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Artículo de método

Modificación genética basada en electroporación de células epiteliales pigmentarias humanas primarias utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente

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DOI:

10.3791/61987

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4 de febrero de 2021

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1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

En este artículo

Resumen

Hemos desarrollado un protocolo para transfectar células epiteliales pigmentarias humanas primarias por electroporación con el gen que codifica el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente (SB). La transfección exitosa se demostró mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR), inmunotransferencia y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Resumen

Nuestra sociedad cada vez más envejecida conduce a una creciente incidencia de enfermedades neurodegenerativas. Hasta ahora, los mecanismos patológicos no se comprenden adecuadamente, lo que impide el establecimiento de tratamientos definidos. Las terapias génicas aditivas basadas en células para aumentar la expresión de un factor protector se consideran una opción prometedora para medicar enfermedades neurodegenerativas, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE). Hemos desarrollado un método para la expresión estable del gen que codifica el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF), que se caracteriza como una proteína neuroprotectora y antiangiogénica en el sistema nervioso, en el genoma de las células epiteliales pigmentarias humanas primarias (PE) utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente (SB). Las células primarias de PE se aislaron de los ojos de donantes humanos y se mantuvieron en cultivo. Después de alcanzar la confluencia, se suspendieron 1 x 104 células en 11 μL de tampón de resuspensión y se combinaron con 2 μL de una solución purificada que contenía 30 ng de plásmido transposasa SB (SB100X) hiperactivo y 470 ng de plásmido transposón PEDF. La modificación genética se realizó con un sistema de electroporación capilar utilizando los siguientes parámetros: dos pulsos con una tensión de 1.100 V y una anchura de 20 ms. Las células transfectadas se transfirieron a placas de cultivo que contenían medio suplementado con suero bovino fetal; Se agregaron antibióticos y antimicóticos con el primer intercambio medio. La transfección exitosa se demostró en experimentos realizados de forma independiente. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) mostró el aumento de la expresión del transgén PEDF. La secreción de PEDF se elevó significativamente y se mantuvo estable, según lo evaluado por inmunotransferencia y cuantificado por el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La transferencia mediada por SB100X permitió una integración estable del gen PEDF en el genoma de las células PE y aseguró la secreción continua de PEDF, que es fundamental para el desarrollo de una terapia de adición de genes basada en células para tratar la DMAE u otras enfermedades degenerativas de la retina. Además, el análisis del perfil de integración del transposón PEDF en células PE humanas indicó una distribución genómica casi aleatoria.

Introducción

La edad avanzada se describe como el principal riesgo de enfermedades neurodegenerativas. La degeneración macular asociada a la edad (DMAE), una enfermedad poligénica que conduce a una pérdida grave de la visión en pacientes mayores de 60 años, pertenece a las cuatro causas más comunes de ceguera y discapacidad visual1 y se espera que aumente a 288 millones de personas en 20402. Las disfunciones del epitelio pigmentario de la retina (EPR), una sola capa de células estrechamente empaquetadas ubicadas entre el coriocapilar y los fotorreceptores retinianos, contribuyen a la patogénesis de la DMAE. El EPR cumple múltiples tareas que son esenciales para una función normal de la retina3 y secreta una variedad de factores de crecimiento y factores esenciales para mantener la integridad estructural de la retina y el coriocapilar, apoyando así la supervivencia de los fotorreceptores y proporcionando una base para la circulación y el suministro de nutrientes.

En ojos sanos, el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) es responsable de equilibrar los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y protege a las neuronas contra la apoptosis, previene la proliferación de células endoteliales y estabiliza el endotelio capilar. El cambio de la relación VEGF-PEDF está relacionado con la neovascularización ocular, que se observó en modelos animales 4,5, así como en muestras de pacientes con neovascularización coroidea (NVC) por DMAE y retinopatía diabética proliferativa 6,7,8,9,10 . La concentración mejorada de VEGF es el objetivo del tratamiento estándar actual. Los fármacos anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept y, más recientemente, brolucizumab mejoran la agudeza visual en aproximadamente un tercio de los pacientes con NVC o más bien estabilizan la visión en el 90% de los casos11,12,13. Sin embargo, las inyecciones intravítreas frecuentes, a menudo mensuales, conllevan el riesgo de eventos adversos14, perjudican el cumplimiento del paciente y representan una carga económica significativa para los sistemas de salud15. Además, un cierto porcentaje de pacientes (2%-20%) no responden o sólo reaccionan mal a la terapia anti-VEGF16,17,18,19. Estos concomitantes negativos requieren el desarrollo de tratamientos alternativos, por ejemplo, implantes intraoculares, enfoques terapéuticos celulares y / o genéticos.

