف / جيدا): لوسيفيرين NT الركيزة وGlutathione S-Transferase المخفف 1:100 في رد فعل المخزن المؤقت.
      ملاحظة: يتطلب لوح 96-well 10 مل من مزيج الكاشف 1x، الذي يتم إعداده بإضافة 100 ميكرولتر من ركيزة لوسيفيرين-NT و100 ميكرولتر من الجلوتاثيون S-Transferase إلى 10 مل من حاجز التفاعل. إعداد مزيج 1x الكاشف مباشرة قبل الاستخدام. لا تخزن مزيج الكاشف المعد للاستخدام في المستقبل.
    2. إعداد كاشف الكشف عن لوسيفيرين عن طريق نقل زجاجة واحدة من العازلة إعادة تشكيل إلى كاشف الكشف لوسيفيرين lyophilized.
    3. إعداد منحنى قياسي باستخدام حل قياسي من الجلوتاثيون (GSH) (5 م م). تمييع محلول GSH 5 mM 1:100 مع dH2O (أضف 10 ميكرولتر من محلول GSH 5 mM إلى 990 ميكرولتر من dH2O). تنفيذ 7 المسلسل 1:1 التخفيف في 500 ميكرولتر من dH2O. نقل 10 ميكرولتر من كل معيار المخفف إلى بئر المناسبة في التكرار.
      ملاحظة: سيتراوح التركيز النهائي للجلوتاثيون من 0.039 ميكرومتر إلى 5 ميكرومتر.
    4. إعداد فارغة (1x مزيج الكاشف) ونقل 10 ميكرولتر (التكرارات) إلى الآبار المناسبة.
    5. إزالة H2O2-تعامل الخلايا من الحاضنة.
      ملاحظة: توثيق مورفولوجيا H2O2-تعامل الخلايا بواسطة المجهر برايتفيلد (40x).
      عندما تتأكسد الخلايا، فإنها تبدو أكثر تقريبا وأقل انتشارا.
    6. يستنشق بعناية وسط الثقافة. إضافة 100 ميكرولتر من مزيج الكاشف 1x المعدة إلى كل بئر. خلط الخلايا مع الكاشف لمدة 15 ثانية في 500 دورة في الدقيقة على شاكر المدارية.
    7. احتضان لوحة في RT لمدة 30 دقيقة. إضافة 100 ميكرولتر من الكاشف الكشف لوسيفيرين المعاد تشكيلها إلى كل بئر.
    8. مزيج الحل لمدة 15 ثانية في 500 دورة في الدقيقة على شاكر المداري. احتضان لوحة لمدة 15 دقيقة في RT.
    9. تحديد التلألؤ باستخدام قارئ لوحة باستخدام برنامج مثبت مسبقا ADP-Glo.
      ملاحظة: ضع اللوحة داخل قارئ اللوحة بدون الغطاء.
      1. انقر على تغيير تخطيط واختيار الإعدادات التالية في المعلمات الأساسية: Costar 96-لوحة جيدا; أعلى البصرية؛ تأخير تحديد المواقع: 0.1؛ وقت بدء القياس: 0.0; زمن الفاصل الزمني للقياس: 1.0؛ الوقت لتطبيع النتائج: 0.0; يتم ضبط الربح تلقائيا من قبل الجهاز. تعريف الفراغات والمعايير والعينات. انقر على قياس البدء.
      2. تصدير البيانات كملف Excel. حساب تركيز GSH في كل عينة عن طريق الاستيفاء من منحنى القياسية.
  2. فحص السمية الخلوية والتحليل المجهري
    1. يستنشق المتوسط من الخلايا وإضافة 100 ميكرولتر من المتوسطة كاملة تحتوي على 1٪ FBS إلى كل بئر. أعد الخلايا إلى الحاضنة.
      ملاحظة: يستخدم 1٪ FBS لأن نسب أعلى من FBS يمكن أن تتداخل مع قياس التلألؤ، وبالتالي يتم استخدام 1٪ FBS في هذه الحالة.
    2. قياس صلاحية الخلية باستخدام مجموعة القياسات السمية الخلوية المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد)اتباع تعليمات الشركة المصنعة. باختصار، قم بإعداد مزيج الكاشف إضافة المخزن المؤقت المقايسة إلى الركيزة lyophilized. إعداد الكاشف Lysis بإضافة 33 ميكرولتر Digitonin إلى 5 مل من المخزن المؤقت Assay (لوحة واحدة 96 جيدا). تخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا لضمان التجانس.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، استخدم مزيج الكاشف الطازج. يمكن تخزين الاستخدام في غضون 12 ساعة إذا تم تخزينه في مزيج RT. الكاشف عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام ويمكن تخزينه في الأسعار أحادية الاستخدام لمدة تصل إلى 4 أشهر عند -70 درجة مئوية. يجب تجنب التجميد والذوبان. يمكن تخزين كاشف التحلل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام.