La terapia génica ha evolucionado como un tratamiento prometedor para enfermedades hereditarias y no hereditarias y tiene la intención de restaurar secuencias de genes no funcionales o suprimir las que funcionan mal. Para las enfermedades poligénicas, donde la identificación y el reemplazo de los factores causales es casi imposible, las estrategias apuntan a la administración continua de un factor protector. En el caso de la DMAE, se han desarrollado diversas terapias aditivas, como la expresión estable de endostatina y angiostatina 20, el antagonista del VEGF soluble fms-like tirosina quinasa-1 (sFLT-1)21,22, el grupo de proteínas reguladoras del complemento de diferenciación 59 (CD59)23 o PEDF 24,25 . El ojo, y especialmente la retina, es un excelente objetivo para un medicamento basado en genes debido a la estructura cerrada, la buena accesibilidad, el tamaño pequeño y el privilegio inmunológico, lo que permite una administración localizada de dosis terapéuticas bajas y hace que los trasplantes sean menos susceptibles al rechazo. Además, el ojo permite una monitorización no invasiva, y la retina puede ser examinada por diferentes técnicas de imagen.

Los vectores virales son, debido a su alta eficiencia de transducción, el principal vehículo para administrar genes terapéuticos en las células diana. Sin embargo, dependiendo del vector viral utilizado, se han descrito diferentes reacciones adversas, como respuestas inmunes e inflamatorias26, efectos mutagénicos y oncogénicos 27,28 o diseminación en otros tejidos29. Las limitaciones prácticas incluyen un tamaño de embalaje restringido30, así como dificultades y costos asociados con la producción de lotes de grado clínico31,32. Estos inconvenientes han promovido el desarrollo de vectores no virales basados en plásmidos que se transfieren a través de lipo / poliplexes, ultrasonido o electroporación. Sin embargo, la integración genómica del transgén en el genoma del huésped generalmente no se promueve con vectores plásmidos, lo que resulta en una expresión transitoria.

Los transposones son fragmentos de ADN naturales que cambian su posición dentro del genoma, una característica que se ha adoptado para la terapia génica. Debido a un mecanismo de integración activo, los sistemas vectoriales basados en transposones permiten una expresión continua y constante del transgén insertado. El transposón de la Bella Durmiente (SB), reconstituido a partir de un antiguo transposón de tipo Tc1/marinero encontrado en peces33 y mejorado aún más por la evolución molecular que resultó en la variante hiperactiva SB100X34, permitió la transposición eficiente en varias células primarias y fue utilizado para la corrección fenotípica en diferentes modelos de enfermedad35. En la actualidad, se han iniciado 13 ensayos clínicos utilizando el sistema de transposones SB . El sistema de transposones SB100X consta de dos componentes: el transposón, que comprende el gen de interés flanqueado por repeticiones invertidas terminales (TIR), y la transposasa, que moviliza el transposón. Después de la entrega de ADN plásmido a las células, la transposasa se une a los TIR y cataliza la escisión e integración del transposón en el genoma de la célula.

Hemos desarrollado una terapia aditiva basada en células no virales para el tratamiento de la DMAE neovascular. El enfoque comprende la inserción basada en electroporación del gen PEDF en células epiteliales pigmentarias primarias (PE) por medio del sistema de transposón SB100X 36,37,38. La información genética de la transposasa y el PEDF se proporciona en plásmidos separados, lo que permite el ajuste de la relación ideal de transposones SB100X a PEPF. La electroporación se realiza utilizando un sistema de transfección capilar basado en pipeta que se caracteriza por un tamaño de espacio maximizado entre los electrodos y minimiza su área de superficie. Se demostró que el dispositivo logra excelentes tasas de transfección en una amplia gama de células de mamíferos 39,40,41. La pequeña superficie del electrodo proporciona un campo eléctrico uniforme y reduce los diversos efectos secundarios de la electrólisis42.