    3. إعداد منحنى قياسي مع خلايا ARPE-19 غير المعالجة.
      1. جرب الخلايا كما هو موضح في الخطوات 1.1.3-1.1.5 من البروتوكول واحص الخلايا باستخدام غرفة نيوباور34،35. الطرد المركزي الخلايا في 120 غرام لمدة 10 دقيقة في RT. أسبيرات الناموست وإعادة إنفاق بيليه الخلية في المتوسط DMEM / هام F12 تحتوي على 1٪ FBS إلى تركيز نهائي من 1 × 105 خلايا / مل.
      2. إعداد 7 المسلسل 1:1 التخفيف في 200 μL المتوسطة التي تحتوي على 1٪ FBS. نقل 100 ميكرولتر من كل معيار إلى الآبار المناسبة (التكرارات). إضافة 50 ميكرولتر من مزيج الكاشف لجميع الآبار.
    4. خلط الخلايا مع الكاشف لمدة 15 ثانية في 500 دورة في الدقيقة على شاكر المدارية. احتضان لوحة لمدة 15 دقيقة في RT. قياس التلألؤ باستخدام قارئ لوحة كما هو موضح في الخطوة 4.1.9 من البروتوكول. أضف 50 ميكرولتر من كاشف التحلل واحتضن لمدة 15 دقيقة. قياس التلألؤ باستخدام قارئ لوحة كما هو موضح في الخطوة 4.1.9 من البروتوكول.
    5. حساب النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة: (100 - ٪ الخلايا الميتة) والنسبة المئوية للخلايا الميتة = [قياس التلألؤ الأول ((الخلايا الميتة في العينة)/ قياس التلألؤ الثاني (جميع الخلايا الميتة بعد علاج digitonin)] × 100.
  3. تحليل التعبير UCP2 بواسطة RT-qPCR
    1. حاول تحليل الخلايا المصابة كما هو موضح أعلاه (الخطوات 1.1.3-1.1.5 من البروتوكول).
    2. عد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور34،35.
    3. البذور 5000 الخلايا ARPE-19 المصابة / جيدا في لوحات 96 بئرا.
    4. بعد 24 ساعة من الثقافة، علاج الخلايا مع 350 μM H2O2 لمدة 24 ساعة.
    5. عزل إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام عدة تجارية لعزل الحمض النووي الريبي من عدد قليل من الخلايا (انظر جدول المواد)بعد تعليمات الشركة المصنعة.
    6. أداء في الوقت الحقيقي PCR الكمية (RT-qPCR) كما هو موضح في المواد التكميلية. باختصار، توليد cDNA عن طريق retrotranscription باستخدام مزيج المتاحة تجاريا تحتوي على نسخة M-MLV عكس الأمثل (انظر جدول المواد).
    7. بالنسبة ل qPCR استخدم كوكتيل رد فعل جاهز للاستخدام يحتوي على جميع المكونات (بما في ذلك SYBR Green) باستثناء التهيئة (انظر الجدول S1 من المواد التكميلية)وقالب الحمض النووي. استخدم شروط الدوران الحراري التالية: التشبع الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، و40 دورة مع التشبع عند 95 درجة مئوية لمدة 15 درجة مئوية، والتعيين عند 60 درجة مئوية لمدة 30 درجة مئوية، والإطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 32 s.
    8. استخدم طريقة 2^(-ΔΔCT) للتحليل36.
  4. إعداد lysate الخلية لتحليل SDS-PAGE و البنك الدولي من pAkt (Ser473)
    1. البذور 3 × 105 GM-CSF-transfected ARPE-19 الخلايا / جيدا في لوحات 6 آبار (≥21 يوما بعد العدوى) لتحديد ما إذا كان GM-CSF يحمي خلايا RPE من التلف من قبل H2O2 من خلال تفعيل مسار البقاء على قيد الحياة Akt15.
    2. بعد 24 ساعة من خلايا الثقافة تتعرض ل350 ميكرومتر H2O2 لمدة 24 ساعة.
    3. مزيج 1 مل من العازلة RIPA مع 10 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات الفوسفاتاز بروتياز، 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA، و 25 ميكرولتر من 8 M يوريا (وحدات التخزين المستخدمة لولع واحد).
    4. يستنشق بعناية المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x.
    5. إضافة وحدة التخزين الكاملة من RIPA المخزن المؤقت المزيج إلى الخلايا.
    6. ماصة صعودا وهبوطا.
    7. جمع lysate في أنابيب 1.5 مل.
    8. جهاز طرد مركزي عند 20,000 x g لمدة 30 دقيقة عند 4°C.
    9. نقل supernatant إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
    10. تحديد مستويات pAkt في 15 ميكرولتر من lysate الخلية غير مخففة من قبل البنك الدولي كما هو موضح في المواد التكميلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحريض الإجهاد التأكسدي في الخلايا الظهارية صبغ الشبكية البشرية
تم التعامل مع ARPE-19 وخلايا hRPE الأولية بتركيزات متفاوتة من H2O2 لمدة 24 ساعة وتم قياس مستوى الجلوتاثيون المضاد للأكسدة داخل الخلايا كميا(الشكل 2A،B). H2O2 في 50 ميكرومتر و 100 ميكرومتر لم يؤثر على إنتاج الجلوتاثيون، في حين كان هناك انخفاض كبير في الجلوتاثيون في ARPE-19 والخلايا HRPE الأولية عند 350 ميكرومتر. أظهر تحليل السمية الخلوية أن 350 ميكرومتر هو أقل تركيز H2O2 الذي يسبب انخفاضا كبيرا في صلاحية الخلية(الشكل 2C). الشكلي, ARPE-19 الخلايا تعامل مع H2O2 تظهر أقل انتشار وأكثر تقريب, الخصائص التي تصبح أكثر وضوحا مع زيادة H2O2 تركيز (الشكل 3). وكان التأثير أقل بروزا بالنسبة للخلايا المصابة ب PEDF و GM-CSF المعالجة ب H2O2 (الشكل 3). لإثبات تأثير رقم الخلية على H2O2- بوساطة الإجهاد التأكسدي ، تم زرع 5000 و 10000 خلية ARPE-19 لكل بئر في لوحة بيضاء من 96 بئرا ؛ في اليوم التالي، عولجت الخلايا مع 350 ميكرومتر H2O2 لمدة 24 ساعة وتم تحديد مستويات الجلوتاثيون. ويبين الشكل 4 أن مستوى الجلوتاثيون انخفض فقط في الآبار (ن = 3) المصنفة ب 5000 خلية. للتجارب لتحديد تأثير المواد المضادة للاكسدة من H2O2-ولدتROS, فمن الضروري النظر في عدد من الخلايا; للبروتوكول المحدد المقدم في هذا التقرير 3000-5000 خلية / بئر (96 لوحة بئر) تعامل لمدة 24 ساعة مع 350 ميكرومتر H2O2 مناسبة لإظهار تلف كبير في الخلية مع الاحتفاظ بالقدرة على استعادة محاكاة استجابة شبه حادة لتلف الخلايا الناجم عن الإجهاد التأكسدي.

Figure 2
الشكل 2:مستوى الإجهاد التأكسدي كما يتضح مستوى الجلوتاثيون وقابلية الخلية، في خلايا RPE البشرية تعامل مع H2O2. (A) ARPE-19 الخلايا المعرضة لتركيزات عدة من H2O2 أظهرت انخفاضا كبيرا مستويات الجلوتاثيون (بين قوسين) في 350 ميكرومتر (0.6 6 ميكرومتر) و500 ميكرومتر (0.022 ميكرومتر) و700 ميكرومتر (0.002 ميكرومتر) مقارنة بالخلايا غير المعالجة H2O2(2.9 ميكرومتر) (p < 0.0001 ل 350، 500، و700 ميكرومتر H2O2). (ب) أظهرت خلايا RPE البشرية الأولية انخفاض مستويات الجلوتاثيون. ومع ذلك، كان التأثير أقل بروزا من ARPE-19 ولكن لا يزال مهما إحصائيا مقارنة بالضوابط عند 350 و500 و700 ميكرومتر H2O2. 350 ميكرومتر كان أدنى تركيز H2O2 الذي أنتج تلفا مؤأكسديا كبيرا كما هو مبين في انخفاض مستويات الجلوتاثيون مقارنة بخلايا التحكم غير المعالجة (p = 0.0022). انخفضت مستويات الجلوتاثيون معزيادةتركيزات H 2 O2 (500 ميكرومتر: p = 0.022؛ 700 ميكرومتر: p = 0.0005). (ج)أظهر تحليل السمية الخلوية أن 350 ميكرومتر H2O2 كان أقل تركيز ينتج عنه انخفاض كبير في النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة (p < 0.0001 ل 350 و 500 و 700 ميكرومتر). يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± SD (n = 3 تكرارات) ويشار إلى اختلافات كبيرة مع (*)؛ تم إجراء حسابات ما بعد مخصصة من ANOVA باستخدام اختبار المقارنات المتعددة توكي مقارنة C- مع H2O2-مجموعات العلاج. C-: H2O2 الخلايا غير المعالجة. وقد تم تعديل هذا الرقم من باسكواس وآخرون37. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:مورفولوجيا الخلايا غير المصابة وPEDF- أو GM-CSF-المصابة ARPE-19 تعامل مع H2O2. تظهر الخلايا المعالجة بتركيزات متزايدة من H2O2 خلايا أقل في آبار الثقافة وتعرض مورفولوجيا أكثر استدارة وأقل انتشارا ، وهي علامة معروفة على الإجهاد الخلوي. لاحظ أنه بالنسبة للخلايا المصابة ب PEDF- أو GM-CSF - ، يكون الإجهاد الخلوي أقل بروزا وينمو على غرار خلايا التحكم غير المعالجة. C-: خلايا التحكم غير المعالجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تأثير عدد الخلايا على تأثير H2O2-الناجم عن الإجهاد التأكسدي. تم زرع 5000 و 10000 خلية ARPE-19 / جيدا في لوحات 96 بئرا. بعد 24 ساعة، عولجت الخلايا ب 350 ميكرومتر H2O2 لمدة 24 ساعة. لوحظت اختلافات كبيرة في مستويات الجلوتاثيون في الآبار المصنفة ب 5000 خلية (p = 0.031، t-test) ولكن ليس في الآبار المصنفة ب 10000 خلية. C-: الخلايا غير المعالجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحليل التأثير المضاد للأكسدة من PEDF وجنرال موتورز-CSF تسليمها SB100X-الخلايا RPE الإنسان المصاب في ظروف الإجهاد التأكسدي
كضوابط إيجابية، تم علاج ARPE-19 وخلايا RPE البشرية الأولية مع 5 أو 50 أو 500 نانوغرام / مل متاحة تجاريا PEDF أو GM-CSF لمدة يومين قبل وأثناء العلاج 24 ساعة H2O2. ARPE-19 الخلايا المعالجة مع 500 نانوغرام / مل PEDF أو 50 نانوغرام / مل جنرال موتورز-CSF أنتجت الجلوتاثيون أكثر بكثير بالمقارنة مع الضوابط غير المعالجة في ظل ظروف الأكسدة (H2O2-treated) (الشكل 5A); وأظهرت PEDF مماثلة وجنرال موتورز-CSF تنقيتها من وسائل الإعلام الثقافية من الخلايا ARPE-19 المصابة تأثير مماثل(الشكل 5B). في خلايا hRPE الأساسية، إضافة 500 نانوغرام/مل PEDF، 50 نانوغرام/مل GM-CSF، أو 500 نانوغرام/مل PEDF زائد 50 نانوغرام/مل GM-CSF سواء كانت تجارية أو منقية من الوسائط المكيفة بواسطة PEDF- أو GM-CSF الخلايا المصابة ARPE-19 خفضت تلف الخلايا كما ينعكس من خلال زيادة كبيرة في مستويات الجلوتاثيون(الشكل 5C). كما أظهرت خلايا hRPE الأولية المعالجة لمدة 10 أيام مع متوسطة مشروطة من خلايا ARPE-19 المصابة مستويات غلوتاثيون أعلى مقارنة بخلايا التحكم(الشكل 5D). وبناء على هذه النتائج، أجريت تجارب أخرى مع 500 نانوغرام/مل ل PEDF و50 نانوغرام/مل ل GM-CSF.

تم تحويل خلايا ARPE-19 وhRPE الأولية مع ترميز الجينات ل PEDF و / أو GM-CSF باستخدام نظام الإرسال والاستقبال الجمال النائم جنبا إلى جنب مع الكهربية. بعد العدوى وتحليل التعبير الجيني من قبل RT-qPCR، البنك الدولي، ELISA، والكيمياء المناعية (انظر المواد التكميلية، الشكل S1، والشكل S2)،أظهرت الخلايا المصابة ARPE-19 المعرضة ل350 ميكرومتر H2O2 لمدة 24 ساعة مستويات غلوتاثيون أعلى بكثير من الخلايا غير المصابة H2O2-المعالجة (الشكل 6A ). بالنسبة لخلايا hRPE الأولية، هناك زيادة كبيرة في مستويات الجلوتاثيون في الخلايا المصابة ب PEDF مقارنة بالخلايا غير المصابة المعالجة ب H2O2 عندما تم تضمين جميع المتبرعين في التحليل. وعلاوة على ذلك، تظهر الجهات المانحة 2 و 3 زيادة كبيرة في مستويات الجلوتاثيون لجميع المجموعات المصابة (PEDF، GM-CSF، PEDF، و GM-CSF) (البيانات غير مبينة).