La funcionalidad antiangiogénica del PEDF secretado por células epiteliales pigmentarias transfectadas fue demostrada en varios experimentos in vitro que analizaron la brotación, migración y apoptosis de células endoteliales de la vena umbilical humana43. Además, el trasplante de células transfectadas con PEDF en un modelo de conejo de neovascularización corneal44, así como un modelo de rata de CNV43,45,46 mostraron disminución de la neovascularización.

Aquí, describimos un protocolo detallado para la inserción estable del gen PEDF en células RPE humanas primarias a través del sistema de transposón SB100X utilizando un sistema de transfección capilar. Las células transfectadas se mantuvieron en cultivo durante 21 días y posteriormente se analizaron en términos de expresión génica PEDF por reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR) y en términos de secreción de proteína PEDF por inmunotransferencia y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, Figura 1).

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Protocolo

Los ojos de donantes humanos se obtuvieron del Banco de Córnea de Aquisgrán del Departamento de Oftalmología (Hospital Universitario RWTH Aachen) después de obtener el consentimiento informado de acuerdo con los protocolos de la Declaración de Helsinki. Los procedimientos para la recolección y uso de muestras humanas han sido aprobados por el comité de ética institucional.

1. Aislamiento de células RPE humanas primarias

  1. Coloque ropa protectora estéril y guantes. Coloque una cortina estéril debajo de un flujo laminar.
  2. Coloque instrumentos de preparación estériles y otros equipos estériles necesarios debajo del flujo laminar.
  3. Registre la recepción de los globos oculares, el comienzo de la preparación y las posibles anomalías. Registre la edad del donante, el sexo, la causa de muerte y el período entre el momento de la muerte y la extracción del ojo.
  4. Coloque el globo ocular en una compresa de gasa estéril y sosténgalo con una mano.
  5. Separe el segmento anterior del segmento posterior mediante un corte circunferencial de aproximadamente 3,5 mm posterior al limbo con un bisturí y una tijera de ojo puntiaguda extra fina.
  6. Después de inclinar el segmento posterior hacia abajo, retire cuidadosamente el vítreo y la retina con pinzas colibrí.
  7. Reorganice discretamente el complejo RPE/coroidea colapsado utilizando pinzas rectas de iris y, posteriormente, manténgalo en posición con pinzas de iris curvas.
  8. Llene la copa ocular posterior con 1 ml de la mezcla de nutrientes Modified Eagle's Medium/Ham's F-12 de Dulbecco (DMEM/F12) suplementada con 10% de suero bovino fetal (FBS), 80 U/ml de penicilina y 80 μg/ml de estreptomicina (Pen/Strep), y 2.5 μg/ml de anfotericina B (AmphoB).
    NOTA: Contrariamente al aislamiento de las células primarias del EPR de los ojos de cerdo o bovino36,37, la copa ocular posterior no tiene que ser llenada e incubada con tripsina.
  9. Recolecte las células del EPR cepillando suavemente el epitelio pigmentario de la retina desde el nervio óptico hacia el limbo con una pipeta Pasteur de vidrio curvo pulido al fuego, mientras fija el complejo EPR / choroidea en el limbo usando pinzas colibrí. Transfiera la suspensión celular a una placa de Petri.
  10. Repita los pasos 1.8 y 1.9 y recoja todas las celdas de la placa de Petri. Resuspenda la suspensión celular con cuidado pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de un solo canal (100-1.000 μL).
  11. Siembre la suspensión celular del EPR de cada globo ocular en tres pocillos de una placa de cultivo celular de 24 pocillos y llénelos hasta 1 ml con DMEM/F12 suplementado con FBS, Pen/Strep y AmphoB.
  12. Mantener los cultivos celulares de EPR a 37 °C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% deCO2 hasta alcanzar la confluencia. Cambie el medio de cultivo celular dos veces por semana.