أكملت دراسة التعبير الجيني UCP2 التحليل عن طريق فحص الإجهاد التأكسدي الميتوكوندريا. وأجريت سلسلة إثبات المفهوم في خلايا ARPE-19 المصابة التي عولجت ب 350 ميكرومتر H2O2 لمدة 24 ساعة. كما هو مبين في الشكل 7، في الخلايا ARPE-19 المصابة ، يتم زيادة مستويات التعبير الجيني UCP2 بعد العلاج H2O2 ولكن الزيادة ليست ذات دلالة إحصائية. الشكل 8 يظهر البنك الدولي من Akt الفوسفوري (pAkt) من lysate من الخلايا المعدلة وراثيا CSF-المصابة تتعرض لH2O2; البيانات العادية يظهر سوى انخفاض صغير مقارنة مع السيطرة غير المعالجة، مما يدل على أن GM-CSF يمكن حماية الخلايا من تلف الإجهاد التأكسدي.

Figure 5
الشكل 5:مستوى الجلوتاثيون كعلامة على القدرة المضادة للأكسدة من PEDF وجنرال موتورز-CSF. (أ) علاج خلايا ARPE-19 مع 500 نانوغرام/مل PEDF أو 50 نانوغرام/مل GM-CSF لمدة 3 أيام قبل وأثناء 24 ساعة H2O2 التعرض زيادة مستوى الجلوتاثيون من 0.83 ميكرومتر (C) إلى 1.83 ميكرومتر (PEDF) و 1.3 ميكرومتر (GM-CSF)، p = 0.026 و p = 0.031، على التوالي. في تركيز 5 نانوغرام / مل لوحظت أي زيادة في الجلوتاثيون; الفرق في مستوى الجلوتاثيون بين 50 و 500 نانوغرام / مل لم يكن كبيرا بالنسبة لPEDF أو GM-CSF. (ب)PEDF (500 نانوغرام/مل) وGM-CSF (50 نانوغرام/مل) التي تم تنقيتها من الوسائط المكيفة لخلايا ARPE-19 المصابة أظهرت تأثيرا مشابها ل PEDF أو GM-CSF (p = 0.018، ANOVA). (ج) إضافة 500 نانوغرام/مل من PEDF، 50 نانوغرام/مل GM-CSF، أو 500 نانوغرام/مل PEDF زائد 50 نانوغرام/مل GM-CSF لمدة 3 أيام قبل وأثناء 24 ساعة H2O2 العلاج إلى وسيط الثقافة من خلايا hRPE الأولية زادت بشكل كبير من مستويات الجلوتاثيون في الخلايا المعالجة مع PEDF (2.6 ميكرومتر [تجاري]، 2.5 ميكرومتر [منقى])، GM-CSF (2.9 ميكرومتر [تجاري]، 3.3 ميكرومتر [منقى])، وPEDF زائد GM-CSF (3.0 ميكرومتر [تجاري]، 2.9 ميكرومتر [منقى]) مقارنة بالخلايا غير المعالجة (1.9 ميكرومتر) (p = 0.006، اختبار كروسكال واليس). (د)لوحظت زيادة كبيرة في مستويات الجلوتاثيون لخلايا hRPE المستزرعة لمدة 10 أيام في وسط مكيف من خلايا PEDF-، GM-CSF-، أو PEDF-GM-CSF-arPE-19 المصابة قبل معالجة الخلايا ب H2O2 (p = 0.003، اختبار كروسكال واليس) (أظهرت البيانات لمتبرع واحد). يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SD (n = 3 نسخ متماثلة). ويشار إلى اختلافات كبيرة مع (*)؛ وأجريت حسابات ما بعد مخصصة لتحليلات التباين عن طريق حساب اختبارات المقارنات المتعددة التي أجراها توكي أو دونيت التي تقارن "C" بالمجموعات المعالجة من قبل صندوق الخبراء المساعدين في مجال التغيرات في الأداء/الآلية العالمية-CSF. ج: الخلايا التي تعالج فقط مع H2O2، P: الخلايا المعالجة ب PEDF ، G: الخلايا المعالجة ب GM-CSF ، P + G: الخلايا المعالجة ب PEDF بالإضافة إلى GM-CSF. وقد تم تعديل هذا الرقم من باسكواس وآخرون37. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6:مستوى الجلوتاثيون كعلامة على القدرة المضادة للأكسدة لخلايا PEDF- و GM-CSF-transfected البشرية RPE. (أ)كانت مستويات الجلوتاثيون من الخلايا المضادة للإصابة من نوع ARPE-19 المعرضة ل 350 ميكرومتر H2O2 لمدة 24 ساعة (56 يوما بعد العدوى) أعلى بكثير مقارنة بالخلايا غير المصابة (1.9 ميكرومتر)، أي 3.0 ميكرومتر للخلايا المصابة ب PEDF و GM-CSF، و 3.4 ميكرومتر للخلايا المزدوجة المصابة (p = 0.0001، ANOVA). يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SD (n = 3 نسخ متماثلة). (ب) تظهر مؤامرة النقطة متوسط قيم الجلوتاثيون لأربعة مانحين مختلفين (C: 0.77 ميكرومتر؛ P: 1.45 ميكرومتر؛ G: 1.16 ميكرومتر; P+G: 1.2 ميكرومتر)، والذي يختلف بشكل كبير بين الخلايا غير المصابة والخلايا المتحولة PEDF (p = 0.028، تم إجراء حسابات ما بعد مخصصة من ANOVA باستخدام اختبارات المقارنات المتعددة التي أجرتها Tukey مقارنة "C" مع المجموعات المعالجة من PEDF/GM-CSF). عندما يتم تحليل المتبرعين بشكل منفصل، يظهر المانح N°2 و N°3 (انظر الجدول 2 للرمز في الرسم البياني) اختلافات كبيرة لجميع المجموعات المصابة مقارنة بالتحكم غير المصاب (لا تظهر الأهمية) المعالج ب H2O2. ج: الخلايا غير المصابة، P: خلايا PEDF-transfected، G: الخلايا المصابة بجنرال موتورز-CSF-transfected، P+G: PEDF-و GM-CSF-الخلايا المصابة. وقد تم تعديل هذا الرقم من باسكواس وآخرون37. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: التعبير الجيني UCP2 في الخلايا ARPE-19 المصابة المعالجة ب H2O2. منذ التعبير الجيني UCP2 يمكن استخدامها لفحص الضرر التأكسدي الميتوكوندريا، درسنا تأثير الإفراط في التعبير عن PEDF وجنرال موتورز-CSF من قبل خلايا ARPE-19 المصابة. الخلايا المصابة ARPE-19 تعامل مع H 2 O2، علىالرغممن أنها ليست ذات دلالة إحصائية ، إظهار زيادة التعبير الجيني UCP2 مقارنة مع التحكم غير المصابة مما يشير إلى الحد من الإجهاد التأكسدي، وكانت الزيادة أضعاف 1.57 لPEDF-، 1.51 لجنرال موتورز-CSF-، و 2.36 لPEDF- زائد GM-CSF-الخلايا المصابة مقارنة مع السيطرة غير المصابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: بقعة الغربية من Akt الفوسفوري (Ser473) من خلية lysate من الخلايا ARPE-19 المعدلة وراثيا-CSF-transfected. وأظهر البنك الدولي أن GM-CSF يعزز فوسفور Akt في كل من الثقافات المعالجة من نوع H2O2(UT: 3.32; ح2O2: 2.69). يتم تطبيع القيم إلى غير المصابة غير المصابة غير H2O2-تعامل الخلايا (C/ UT). C: غير المصابة, G: GM-CSF-الخلايا المصابة, UT: الخلايا غير المعالجة مع H2O2, H2O2: الخلايا المعالجة مع H2O2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول S1: تسلسلات أزواج التمهيدي ووقت/درجة الحرارة الصلبة المستخدمة في RT-qPCR. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول. 

الشكل S1: تحليل التعبير الجيني PEDF و GM-CSF في خلايا hRPE المصابة. وقد تحقق الجهاز RT-qPCR من أن خلايا hRPE الأولية المصابة أظهرت زيادة كبيرة في PEDF (p = 0.003، اختبار كروسكال واليس) و GM-CSF (p = 0.013، اختبار كروسكال واليس) التعبير الجيني مقارنة بالخلايا غير المصابة. 2^(-ΔΔCT) تم استخدام الأسلوب في هذه الحالة36. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SD (n = 4 مانحين). تمثل كل نقطة متوسط ثلاث نسخ متماثلة. وقد تم تعديل هذا الرقم من باسكواس وآخرون37. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل S2: إفراز البروتين في hRPE الأولية المصابة وARPE-19 الخلايا. (أ)أظهر القياس الكمي للبروتينات المفرزة بواسطة ELISA أن خلايا hRPE المصابة تفرز أكثر بكثير من PEDF و GM-CSF من الخلايا غير المصابة (p = 0.014 ل PEDF ، وp = 0.006 ل GM-CSF ، اختبار Kruskal-Wallis). وتقدم البيانات على أنها متوسط ± SD (ن = 4 مانحين). تمثل كل نقطة متوسط ثلاث نسخ متماثلة. (ب)أكدت تلطيخ مزدوج PEDF-GM-CSF على الإفراز المشترك ل PEDF و GM-CSF في خلايا ARPE-19 مزدوجة العدوى (الشكل المندمج). وقد تم تعديل هذا الرقم من باسكواس وآخرون37. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المواد التكميلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يقدم البروتوكول المعروض هنا نهجا لتحليل وظيفة مكافحة الأكسدة والحماية ل PEDF و GM-CSF التي تنتجها الخلايا المصابة ، والتي يمكن تطبيقها على الخلايا المصابة بأي جين مفيد مفترض. في الاستراتيجيات العلاجية الجينية التي تهدف إلى إيصال البروتينات إلى الأنسجة عن طريق زرع الخلايا المعدلة وراثيا، من الأهمية بمكان الحصول على معلومات حول مستوى التعبير عن البروتين، وطول عمر التعبير، وفعالية البروتين المعبر عنه في نموذج للمرض. في مختبرنا، كان البروتوكول المعروض هنا مفيدا لتحديد فعالية PEDF و GM-CSF على الإجهاد التأكسدي، والذي تم افتراضه كعنصر مهم في الإمراض من AAMD6،7. على وجه التحديد، استخدمنا البروتوكول لتحديد تأثير مضاد للأكسدة من SB100X-بوساطة PEDF/GM-CSF-الخلايا HRPE الأولية المصابة. وقد أظهرت العديد من المحققين أن H2O2 يحفز أعراض كبيرة من الإجهاد التأكسدي ولكن لا يزال يسمح تجديد الخلايا28,29,38, على غرار نتائج تجاربنا التي أظهرت أن 350 ميكرومتر لمدة 24 ساعة يحفز الإجهاد التأكسدي الفعال في الإنسان ARPE-19 والخلايا RPE الأولية التي يمكن استخدامها لتحليل التأثير الوقائي للPEDF وجنرال موتورز-CSF. H2O2 كعامل التأكسد وقد تم اختيار للدراسة بسبب وجودها الفسيولوجي في العين وآليات الدفاع المقابلة, على سبيل المثال, التمثيل الغذائي الجلوتاثيون20,21. وقد فحص مختبرنا نماذج أخرى من الإجهاد التأكسدي مثل علاج الخلايا مع TBH، الذي يبدأ البيروكسيد الدهون في وجود أيونات معدنية نشطة الأكسدة1؛ ومع ذلك، كان الإجهاد التأكسدي لا يكاد يذكر. في التجارب المعروضة هنا، عولجت الخلايا ب H2O2 لمدة 24 ساعة لأننا وجدنا أن أوقات العلاج الأقصر من 2-6 ساعة كافية لإحداث تغييرات في التعبير الجيني20،ولكن العواقب اللاحقة، على سبيل المثال، انتشار الخلايا، وقابلية الخلية، ومستويات الجلوتاثيون، قد لا تكون مرئية حتى الآن. خلاف ذلك ، فإن صغر حجم الآبار ، اللازمة للسمية الخلوية و المقايسات الجلوتاثيون ، يؤدي بسرعة إلى ثقافة التقاء جيدا . وهذا قد يؤدي إلى تثبيط الاتصال وإخفاء تأثير عامل الأكسدة. لذلك ، يبدو أن الحضانة الطويلة مع H2O 2 ليست مفيدة ، علىالرغم من أن الانحطاط الذي شوهد في aAMD سببه الإجهاد التأكسدي المزمن6،7.

وهناك قيود على التجارب المعروضة هنا هو أن عدد الخلايا المصنفة يؤثر على التأثير التأكسدي ل H2O2، أي لنفس العلاج H2O2 ، لوحظت اختلافات كبيرة في مستويات الجلوتاثيون بين H2O2- الخلايا المعالجة وغير المعالجة عندما لوحظت 5000 خلية ولكن ليس عندما تم زرع 10000 خلية (الشكل 4 ). يتطلب البروتوكول الذي نقدمه بذر عدد قليل من الخلايا، أي 3000 عندما يتم استزراع الخلايا لمدة 3 أيام و 5000 عندما يتم استزراع الخلايا لمدة يومين(الشكل 1). وثمة قيد آخر هو أن تركيز H2O2 ينضب مع مرور الوقت؛ وقد أظهرت Kaczara وآخرون39 استنفاد H2O2 على مدى ساعات قليلة في ثقافات الخلايا ARPE-19، مما يؤثر على تطوير نماذج الإجهاد التأكسدي المزمن. وقد اقترح هؤلاء المحققون طريقة بديلة لعلاج H2O2 المستدام ، على وجه التحديد توليد H2O2 باستمرار من الجلوكوز في الوسط باستخدام أوكسيداز الجلوكوز ، ولكن لا يمكن ضمان تركيز موحد من H2O2. من ناحية أخرى، فإن البروتوكول الذي أنشأناه مع تسليم العامل المؤاكس في نبضة واحدة، له ميزة كونه أسرع وأبسط لأداء مقارنة مع النماذج المزمنة التي H2O2 العلاج يجب أن تتكرر لعدة أيام38.