2. Electroporación de células RPE humanas primarias

  1. Preparación de la mezcla de plásmidos transposasa/transposón SB100X
    1. Purificar la transposasa SB100X y el ADN plásmido transposón PEDF utilizando kits de purificación de plásmidos habituales, que se identifican como adecuados para el uso en aplicaciones como la transfección, de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    2. Cuantificar el contenido de ADN plásmido utilizando un espectrofotómetro de microvolumen y ajustarlo a una concentración de 250 ng/μL con 10 mM de Tris-HCl (pH 8,5).
    3. Mezcle una porción de ADN plásmido transposasa SB100X de 250 ng/μL (p. ej., 2,5 μL) con 16 porciones de ADN plásmido transposónico PEDF de 250 ng/μL (p. ej., 40 μL). La mezcla de plásmidos residuales puede almacenarse a -20 °C.
      NOTA: Se deben evitar múltiples ciclos repetidos de congelación y descongelación de la mezcla de plásmidos.
    4. Colocar 2 μL de la mezcla de plásmido de transposasa SB100X/transposón PEDF, que contenga 29,4 ng de plásmido de transposasa SB100X y 470,6 ng de plásmido de transposón PEDF, en un tubo de microcentrífuga estéril de bloqueo seguro de 1,5 ml. Mantener en hielo hasta que se mezcle con las células.
  2. Configuración del sistema de transfección capilar
    NOTA: La electroporación de células RPE humanas primarias se ha realizado a través de un sistema de transfección capilar utilizando el kit de 10 μL de acuerdo con el protocolo del fabricante. El sistema comprende el dispositivo de transfección, la pipeta de transfección y la estación de pipetas. El kit contiene puntas de transfección de 10 μL, tubos tampón, tampón electrolítico E (tampón E) y tampón de resuspensión R (tampón R).
    1. Conecte la estación de pipetas al dispositivo de transfección.
    2. Llene un tubo tampón con 3 ml de tampón E e insértelo en la estación de pipetas hasta que se escuche un sonido de clic.
      NOTA: Asegúrese de que el electrodo lateral del tubo tampón esté conectado al émbolo de bola lateral de la estación de pipetas.
    3. Para la electroporación de células RPE humanas primarias, establezca las siguientes condiciones de pulso en el dispositivo de transfección: 1.100 V (voltaje de pulso), 20 ms (ancho de pulso), dos pulsos (número de pulso).
  3. Preparación de las células humanas primarias del EPR cultivadas
    1. Documentar la forma y morfología de los cultivos celulares primarios de EPR mediante microscopía de contraste de fase. Tome micrografías de bajo aumento para demostrar el crecimiento de las células RPE a una monocapa confluente e integrada, así como micrografías de mayor aumento para señalar la morfología típica de adoquines de las células RPE.
    2. Aspirar el medio de cultivo celular y lavar las células dos veces con 1 ml de solución salina de fosfato tamponada (PBS, pH 7.4).
    3. Tripsinizar las células RPE humanas primarias con 0,5 mL de tripsina-EDTA al 0,05% a 37 °C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% deCO2 durante 7-15 min (máximo). Compruebe el desprendimiento de células microscópicamente.
    4. Detener la tripsinización con 1 ml de DMEM/F12 suplementado con FBS. Tome una alícuota de 20 μL para el recuento celular con un hemocitómetro. Centrifugar la suspensión de la celda RPE a 106 x g durante 10 min.
    5. Mezclar la alícuota de 20 μL con 20 μL de solución de azul de tripano. Pipetear 10 μL en cada mitad del hemocitómetro y contar las células bajo un microscopio de contraste de fase.
    6. Después de la centrifugación, resuspender el pellet de la célula RPE en 1 ml de PBS.
    7. Tome 10.000-100.000 células RPE por reacción de transfección y centrifugarlas a 106 x g durante 10 min.
      NOTA: Además de las reacciones de transfección con aplicación de campo eléctrico y adición de ADN plásmido, cada enfoque también incluye dos cultivos de control diferentes: (1) sin aplicación de campo eléctrico y sin ADN plásmido; (2) con aplicación de campo eléctrico, pero sin ADN plásmido.
    8. Resuspender el pellet celular en 11 μL de tampón R y combinarlo con 2 μL de la mezcla de plásmidos de transposasa SB100X /transposón PEDF (ver paso 2.1.4).
      NOTA: Después de la resuspensión en el tampón R, las células deben procesarse dentro de los 15 minutos para evitar una reducción en la viabilidad celular y la eficiencia de la transfección.
    9. Inserte el cabezal de la pipeta de transfección en la punta de transfección de 10 μL hasta que la abrazadera recoja completamente el vástago de montaje del pistón. Extraiga la solución celular/plásmida en la punta de transfección.
      NOTA: Evite la generación de burbujas de aire y su aspiración en la punta de transfección.
    10. Proporcionar 1 ml de DMEM/F12 suplementado con FBS, pero sin Pen/Strep y sin AmphoB, en el número requerido de pocillos de una placa de cultivo celular de 24 pocillos.
  4. Proceso de electroporación
    1. Inserte la pipeta de transfección en el tubo tampón situado en la estación de pipetas (ver paso 2.2.2) hasta que se escuche un sonido de clic.
      NOTA: Asegúrese de que la cabeza metálica de la pipeta de transfección esté conectada al émbolo de bolas dentro de la estación de pipetas y al tubo intermedio.
    2. Pulse Inicio en la pantalla táctil del dispositivo de transfección. Antes de la aplicación del pulso eléctrico, el dispositivo comprueba automáticamente si el tubo tampón y la pipeta de transfección están insertados correctamente. Después de la entrega de los pulsos eléctricos, Complete se muestra en la pantalla táctil.
    3. Retirar con cuidado la pipeta de transfección de la estación de pipetas y liberar inmediatamente las células electroporadas de la punta de transfección de 10 μL pipeteando la solución celular/plásmida en los pocillos preparados de la placa de cultivo celular (ver paso 2.3.10).
    4. Mantener cultivos celulares de EPR transfectados a 37 °C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% deCO2. Agregue Pen/Strep y AmphoB con el primer intercambio medio 3 días después de la electroporación.

3. Análisis de células humanas primarias transfectadas

  1. Preparación de muestras
    1. Después de un tiempo de cultivo de 3 semanas, finalmente incubar los cultivos celulares de EPR en un volumen definido de 1.0 ml de DMEM / F12 suplementado con FBS, Pen / Strep y AmphoB durante un tiempo definido de 24 h.
    2. Tomar los sobrenadantes de cultivo celular y almacenarlos a -20 °C hasta su procesamiento cercano o a -80 °C para muestras térmicamente inestables y almacenamiento a largo plazo.
    3. Tripsinizar cultivos de células RPE transfectadas con 0,5 mL de tripsina-EDTA al 0,05% a 37 °C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% deCO2 durante 10 min.
    4. Detener la tripsinización con 1 ml de DMEM/F12 suplementado con FBS. Tomar pequeñas alícuotas para el recuento celular con un hemocitómetro (ver paso 2.3.5). Centrifugar las suspensiones de la celda RPE a 106 x g durante 10 min.
    5. Almacene los gránulos de células RPE a -80 °C hasta su posterior procesamiento.
  2. Evaluación de la secreción de PEDF por Western blotting
    NOTA: Para una evaluación cualitativa, los sobrenadantes de cultivo celular (ver paso 3.1.2) se analizan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y posterior western bloting. Dependiendo de la PEDF ADN plásmido de transposón utilizado, los sobrenadantes tienen que ser procesados de manera diferente.
    1. Purificación de proteínas de fusión PEDF marcadas con His a partir de sobrenadantes de cultivo celular
      1. Tomar 30 μL de lechada de níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA) por muestra utilizando una punta de corte biselado y granular la resina Ni-NTA por centrifugación (2,660 x g durante 30 s).
      2. Resuspender cuidadosamente la resina Ni-NTA con 200 μL de 1x tampón de incubación (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8.0) y granularla por centrifugación (2,660 x g durante 30 s).
      3. Repita el paso anterior.
      4. Resuspender cuidadosamente la resina Ni-NTA con 40 μL 4x tampón de incubación (200 mM NaH 2 PO4,1,2M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8,0) por muestra.
      5. Mezclar 900 μL de sobrenadante de cultivo celular con 260 μL de tampón de incubación 4x y 55 μL de suspensión de Ni-NTA pretratada (ver paso 3.2.1.4).
      6. Incubar la mezcla en una coctelera a temperatura ambiente durante 60 min.
      7. Pellet de la resina Ni-NTA por centrifugación (2660 x g durante 60 s).
      8. Resuspender cuidadosamente la resina Ni-NTA con 175 μL de tampón de incubación 1x y resina de pellets por centrifugación (2,660 x g durante 60 s).
      9. Repita el paso anterior.
      10. Resuspender cuidadosamente la resina Ni-NTA con 30 μL de tampón de elución (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8.0) e incubar la mezcla en una coctelera a temperatura ambiente durante 20 min.
      11. Granular la resina Ni-NTA por centrifugación (2.660 x g durante 30 s).
      12. Tome cuidadosamente el sobrenadante y mézclelo con 2x SDS samplebuffer 47.
      13. Calentar la mezcla a 95 °C durante 5 min y separar las proteínas purificadas de Ni-NTA en un gel de poliacrilamida SDS al 10%.
      14. Realizar Western blot utilizando anticuerpos anti-Penta-His (monoclonal de ratón, 1:500) y anticuerpos anti-ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (policlonal de conejo, 1:1.000) como se describió anteriormente36,37.
    2. Análisis directo de proteínas PEDF no marcadas
      1. Tomar 15 μL de sobrenadante de cultivo celular y mezclarlo con 2x SDS tampónde muestra 47.
      2. Calentar la mezcla a 95 °C durante 5 min y separar las proteínas en un gel de poliacrilamida SDS al 10%.
      3. Realizar Western blot utilizando anticuerpos anti-humano PEDF (conejo policlonal, 1:4.000) y anticuerpos anti-conejo conjugados HRP (policlonal de cabra, 1:2.000) como se describió anteriormente38.
    3. Cuantificación de la secreción de PEDF por ELISA
      1. Analizar sobrenadantes de cultivos celulares (ver paso 3.1.2) utilizando un kit ELISA PEDF humano de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      2. Relacionar la cantidad de PEDF secretada con el tiempo y el número de células determinado para cada reacción de transfección (ver paso 3.1.4).
    4. Análisis de la expresión del gen PEDF en células RPE transfectadas
      1. Aísle el ARN total de los gránulos de células del EPR (ver paso 3.1.5) utilizando un kit disponible comercialmente de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      2. Cuantificar el contenido de ARN utilizando un espectrofotómetro de microvolumen.
      3. Realizar la transcripción inversa en ARN de 0,1 μg utilizando un sistema de transcripción inversa de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      4. Realizar qPCR en tiempo real como se describió anteriormente38.
    5. Análisis de sitios de inserción de transgenes en células RPE transfectadas
      1. Aislar el ADN genómico de los gránulos de células del EPR (ver paso 3.1.5) utilizando un kit disponible comercialmente de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      2. Cuantificar el contenido de ADN utilizando un espectrofotómetro de microvolumen.
      3. Generar bibliotecas de sitios de inserción utilizando un esquema de PCR hemiespecífica asistida por computación, como se describió anteriormente38.
      4. Realizar análisis computacionales como se describió anteriormente38.

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Resultados

Cultivo y electroporación de células RPE humanas primarias
Hemos demostrado que la siembra de un número suficiente de células primarias del EPR de origen animal permite el cultivo y crecimiento a una monocapa integrada de células pigmentadas, de forma hexagonal36,37,48. Su capacidad para formar uniones estrechas, exhibir actividad fagocítica y expresar genes marcadores específ...

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Discusión

En nuestro proyecto, nuestro objetivo es la producción no viral de células RPE humanas primarias modificadas genéticamente que continuamente sobreexpresan y secretan un factor eficaz para utilizar las células transfectadas como terapéuticas a largo plazo para el establecimiento y mantenimiento de un entorno protector. Hemos establecido la introducción del gen que codifica PEDF, una proteína multifuncional expresada ubicuamente con funciones antiangiogénicas y neuroprotectoras. El protocolo descrito aquí se puede utilizar...

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Divulgaciones

Zoltán Ivics y Zsuzsanna Izsvák son inventores de varias patentes sobre tecnología de transposón SB

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Séptimo Programa Marco de la Unión Europea para la investigación, el desarrollo tecnológico y la demostración, acuerdo de subvención no. 305134. Zsuzsanna Izsvák fue financiada por el Consejo Europeo de Investigación, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Los autores desean agradecer a Anna Dobias y Antje Schiefer (Departamento de Oftalmología, Hospital Universitario RWTH Aachen) por su excelente apoyo técnico, y al Banco de Córnea de Aquisgrán (Departamento de Oftalmología, Hospital Universitario RWTH Aachen) por proporcionar los ojos del donante humano.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aislamiento de células EPR humanas primarias
24-PlateEppendorf, Hamburgo, Alemania0030722019
Anfotericina B [250 µ g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, AlemaniaA2942
Pinza de ColibríGeuder, Heidelberg, AlemaniaG-18950
Pinza de iris curva Geuder, Heidelberg, AlemaniaG-18856
Bisturí desechable (n.º 11)Feather, Osaka, Japón
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio/Jamón' s F-12 Mezcla de nutrientes (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, AlemaniaP04-41150
Tijera de ojo puntiagudo extrafino Geuder, Heidelberg, AlemaniaG-19405
Suero fetal bovino [0.2 µ m Filtrado estéril] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, AlemaniaP40-37500
Vidrio Pasteur PipetasMarca, Wertheim, Alemania747715
Penicilina [10.000 unidades/mL] y estreptomicina [10 mg/mL] (Pluma/Estreptococo)Merck, Darmstadt, AlemaniaP0781
Puntas de pipeta (1000 y micro; L)Starlab, Hamburgo, Alemania
Pipeta de un solo canal (100-1000 y micro; L)Eppendorf, Hamburgo, Alemania
Cortina estérilLohmann & Rauscher, Rengsdorf, Alemania
Compresa de gasa estéril Fink-Walter, Merchweiler, Alemania321063
Guantes estérilesSempermed, Viena, Austria
Placa de Petri estéril (Falcon 60 mm x 15 mm)Corning, Corning, NY351007
Bata quirúrgica estérilHalyard Health, Alpharetta, GA
Pinzas de iris rectas Geuder, Heidelberg, AlemaniaG-18855
Electroporación de células primarias de EPR humanas
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
Placa de cultivo celular de 12 pocillosThermo Fisher Scientific, Waltham, MA150628
placa de cultivo celular de 24 pocillosEppendorf, Hamburgo, Alemania
Anfotericina B [250 µ g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, AlemaniaA2942
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio/Jamón' s F-12 Mezcla de nutrientes (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, AlemaniaP04-41150
Tubos de microcentrífuga con cierre seguro (1,5 mL)Eppendorf, Hamburgo, Alemania
Suero fetal bovino [0,2 y micro; m Filtrado estéril] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, AlemaniaP40-37500
Microscopio invertidoLeica Mikrosysteme, Wetzlar, AlemaniaLeica DMi8
(espectrofotómetro NanoDrop)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Sistema de transfección capilar (sistema de transfección de neón)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
MPK5000 Sistema de transfección de neón 10 µ L KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAMPK1096
Hemocitómetro (Cámara de Neubauer)Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Alemania0640110
PBS Dulbecco c/o Ca2+ c/o Mg2+Biochrom, Berlín, AlemaniaL182-50
Penicilina [10.000 unidades/mL] y estreptomicina [10 mg/mL] (Pena/Estreptococo)Merck, Darmstadt, AlemaniaP0781
Puntas de pipeta (10 µ L)Starlab, Hamburgo, Alemania
Puntas de pipeta (1000 y micro; L)Starlab, Hamburgo, Alemania
Puntas de pipeta (200 y micro; L)Starlab, Hamburgo, Alemania
Plásmido Maxi KitQiagen, Hilden, Alemania12163
Pipeta de un solo canal (0.1-10 y micro; L)Eppendorf, Hamburgo, Alemania
Pipeta de un solo canal (100-1000 y micro; L)Eppendorf, Hamburgo, Alemania
Pipeta de un solo canal (10-200 y micro; L)Eppendorf, Hamburgo, Alemania
Solución de azul de tripanoMerck, Darmstadt, AlemaniaT8154
Tripsina-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
Análisis de células primarias de EPR humano transfectadas
10% SDS-Gelde poliacrilamida
1x Tampón de incubación (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8.0)
2x Tampón de muestra SDS 4x Tampón
incubación (200 mM NaH2PO4, 1,2 m NaCl, 40 mM de imidazol, pH 8.0)
Amersham Protran Apoyado 0.2 y micro; m  Membrana de transferencia de nitrocelulosaCytiva, Marlborough, MA10600015
Anfotericina B [250 µ g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, AlemaniaA2942
Anticuerpos anti-PEDF (policlonales de conejo)BioProducts, Middletown, MDAnticuerpos anti-PEDF1
anti-Penta-His (monoclonales de ratón)Qiagen, Hilden, Alemania34660
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio/Jamón' s F-12 Mezcla de nutrientes (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, AlemaniaP04-41150
Tampón de elución (50 mM NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 250 mM de imidazol, pH 8,0) 
Suero fetal bovino [0.2 y micro; m Filtrado estéril] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, AlemaniaP40-37500
Hemocitómetro (Cámara de Neubauer)Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Alemania0640110
Anticuerpos anti-ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante (policlonal de conejo)Agilent Dako, Santa Clara, CAP0260
Anticuerpos anti-conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante (policlonal de cabra)Abcam, Cambridge, Reino Unidoab6721
Kit de ELISA PEDF Humano BioProducts, Middletown, MDPED613
LAS-3000 Sistema de imagenFujifilm, Minato, Japón
Instrumento LightCycler 1.2Roche Life Science, Penzberg, Alemania
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green IRoche Life Science, Penzberg, Alemania12239264001
LightCycler  Capilares (20 μ l)Roche Life Science, Penzberg, Alemania4929292001
Espectrofotómetro de microvolumen (espectrofotómetro NanoDrop)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN  Módulo de fundición de células TetraBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemania1658015
Mini-PROTEAN  Célula de electroforesis vertical Tetra para mini geles prefabricados, 4 gelesBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemania1658004
Ni-NTA SuperflowQiagen, Hilden, Alemania30410
PageRuler Escalera de proteínas preteñidaThermo Fisher Scientific, Waltham, MA26616
Penicilina [10.000 unidades/mL] y estreptomicina [10 mg/mL] (Pluma/Estreptococo)Merck, Darmstadt, AlemaniaP0781
Puntas de pipeta (10 y micro; L)Starlab, Hamburgo, Alemania
Puntas de pipeta (1000 y micro; L)Starlab, Hamburgo, Alemania
Puntas de pipeta (200 y micro; L)Starlab, Hamburgo, Alemania
Fuente de alimentación básica PowerPacBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemania1645050
QIAamp DNA Mini KitQiagen, Hilden, Alemania51304
Sistema de transcripción inversa Promega, Madison, WIA3500
Juego de DNasa sin RNasaQiagen, Hilden, Alemania79254
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Alemania74104
Agitador oscilanteCole-Parmer, Staffordshire, Reino UnidoSSM3
Safe-Lock (1,5 mL)Eppendorf, Hamburgo, Alemania
Tubos de microcentrífuga Safe-Lock (2,0 mL)Eppendorf, Hamburgo, Alemania
Pipeta monocanal (0,1-10 y micro; L)Eppendorf, Hamburgo, Alemania
Pipeta de un solo canal (100-1000 y micro; L)Eppendorf, Hamburgo, Alemania
Pipeta de un solo canal (10-200 y micro; l)Eppendorf, Hamburgo, Alemania
Sistema de Transferencia Trans-Blot TurboBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Alemania1704150
Solución de Azul de TripanoMerck, Darmstadt, AlemaniaT8154
Trypsin-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
0030722019 Espectrofotómetro de microvolumen de Tubos de microcentrífuga

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