يتم تحديد قدرة الخلايا على مواجهة الضرر التأكسدي من خلال التوازن بين إنتاج ROS والقدرة على توليد مضادات الأكسدة. في الخلية، الجلوتاثيون تريببتيد (GSH) هو عامل الحد السائد، والتي يمكن أن تتأكسد إلى كبريتيد الجلوتاثيون (GSSG) وتجديدها عن طريق اختزال الجلوتاثيون باستخدام NADPH40. في الخلايا السليمة، أكثر من 90٪ من مجموع تجمع الجلوتاثيون موجود في شكل مخفض. عندما تتعرض الخلايا لمستوى متزايد من الإجهاد التأكسدي، يتراكم GSSG وتزيد نسبة GSSG إلى GSH. وبالتالي، فإن رصد حالة أكسدة الجلوتاثيون في العينات البيولوجية أمر ضروري لتقييم حالة إزالة السموم من الخلايا والأنسجة من الجذور الحرة المتولدة أثناء الإجهاد التأكسدي وإصابة الخلايا. البروتوكول المفصل هنا لتحديد كمي الجلوتاثيون حساس بما يكفي للكشف عن التأثير المضاد للأكسدة من PEDF و GM-CSF التي تعبر عنها خلايا RPE المعدلة وراثيا.

منذ الإجهاد التأكسدي يؤثر على أنشطة الميتوكوندريا40, ومن المثير للاهتمام بشكل خاص أن السيطرة على مستويات ROS من قبل PEDF يرتبط بتنظيم البروتين الميتوكوندريا فك 2 (UCP2), وPEDF يخفف من آثار الإجهاد التأكسدي عن طريق زيادة التعبير UCP211,41. الوظيفة الرئيسية لUCP2 هو السيطرة على ROS المستمدة من الميتوكوندريا وتعمل كمستشعر للإجهاد التأكسدي الميتوكوندريا41،42. هنا، بالإضافة إلى دراسة تأثير PEDF و GM-CSF على مستويات الجلوتاثيون، لدينا التعبير الجيني للUCP2 تميل إلى الزيادة (الشكل 7)؛ دراسات إضافية ضرورية لتحديد دور PEDF وGM-CSF على التعبير الجيني UCP2.

بشكل عام ، يقدم النموذج الحالي H2O2نهجا شاملا للتحقيق في التأثير المفيد للعلاجات الجينية المستندة إلى الإرسال والاستقبال التي تهدف إلى تقديم جينات علاجية مضادة للأكسدة إلى خلايا المريض لعلاج الأمراض العصبية مثل AMD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

ويود المؤلفان أن يشكرا غريغ سيلي وألان كونتي على المساعدة التقنية الممتازة والبروفيسور زوزسانا إزفاك من مركز ماكس دلبروك في برلين على التكرم بتوفير PSB100X و pT2-CAGGS-فينوس بلاميدز. وقد دعم هذا العمل كل من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم والمفوضية الأوروبية في سياق البرنامج الإطاري السابع. تم تمويل Z.I من قبل مجلس البحوث الأوروبي، ERC المتقدمة [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
  2. Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells. Antioxidants. 6 (4), (2017).
  3. Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. A Review of current and future management of geographic atrophy. Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).
  4. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: a review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  5. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  6. Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. Oxidative stress and reactive oxygen species. Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).
  7. Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
  8. Alhasani, R. H., et al. Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress. Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).
  9. National Institute of Health. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
  10. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  11. He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).
  12. Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence. Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).
  13. Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells. Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).
  14. Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. Retinal Degenerative Diseases. , Springer. 699-706 (2016).
  15. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death. Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).
  16. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins. Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).
  17. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  18. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  19. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. BioMed Research International. 2015, (2015).
  20. Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells. Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).
  21. Allen, R. G., Tresini, M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).
  22. Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).
  23. Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).
  24. Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor. Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).
  25. Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).
  26. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).
  27. Chen, X. -D., Su, M. -Y., Chen, T. -T., Hong, H. -Y., Han, A. -D., Li, W. -S. Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway. International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).
  28. Tu, G., et al. Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species. Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).
  29. Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating. Nutrients. 11, 1-13 (2019).
  30. Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells. Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).
  31. Ma, S., et al. Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress. American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).
  32. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  33. Mátés, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  34. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
  35. Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
  36. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method. Methods. 25 (4), San Diego, California. 402-408 (2001).
  37. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  38. Zhuge, C. C., et al. Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).
  39. Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).
  40. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).
  41. Wang, X., et al. PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression. Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).
  42. Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).

Tags

الطب، العدد 166، العلاج الجيني العيني، الضمور البقعي المرتبط بالعمر، تلف الإجهاد التأكسدي، جهاز الإرسال والاستقبال الجمال النائم، تسليم الجينات غير الفيروسية، خلايا RPE، PEDF، GM-CSF
تحريض وتحليل الإجهاد التأكسدي في <em>الجمال النائم</em> Transposon-Transfected الخلايا الظهارية صبغة الشبكية البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening,… More

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter