Summary
Denne artikkelen tar sikte på å demonstrere bruken av parthenogenetiske haploide embryonale stamceller som erstatning for sæd for bygging av halvkloste embryoer.
Abstract
I organismer med seksuell reproduksjon er bakterieceller kilden til totipotente celler som utvikler seg til nye individer. Hos mus skaper befruktning av en oocytt av en spermatozoon en totipotent zygote. Nylig har flere publikasjoner rapportert at haploide embryonale stamceller (heSC) kan være en erstatning for spillgenomer og bidra til embryoer, som utvikler seg til mus. Her presenterer vi en protokoll for å bruke parthenogenetiske heSCCer som erstatning for sæd for å konstruere embryoer ved intracytoplasmatisk injeksjon i oocytter. Denne protokollen består av trinn for å forberede haESC som sæderstatning, til injeksjon av haESC-kromosomer i oocytter og for kultur av halvkloste embryoer. Embryoene kan gi fruktbare halvkloste mus etter embryooverføring. Bruk av haESC som sæderstatning letter genomredigering i bakterien, studier av embryonal utvikling og undersøkelse av genomisk avtrykk.
Introduction
Hos pattedyr er gameter de eneste cellene som overfører genetisk informasjon til neste generasjon. Fusjon av en oocytt og en spermatozoon danner en diploid zygote som utvikler seg til et voksent dyr. Mutasjoner i spillgenomer arves dermed av avkom og driver genetisk variasjon i art1. Innføring av mutasjoner i bakterien er anvendt for å produsere genmodifiserte dyr for ulike biologiske studier, inkludert karakterisering av genfunksjon og sykdomsmodellering. Både oocytter og spermatozoer er terminalt differensierte og høyt spesialiserte celler som har opphørt spredning. Derfor er direkte modifikasjon av gameter teknisk vanskelig, og spesialiserte tilnærminger er utviklet. Genetiske modifikasjoner kan innføres i musens bakterie ved injeksjon av genetisk modifiserte ESCer i blastocyster, hvor de integreres i det utviklende embryoet og koloniserer bakterien. I tillegg har genetisk modifikasjon av zygoter ved hjelp av genomredigeringsmetoder, inkludert CRISPR / Cas9-systemet, blitt allment vedtatt2.
Nylig har det blitt rapportert en enestående tilnærming, som gjelder haESCer som erstatning for et spillgenom3,4,5,6,7,8. HaESC er stamcellelinjer avledet fra den indre cellemassen av parthenogenetiske eller androgenetiske haploide blastocytter og har et enkelt sett med kromosomer4,7,9,10. Det har vist seg at både parthenogenetiske og androgenetiske heSCCer kan bidra til genomet av halvkloonede mus etter intracytoplasmisk injeksjon i oocytter. I motsetning til andre tilnærminger kan genomene til haESC-er endres direkte i kulturen på grunn av deres selvfornyelseskapasitet. Å introdusere genetiske modifikasjoner i bakterien ved å erstatte sæd med haESC er en viktig metode for biologiske studier. Det gir mulighet for separat kultur og manipulere mors eller farsgenom, som er avledet fra henholdsvis parthenogenetiske eller androgenetiske heSCCer. HaESC-er kan deretter brukes som gametisk genomerstatning, noe som er spesielt fordelaktig for studier av genomisk avtrykk, allelspesifikk uttrykk og foreldrespesifikke prosesser.
Hos mus er både mors og faderlig genomisk informasjon nødvendig for normal embryoutvikling11. Derfor kunne ikke fulltids valper oppnås når wild-type parthenogenetic haESCs (phaESCs) ble injisert for å erstatte sperm genomet5,8. For å overvinne utviklingsblokken må genomisk avtrykk av mors genom av parthenogenetiske heSCCer korrigeres til en farskonfigurasjon. Dette kan oppnås ved manipulering av differensialt metylerte regioner (DMRs). Til dags dato har målrettede slettinger av H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR og Rasgrf1-DMR blitt studert for å undertrykke maternalt uttrykte gener i phaESCs3,5,8,12. Disse studiene viste at sletting av både H19-DMRog IG-DMR er tilstrekkelig til å konvertere en mors til en paternal avtrykkskonfigurasjon som kan erstatte sædkromosomer. Intracytoplasmatisk injeksjon av phaESCs som bærer de to DMR-slettingene inn i oocytter, ga halv klonede valper med en frekvens mellom 5,1% og 15,5% av overførte 2-cellers embryoer.
Denne protokollen er basert på anvendelsen av phaESCs med slettinger av både H19-DMR og IG-DMR, som vi betegner dobbelt knockout phaESCs (DKO-phaESCs). Vi gir detaljerte instruksjoner for modifikasjon av genomisk avtrykk i phaESCs for å etablere DKO-phaESC linjer, for injeksjon av DKO-phaESCs i oocytter som en erstatning for et sperm genom, for kultur av semi-klonede embryoer til blastocyster, og for å oppnå semi-klonede mus. Denne protokollen er en referanse for forskere som krever presis og direkte manipulering av farsgenomet og generering av halvklonerte embryoer og mus.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført under lisensen ZH152/17 i samsvar med standardene og forskriftene til Cantonal Ethics Commission Zurich og EPIC dyreanlegg ved Institute of Molecular Health Sciences, ETH Zurich.
MERK: Denne protokollen starter med sletting av H19- og IG-DMRs i phaESCs. Hvis du vil ha mer informasjon om hvordan du oppretter phaESC-linjer, kan du se publiserte rapporter10,13. En oversikt over og tidsramme for denne protokollen (trinn 1–14) finnes i figur 1A. medier, løsninger og buffere er oppført i tabell 1. Prosedyren for å etablere DKO-phaESC-linjer (trinn 1–6) vises i figur 1B, og strategien for å konstruere halvkloste embryoer (trinn 7–14) er avbildet i figur 1C.
1. Transfeksjon av plasmider for sletting av H19-DMR og IG-DMR i phaESCs
- Forbered CRISPR/Cas9-plasmider for samuttrykk av Cas9-nukleaser og guide RNAer for å målrette slettinger av H19-DMR og IG-DMR. Ligate fire par guide RNA oligos (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R oppført i tabell 2) i pX330-plasmider.
MERK: Se den publiserte protokollen om den detaljerte prosedyren for fremstilling av disse 4 CRISPR/Cas9-plasmidene14. Alternativt er plasmider tilgjengelig for generelle musestammer også tilgjengelige gjennom et depot (Materialliste). - Belegge overflaten av en brønn av en 6-brønns plate med 1 ml 0,2% gelatinoppløsning ved inkubasjon ved 37 °C i 10 minutter.
- Plate 2 × 105 wildtype phaESCs på gelatinbelagt brønn i haESC medium uten antibiotika, og inkuber platen ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære i 1 dag.
MERK: Antibiotika utelates fra mediet for å øke effektiviteten til den påfølgende lipofeksjonen. Vi brukte wildtype phaESCs ved passering 10. Vi anbefaler at du bruker phaESCs for tidlig passasje, men en rekke passasjenummer har blitt brukt8. Sammenhengen mellom passasjenummer og effektivitet for å oppnå halvklostede embryoer og mus er for tiden ikke kjent. - Transfekt phaESCs i brønnen av en 6-brønns plate (fra trinn 1.3) med 6 plasmider samtidig ved hjelp av lipofeksjon reagens: 50 ng piggyBac plasmid bærer en CAG-EGFP transgene, 50 ng piggyBac transposase plasmid og 600 ng av hver av de 4 CRISPR/ Cas9 plasmidene (fra trinn 1.1). Se produsentens protokoll om detaljert prosedyre for transfeksjonen.
MERK: To piggyBac-plasmider brukes til å integrere en transposon for allestedsnærværende uttrykk for forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) i genomet til phaESCs. Hvis GFP-merking av cellene ikke er nødvendig, kan disse to plasmidene erstattes av en CRISPR / Cas9-plasmid for forbigående uttrykk for fluorescensproteiner (f.eks. pX458 plasmid) i stedet for en av pX330-plasmidene. Forbigående EGFP-uttrykk kan deretter brukes til sortering av transfekterte celler. - To dager etter transfeksjonen aspirerer du mediet og tilsetter 800 μL trypsin.
- Inkuber platen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 5 minutter. Tilsett deretter 2 ml vaskebuffer for å slukke trypsin, og pipette flere ganger for å få en enkelt celle suspensjon.
- Overfør celleopphenget til et 15 ml rør.
- Sentrifuger røret på 160 x g i 5 min, og fjern supernatanten.
- Resuspend cellepellet i 400 μL haESC vedlikeholdsbuffer supplert med 15 μg/ml Hoechst 33342.
MERK: For å redusere den potensielle toksisiteten til Hoechst 33342, 1 μg/ml Hoechst 33342 og 50 μM verapamil har blitt brukt i stedet for 15 μg/ml Hoechst 3334215. - Inkuber cellefjæringen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 15 minutter. Etter inkubasjonen, overfør celleopphenget til et 5 ml rør gjennom en cellesilhette, og hold røret ved 4 °C til det er klart til bruk i neste trinn (avsnitt 2).
2. Encellet plating av transfekterte phaESCs ved hjelp av et strømningscytometer
- En dag før sortering av de transfekterte phaESCs, platebestrålet mus embryonale fibroblaster (MEFs) på gelatinbelagte 96-brønnsplater med en tetthet på 4 × 104 celler / cm2 i MEF-medium. Vanligvis er 6 plater forberedt på å etablere en phaESC-linje med målrettede slettinger. Inkuber platene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
MERK: Bestrålede MEFer er kommersielt tilgjengelige. Vi bruker MEFer avledet fra E12.5 embryoer av DR4 mus. Selv om haESC-er kan vokse på gelatinbelagte plater uten MEF-er, anbefaler vi MEF-er for å øke levedyktigheten til sorterte enkelt-haESCer. - På sorteringsdagen aspirerer du MEF-mediet fra 96-brønnsplatene, og tilsetter 120 μL ferskt haESC-medium per brønn. Oppbevar platene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- Sett opp en cellesortering med en 100 μm dyse i henhold til produsentens instruksjoner. En 355 nm UV-laser og en 488 nm blå laser brukes til eksitasjon av henholdsvis Hoechst 33342 og EGFP fluorescens.
MERK: Alternativt kan Hoechst 33342 oppdages ved eksitasjon med 405 nm. - Sorter de transfekterte phaESCene i 5 ml-røret (fra trinn 1.10) ved hjelp av en port for innsamling av haploide celler i G1/S-fasen som viser EGFP-uttrykk. Deponer en enkelt celle i hver brønn av 96-brønnsplatene fra trinn 2.2.
MERK: Påvisning av Hoechst 33342 farging skiller vanligvis 3 topper av celler med et 1n, 2n og 4n DNA-innhold, som tilsvarer haploide celler i G1-fase, en blanding av haploide celler i henholdsvis G2 / M-fase og diploide celler i G1-fase og diploide celler i henholdsvis G2 / M-fase. Haploide celler i G1/S fase er identifisert som toppen med lavere intensitet av Hoechst 33342 fluorescens. Et representativt resultat og en sorteringsport vises i Figur 2A. - Etter plating, inkubere 96-brønnsplatene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
3. Sub-kloning av transfected phaESCs
- Tre dager etter encellet plating kan kolonier observeres i flere brønner av 96-brønnsplatene under et mikroskop. Merk brønnene der bare enkeltkolonier vokser.
MERK: Etter vår erfaring ble det observert enkeltkolonier i 20%-40% av brønnene på 96-brønnsplatene. - På dag 4 etter encellet plating erstatter halvparten av mediet med nytt haESC-medium i brønnene med enkeltkolonier.
- En dag før passaging (på dag 4 eller 5 etter encellet plating), bestrålet plate MEFs på gelatinbelagte 96-brønnsplater med en tetthet på 4 × 104 celler / cm2 i MEF-medium. Oppbevar platene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- Etter 5 eller 6 dager med encellet plating, velg brønner av 96-brønnsplatene som inneholder enkeltkolonier med en diameter større enn 150 μm.
MERK: Om lag 100 brønner velges fortrinnsvis for å etablere en phaESC-linje med de målrettede DMR-slettingene. - Aspirer mediet i de valgte brønnene og tilsett 30 μL trypsin. Inkuber 96-brønnsplatene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 5 minutter. Tilsett deretter 30 μL vaskebuffer til hver brønn for å slukke trypsin.
- Tilsett 140 μL haESC medium i hver brønn, og pipette flere ganger for å oppnå enkeltceller.
- Aspirer MEF-mediet fra brønnene på de 96 brønnplatene som ble utarbeidet i trinn 3.3.
- Overfør phaESC-ene fra hver brønn fra trinn 3.6 til en frisk brønn av den nye 96-brønnsplaten fra trinn 3.7.
- Inkuber 96-brønnsplatene som inneholder phaESC-subkloner ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- På neste dag aspirerer du hele mediet fra hver brønn, og legger til 120 μL nytt haESC-medium. Inkuber platene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- En dag før cellene blir flytende for passivring, kan du bestråle de bestrålede MEF-ene på gelatinbelagte 24-brønnsplater med en tetthet på 4 × 104 celler/cm2 i MEF-medium. Oppbevar platene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- Når phaESCs har blitt sammenfallende for passaging, aspirere mediet og legge til 30 μL trypsin. Inkuber 96-brønnsplatene ved 37 °C i 5 minutter.
- Tilsett 90 μL vaskebuffer i hver brønn for å slukke trypsin. Pipette flere ganger for å oppnå enkeltceller.
- Aspirer MEF-mediet fra brønnene på 24-brønnsplatene fra trinn 3,11, og tilsett 600 μL ferskt heESC-medium.
- Overfør 60 μL av suspensjonen av phaESC subclones fra hver brønn i trinn 3.13 til en ny brønn av 24-brønnsplatene fra trinn 3.14. Hold den gjenværende suspensjonen av hver phaESC subclone for DNA-ekstraksjon og genotyping i trinn 4.
- Inkuber 24-brønnsplatene med phaESC-subclones ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- En dag før cellekulturene når tettheten for passivitet, kan du bestråle de bestrålede MEF-ene på gelatinbelagte 6-brønnsplater med en tetthet på 4 × 104 celler/cm2 i MEF-medium. Oppbevar platene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- Når phaESCs blir confluent nok for passaging, aspirere mediet og legge til 250 μL trypsin. Inkuber 24-brønnsplatene ved 37 °C i 5 minutter.
MERK: Etter genotyping i trinn 4.9 må bare phaESC-linjer med sletting av både H19-DMR og IG-DMRpasseres. - Tilsett 750 μL vaskebuffer i hver brønn for å slukke trypsin. Pipette flere ganger for å oppnå en enkelt celle suspensjon. Overfør celleopphenget til et 15 ml rør.
- Sentrifuger røret ved 160 x g i 5 minutter, fjern supernatanten og resuspend cellepelleten i 2 ml haESC-medium.
- Aspirer MEF-mediet fra brønnene på 6-brønnsplatene fra trinn 3.17. Overfør phaESC-fjæringen fra hvert rør fra trinn 3.20 til en ny brønn. Oppbevar platene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- Utvid celleklonene ved å gjenta trinn 3.17 til 3.21 og øke platestørrelsen og volumene av trypsin, vaskebuffer og haESC-medium. Forbered en T25-kolbe for hver underklamerte phaESC-linje med MEFer for trinn 5.
MERK: Vi anbefaler å fryse en aliquot av hver sub-klonet phaESC-linje i 300 μL frysemedium og holde en kryostock i flytende nitrogenlagring før du går videre til trinn 5.
4. Første genotyping av sub-klonede phaESC-linjer med MEFer
- For å trekke ut genomisk DNA fra den gjenværende cellefjæringen fra trinn 3.15, tilsett 200 μL lysisbuffer til hver brønn av 96-brønnsplatene. Overfør celleopphenget til et 1,5 ml rør. Skyll hver brønn med ytterligere 200 μL lysisbuffer for å gjenopprette alle gjenværende celler og samle i samme 1,5 ml rør.
- Inkuber 1,5 ml-røret ved 55 °C i 3 timer med blanding.
- Etter inkubasjon, tilsett 460 μL isopropanol til hvert 1,5 ml rør, og bland forsiktig til et DNA-bunnfall blir synlig.
- Sentrifuger rørene ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten. Vask DNA-pelletsene med 200 μL 70% etanol.
- Sentrifuger rørene ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten.
- Tørk rørene i luft i 10 min og resuspend deretter DNA i 20 μL vann.
- Utfør polymerasekjedereaksjon (PCR) ved hjelp av termostabil DNA-polymerase etter produsentens protokoll.
MERK: Primerparene for PCR er oppført i tabell 2 og brukes som følger: H19-DMR-P1 og P3 (407 bp for slettet H19-DMR); H19-DMR-P2 og P3 (623 bp for wildtype H19-DMR); IG-DMR-P1 og P3 (319 bp for slettet IG-DMR); IG-DMR-P2 og P3 (492 bp for wildtype IG-DMR). Temperaturprofilen til PCR for alle primerpar er som følger: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min 72 °C. Lengden på forsterkede DNA-fragmenter for H19-DMR- og IG-DMR-slettingene viser en viss variasjon på grunn av ikke-homolog ende sammenføyning assosiert med CRISPR / Cas9-mediert redigering. PhaESCs ble dyrket med MEFer, som inneholder wildtype H19-DMR og IG-DMR DNA. Derfor er primerpar av H19-DMR-P2 /P3 og IG-DMR-P2/P3, som forsterker WILDTYPE DNA-fragmenter, ikke informative. Imidlertid er disse primerparene inkludert som kontroller og bør gi et bånd i alle reaksjoner. - Analyser PCR-fragmentene ved agarose gelelektroforese. Se den publiserte protokollen om den detaljerte prosedyren for elektroforesen16.
- Identifiser cellelinjer med slettinger av både H19-DMR og IG-DMR. Et representativt bilde av elektroforese er vist i figur 2B.
MERK: I vårt tilfelle ble åtte cellelinjer med sletting av både H19-DMR og IG-DMRidentifisert blant 135 underklamerte phaESC-linjer.
5. Haploid cellerensing av sub-klonede phaESC-linjer
- Når de sub-klonede phaESC-kulturene i T25-kolber fra trinn 3.22 blir tette nok til passivisering, aspirerer du mediet og legger til 1,5 ml trypsin. Inkuber kolben ved 37 °C i 5 minutter. Tilsett deretter 4,5 ml vaskebuffer og pipette flere ganger for å oppnå en encellet suspensjon.
- Overfør hver cellefjæring til et 15 ml rør og sentrifuger røret ved 160 x g i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspend cellepellets i 400 μL haESC vedlikeholdsbuffer supplert med 15 μg/ml Hoechst 33342.
- Inkuber cellesuspensjonene ved 37 °C i 15 minutter. Etter inkubasjonen, overfør cellesuspensjonene til et 5 ml rør gjennom en cellesilhette. Skyll cellesilhetten med ytterligere 400 μL heESC vedlikeholdsbuffer, og samle de resterende cellene i samme 5 ml rør. Hold røret ved 4 °C til det er klart til sortering.
- Sett opp et strømningscytometer med en 100 μm dyse i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Hoechst 33342 kan påvises ved eksitasjon ved 405 nm. Her brukes en 355 nm UV-laser til påvisning av Hoechst 33342. - Sett opp cellefjæringen (fra trinn 5.3) og et nytt 15 ml rør som inneholder 2 ml heESC-vedlikeholdsbuffer for å samle sorterte celler i strømningscytometeret.
- Start analysen og sett opp sorteringsporten for å samle haploide celler i G1/S-fasen. Se histogrammet i figur 2A for å identifisere G1/S fase phaESC-populasjonen.
MERK: Noen sub-klonede phaESC-linjer kan ikke inneholde haploide celler på grunn av fullstendig diploidisering eller feilaktig plating av diploide celler i trinn 2. Hvis haploide celler ikke observeres i G1/S-fasen, går du videre til en annen prøve uten å sortere. I vårt tilfelle inneholdt 5 cellelinjer haploide celler og 3 cellelinjer inneholdt bare diploide celler av 8 sub-klonede phaESC-linjer. - Etter cellesortering, tilsett 5 ml vaskebuffer langs veggen på 15 ml oppsamlingsrøret. Sentrifuger røret på 160 x g i 5 min. Fjern supernatanten.
- Velg en plate av passende størrelse for dyrking avhengig av antall sorterte celler. Bruk en enkelt brønn av en 96-brønnsplate, en 24-brønnsplate og en 12-brønnsplate for å dyrke henholdsvis 1000–40 000 celler, 40 000–200 000 celler og 200 000–400 000 celler. Resuspend cellepellet i henholdsvis 120 μL, 600 μL og 1,2 ml haESC-medium.
MERK: Plate cellene med høy tetthet fordi lav sammenløp kan føre til celledød av cellene etter sortering. Fra dette tidspunktet og fremover dyrkes phaESCs på gelatinbelagte brønner uten MEF-er for å lette genotyping i trinn 6 og den påfølgende anvendelsen for intracytoplasmisk injeksjon fra trinn 9. - Etter å ha overført cellefjæringen til en gelatinbelagt brønn av riktig størrelse, inkuber platen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- Fortsett å utvide phaESC-kulturene ved å gjenta trinn 3.18 til 3.21 med økende platestørrelser og økende mengder trypsin, vaskebuffer og haESC-medium. Cellene dyrkes på gelatinbelagte brønner uten MEF-er.
- For hver sub-klonede phaESC-linje, lag en kultur i en brønn på en 24-brønnsplate og en brønn av en 6-brønns plate for henholdsvis trinn 6 og 9.
MERK: Noen celler i hver underklamet phaESC-linje skal fryses i 300 μL frysemedium som kryostock i en flytende nitrogenlagringstank før du går videre til trinn 9.
6. Andre genotyping av underklamerte phaESC-linjer uten MEFer
MERK: En andre runde med genotyping utføres for å bekrefte at de sub-klonede phaESC-linjene har slettinger av både H19- og IG-DMRs, og at wildtype-alleler er fraværende etter fjerning av MEFer.
- Bekreft under mikroskopet at kulturene i brønnene på 24-brønnsplatene fra trinn 5.11 er fri for MEF-er.
MERK: Hvis MEFer blir observert, er det nødvendig å fortsette å passere kulturene til MEF-er har forsvunnet for å unngå å forurense PCR med wildtype DNA fra MEFer. - Aspirer mediet fra samløpskulturer og tilsett 400 μL lysisbuffer per brønn av 24-brønnsplaten. Etter pipettering flere ganger, overfør cellefjæringen til et 1,5 ml rør.
- Inkuber 1,5 ml-røret ved 55 °C i 3 timer med blanding.
- Etter inkubasjon, tilsett 400 μL isopropanol til 1,5 ml-røret, og bland forsiktig til et DNA-bunnfall blir synlig.
- Sentrifuger røret ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten. Vask DNA-pelletsen med 200 μL 70% etanol.
- Sentrifuger røret ved ≥ 10.000 x g i 5 min og fjern supernatanten.
- Tørk røret i luft i 10 min og resuspend deretter DNA i 50 μL vann.
- Utfør genotyping PCR etter trinn 4.7 og gel elektroforese i trinn 4.8 for å identifisere cellelinjer, som har slettinger av både H19- og IG-DMRs og er fri for wildtype alleler.
MERK: Et bilde av en typisk andre genotypingsanalyse vises i figur 2B som referanse. I vårt tilfelle var alle de 5 cellelinjene som ble valgt etter haploid cellerensing (trinn 5) fri for wildtype-alleler og hadde bare slettingsgatene til H19- og IG-DMRs. - Bruk de sub-klonede phaESC-linjene som er valgt etter denne andre genotypingen som DKO-phaESC-linjer.
7. Superovulation av mus
- For produksjon av MII oocytter, initiere superovulation ved intraperitoneal injeksjon av 5 IE av gravid mare serum gonadotropin (PMSG) løsning i hver B6D2F1 kvinnelig mus (4-5 uker gammel) 63-65 h før oocytt samling.
MERK: B6D2F1-musestammen anbefales for denne protokollen fordi B6D2F1 oocytter tolererer intracytoplasmisk injeksjon godt og viser høyt utviklingspotensial etter prosedyren17. - Førtiåtte timer etter PMSG injeksjon, intraperitoneally injisere 5 IE av human chorion gonadotropin løsning i hver mus.
8. Oocyte-kolleksjon
- Forbered en 4-brønns plate som inneholder 700 μL hyaluronidasemedium i en brønn og 700 μL M2 medium i de resterende 3 brønnene. I tillegg tilberedes en 6 cm tallerken med 7 ml M2 medium og en midtbrønnfat med 900 μL M16 medium. Forvarm tallerkenen og rettene ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- På dagen for den intracytoplasmatiske injeksjonen, euthanize superovulated kvinner (fra trinn 7.2) av enten Cervical dislocation eller CO2 inhalasjon på rundt 8 AM om morgenen. Disseker oviduktene ved hjelp av pinsett og saks. Plasser oviduktene i den 6 cm lange retten med M2-medium.
- Slipp cumulus-oocyttkompleksene (COC) ved å rive ampulla av oviduktene med en 30 G nål. Overfør COC-er til forvarmet hyaluronidasemedium og hold den ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- Etter 2–3 min samler du cumulusfrie oocytter med munnpipette og vasker oocyttene 3 ganger ved å overføre dem til ferskT M2-medium i de andre 3 brønnene på 4-brønnsplaten.
- Samle metafase II (MII) oocytter, som har første polare kropper, i en midtbrønnrett med M16 medium og hold platen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære til bruk for intracytoplasmatisk injeksjon i trinn 12.
9. Behandling og innsamling av DKO-phaESCs
- Forbered en DKO-phaESC-kultur i en brønn på en 6-brønnsplate uten MEFer ved 60-80% samløp en dag før den intracytoplasmatiske injeksjonen (fra trinn 5.11).
- For å indusere cellesyklusstans i M-fase, aspirer mediet helt og tilsett 2 ml haESC-medium som inneholder 0,05 mg/ml demecolcin.
- Etter 8 h demecolcin behandling, aspirere mediet og tilsett 800 μL trypsin.
- Inkuber platen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 5 minutter, tilsett deretter 2 ml vaskebuffer for å slukke trypsinet, og pipette flere ganger for å oppnå en encellet suspensjon.
- Overfør celleopphenget til et 15 ml rør. Sentrifuger røret ved 160 x g i 5 min og fjern supernatanten.
- Resuspend cellepellet i 400 μL heESC vedlikeholdsbuffer som inneholder 15 μg/ml Hoechst 33342.
- Inkuber cellefjæringen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 15 minutter. Etter inkubasjonen, overfør cellefjæringen til et 5 ml rør gjennom en cellesilhette, og hold røret ved 4 °C til cellesorteringen i trinn 10.
10. Rensing av M-fase-arresterte DKO-phaESCs
- Sett opp et strømningscytometer med en 100 μm dyse i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Hoechst 33342 kan påvises ved eksitasjon ved 405 nm. Her brukes en 355 nm UV-laser til påvisning av Hoechst 33342. - Sett opp M-fase-arresterte DKO-phaESCs fra trinn 9.7 og start analysen. Velg en passende sorteringsport for innsamling av haploide M-faseceller (2n) fra prøven som behandles med demecolcin.
MERK: Etter demecolcin behandling forventes 2 cellepopulasjoner, tilsvarende haploid og diploid M-fase-arresterte celler som vist i figur 3B. Cellesyklusstansen etter demecolcin behandling er fullført, og dermed observeres ingen haploid 1n DNA-topp. Dette er viktig ettersom de haploide M-fasecellene og diploide G1-cellene har samme DNA-innhold (2n) og vil produsere overlappende topper. - Sett opp et 15 ml rør som inneholder 2 ml heESC-vedlikeholdsbuffer for å samle de sorterte cellene i strømningscytometeret. Start cellesortering.
- Etter cellesortering, tilsett 5 ml vaskebuffer langs veggen av oppsamlingsrøret. Sentrifuger røret ved 160 x g i 5 min og fjern supernatanten.
- Resuspend cellene i et passende volum av haESC vedlikeholdsbuffer for å oppnå en endelig konsentrasjon på 5 x 105 celler / ml.
- Overfør celleopphenget til et 1,5 ml rør. Hold røret på is til det er klart for intracytoplasmatisk injeksjon i trinn 12.
11. Fremstilling av holde- og mikroinjeksjonspipetter
MERK: For å utføre den intracytoplasmatiske injeksjonen (trinn 12) er det nødvendig med flere holde- og mikroinjeksjonspipetter (figur 4A). Disse pipettene kan kjøpes på skreddersydd etterspørsel fra en kommersiell leverandør eller laget av egnede glasskapillærer ved hjelp av en mikropipettetrekker og en mikroforge.
- Trekk borosilikatglass kapillærer på en mikropipettetrekker. For å trekke borosilikatglass kapillærer uten filament (0,78 x 1,00 x 80 mm) er følgende parametere gitt for en flammende horisontal trekker (Tabell over materialer) som referanse, men vil variere for andre instrumenter og glass kapillærtyper: Varme 510 (Rampetest 480), Trekk 0, Hastighet 150, Tid 175 og Trykk 200 for å holde pipetter; Heat 510 (Rampetest 480), Trekk 90, Hastighet 140, Tid 125 og Trykk 200 for mikroinjeksjonspipetter.
MERK: De optimale parametrene må defineres individuelt fordi flere faktorer, inkludert fuktighet, modellen til en mikropipettetrekker og mange glasskapillærer, kan påvirke formen på injeksjonspipettene. En langstrakt form med en gradvis kon bør være rettet mot. - Forberedelse av holdepipetter
- Sett en trukket kapillær tilberedt i trinn 11.1 til en mikroforge. Plasser kapillæren over glassperlen på filamentet og senk kapillæren for å få kontakt med glassperlen mens du varmer opp filamentet.
- Bryt kapillæren ved å slå av oppvarmingen og løsne fra glassperlen slik at den ytre diameteren er 60-100 μm.
- Plasser kapillærspissen horisontalt for å vende mot glassperlen på filamentet.
- Varm filamentet slik at den indre diameteren på kapillærspissen smelter til en diameter på 10-20 μm.
- Flytt kapillæren slik at glassperlen plasserer seg på et punkt ~ 1 mm fra kapillærspissen uten kontakt. Varm opp filamentet slik at kapillæren kan bøye seg i en 20° vinkel. Demonter kapillæren, kalt en holdepipette, fra mikroforgen.
MERK: For å måle størrelsen på kapillæren, er det fortrinnsvis installert et okular-retitel i mikroforgen.
- Fremstilling av mikroinjeksjonspipetter
- Sett en trukket kapillær tilberedt i trinn 11.1 til en mikroforge. Plasser kapillæren over glassperlen på filamentet og senk kapillæren for å få kontakt med glassperlen mens du varmer opp filamentet.
- Bryt kapillæren ved å slå av oppvarmingen og løsne fra glassperlen i en posisjon som den ytre diameteren er 6 μm.
- Flytt kapillæren slik at glassperlen plasserer seg på et punkt ~ 1 mm fra kapillærspissen uten kontakt. Varm opp filamentet slik at kapillæren kan bøye seg oppover i en 20° vinkel. Demonter mikroinjeksjonspipetten fra mikroforberederen og oppbevar den i en sikker boks for senere bruk.
MERK: Mikroinjeksjonspipettene er tilberedt med følgende spesifikasjoner: ytre diameter, 6 μm; indre diameter, 4,5-5 μm; bøyevinkel, 20°. Å definere den optimale utformingen av mikroinjeksjonspipetten er viktig for suksessen til den intracytoplasmatiske injeksjonen. For stor indre diameter kan forhindre brudd på plasmamembranen til donor-DKO-phESC-ene (se diskusjonsseksjonen). Hvis den indre diameteren er for smal, kan det hindre jevn pipettering av donor-DKO-phESC-ene. En bøyevinkel < 30° er å foretrekke, da en høy bøyevinkel hindrer effekten av piezopulser.
12. Intracytoplasmisk injeksjon av DKO-phaESCs
- Før den intracytoplasmatiske injeksjonen (fra trinn 12.2), lag en polyvinylpyrrolidon (PVP) løsning ved å legge 5 ml M2 medium inn i et 50 ml rør som inneholder 0,6 g PVP og agitating røret på en rocker ved 4 °C i 2 dager. Etter at PVP er oppløst helt, er løsningen sterilfiltrert og lagret ved 4 °C.
- På dagen for den intracytoplasmatiske injeksjonen, lag en senter-brønnrett med 900 μL KSOM medium og forvarm parabolen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- Forbered en mikromanipuleringsfat ved å justere dråper på 5 μL PVP-oppløsning og 20 μL M2 medium på et lokk på en 10 cm tallerken som er plassert opp-ned. Dekk dråpene med mineralolje, og legg parabolen på injeksjonsmikroskopets stadium.
MERK: Det anbefalte arrangementet av mikromanipuleringsfatet er vist i figur 4B. - Monter en holderpipette på mikromanipulatoren. Fyll mikroinjeksjonspipetten med fluorokarbonoljen ved hjelp av en mikroloaderspiss, og monter den på piezo-aktuatoren.
- Senk mikroinjeksjonspipetten ned i en dråpe med PVP-oppløsning og pipette opp og ned flere ganger for å belegge glasset med PVP og gjøre det mindre klebrig. Last et lite volum PVP-løsning inn i mikroinjeksjonspipetten, og flytt pipetten til en dråpe med M2-medium.
- Senk pipetten ned i M2-mediet, og fokuser på pipetten i bunnen av dråpen.
- Overfør ca. 2 μL DKO-phaESC-suspensjon fra trinn 10,6 til M2-mediumfallet.
- Overfør 10 MII oocytter fra trinn 8.5 til samme M2 medium drop ved hjelp av en munnpipette.
- For injeksjon roterer du en oocytt i M2 medium-dråpen slik at perivitellinerommet vender mot mikroinjeksjonspipetten, og MII-platen er ikke plassert i banen til mikroinjeksjonspipetten (Figur 4A). Hold oocytten ved å påføre negativt trykk gjennom holdepipetten.
MERK: En MII-plate identifiseres visuelt som et fremspring av ooplasma som kalles en "pukkel" og ofte ligger ved siden av den første polare kroppen. MII-platen inneholder den meiotiske spindelen med vedlagte kromosomer. Berøring av mikroinjeksjonspipetten og MII-platen må unngås, da mekanisk skade på spindelen og kromosomene kan forstyrre embryoutviklingen. - Legg en DKO-phaESC i spissen av mikroinjeksjonspipetten ved å påføre forsiktig negativt trykk. Sprekk plasmamembranen til en DKO-phaESC ved pipettering for å unngå injeksjon av en intakt DKO-phaESC (Figur 3C; se diskusjon).
MERK: I tilfelle plasmamembranen til en DKO-phaESC ikke brister ved pipettering, kast DKO-phaESC og last inn en annen DKO-phaESC. - Plasser mikroinjeksjonspipetten i kontakt med oocyttens zona pellucida, og påfør en liten mengde negativt trykk i mikroinjeksjonspipetten.
- Påfør piezoimpulser (intensitet, 20; frekvens, 4) for å bryte gjennom zonaen mens du skyver spissen av mikroinjeksjonspipetten mot perivitellinerommet. Kontroller at MII-platen, som inneholder en spindel og kromosomer, ikke er plassert i banen til mikroinjeksjonspipetten.
MERK: Juster innstillingen empirisk til de laveste piezopulsene for boring gjennom zonaen for å minimere muligheten for skade på oolemmaen. - Kast fragmentet av zona pellucida fra mikroinjeksjonspipetten, og plasser DKO-phaESC på kanten av pipetten.
- Penetrer oocytten med mikroinjeksjonspipetten slik at oolemmaen når motsatt side.
MERK: Ikke berør MII-platen for å unngå skade på spindelen og kromosomene. - Påfør en piezopuls (intensitet, 6; frekvens, 1) for å pierce oolemmaen. Pass på at oolemmaen slapper av langs mikroinjeksjonspipettens skaft.
MERK: Empirisk definere den laveste innstillingen av piezo puls for å bryte oolemma for å minimere skaden på oocytten. - Injiser DKO-phaESC med et minimalt volum medium i ooplasma, og trekk mikroinjeksjonspipetten jevnt ut av oocytten.
- Løsne den injiserte oocytten fra holderpipetten, og plasser den på siden av mikrodråpen for senere innsamling.
- Gjenta injeksjonsprosedyren fra trinn 12,9 til 12,17 for de andre MII-oocyttene i M2-mediumfallet.
MERK: Unngå å holde oocyttene ute av inkubatoren i mer enn 20 minutter. Etter vår erfaring kan en gruppe på 10 oocytter manipuleres komfortabelt innen 15 minutter etter passende trening. - Overfør batchen med injiserte oocytter fra M2 medium drop til en forvarmet senterbrønnrett med KSOM-medium.
- Oppbevar retten i 1 time ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- Gjenta oocyttmanipuleringen fra trinn 12,5 og 12,20 med flere grupper MII-oocytter for å få nok injiserte oocytter.
13. Aktivering av konstruerte halvkloste embryoer
- Forbered to senter-brønn retter med 900 μL hver av KSOM medium og aktiveringsmedium. Forbered en 4-brønns plate med 700 μL KSOM medium i hver brønn. Forvarm oppvasken og tallerkenen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- Etter 1 time i KSOM-medium overfører du de injiserte oocyttene fra trinn 12.21 til den forvarmede midtbaneretten med aktiveringsmedium.
- Oppbevar retten i 6 timer ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære for aktivering.
- Etter aktivering, observere noen semi-klonede embryoer danner tre polare kropper, som er den første og den andre polare kroppen av oocytten, og pseudo polar kroppen fra DKO-phaESC (Figur 3E).
- Vask embryoene 3 ganger ved å overføre dem til nye brønner med KSOM-medium i en 4-brønns plate.
- Overfør embryoene inn i midtbrønnretten med KSOM-medium, og hold parabolen ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære for videre utvikling.
14. Utvikling av konstruerte halvkloste embryoer
- Etter 1 kulturdag i KSOM-medium fra trinn 13.6, når flere halvkloste embryoer 2-cellersstadiet (Figur 5A).
- For videreutvikling av preimplantasjonsembryoer in vitro, fortsett å dyrke de halvkloste embryoene i KSOM-medium ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære. Overfør de semi-klonede embryoene til friskt KSOM-medium på dag 2. På dag 4 vil flere embryoer nå blastocyststadiet (Figur 5A).
- For avledning av halv klonede mus, overfør 2-cellers embryoer fra trinn 14.1 til oviduktene til pseudo-gravide mottakerhunner. Identifiser pseudo-gravide kvinner ved parring til vasektomiserte menn en dag før embryooverføringen og velg dem på grunnlag av tilstedeværelsen av en tydelig synlig plugg om morgenen på dagen for embryooverføring (0,5 dager etter coitum (dpc)). Rundt 19,5 dpc leveres fulltids valper naturlig fra mottakerhunner (Figur 5B).
Representative Results
Formålet med denne protokollen er å bruke haESCs som erstatning for sæd for å oppnå halvkloste embryoer og mus. Til dette formål ble en DKO-phaESC-linje som bærer CAG-EGFP-transgene generert og brukt til intracytoplasmatisk injeksjon i MII oocytter. For å oppnå en passende phaESC-linje med en paternal avtrykkskonfigurasjon, utførte vi genteknologi ved hjelp av Cas9-nukleaser. En haploid ESC-linje inneholder haploide og diploide celler som oppstår på grunn av en iboende tendens til haploide ESCer for diploidisering10. Et haploid kromosomsett er en forutsetning for vellykket utskifting av sædgenomet. DNA-innholdsanalyse ved strømningscytometri viser fordelingen av haploide og diploide celler ved G0/G1-, S- og G2/M-faser (figur 2A).
For å etablere DKO-phaESC-linjene ble wildtype phaESC-linjer transfektet med piggyBac transposonkonstruksjoner for stabilt transgent EGFP-uttrykk og med CRISPR / Cas9-plasmider for å oppnå sletting av H19- og IG-DMRs. Hvis du vil utelate diploide ESCer og isolere bare haploide ESCer som uttrykker EGFP, ble det definert en bestemt sorteringsport (figur 2A). Enkelthaploide EGFP-positive celler ble deretter belagt i individuelle brønner på 96-brønnsplater for å oppnå underkloner. MEF-matere ble brukt til å øke platingeffektiviteten og overlevelsen til de transfekterte phaESCene. Etter utvidelse av kulturene ble en innledende runde med genotyping utført av PCR for å identifisere underkloner som bærer sletting av begge DMRs. Etter at MEF-matere hadde blitt fjernet fra kulturene, ble det utført en ny genotyping for å bekrefte fraværet av wildtype-alleler på H19- og IG-DMRs (Figur 2B). Fra totalt 135 underkloner fikk vi 5 haploide DKO-phESC-linjer som bar de slettede allelene og var fri for wildtype-alleler av både H19-DMR og IG-DMR.
En CAG-EGFP-transgene ble introdusert i DKO-phaESCs for å studere deres bidrag til semi-klonede embryoer ved visualisering av grønn fluorescens under et mikroskop (Figur 3A). For intracytoplasmatisk injeksjon ble DKO-phaESCs behandlet med demecolcine for å arrestere dem i M-fase. Dermed ble cellesyklusen til DKO-phaESCs synkronisert med MII-oocytter. Flow cytometrianalyse viste 2 populasjoner tilsvarende G2/M fase arrestert haploid (2n) og diploidceller (4n) etter behandling med demecolcin (Figur 3B). Fraværet av den 1n haploide toppen indikerte at cellesyklusstansen i stor grad var fullført. M-fase haploid ESCs ble deretter sortert og injisert i oocytter. For dette ble en enkelt DKO-phaESC lastet inn i mikroinjeksjonspipetten og injisert i cytoplasma av en MII oocyte (Figur 3C). Plasmamembranen til DKO-phaESC ble revnet ved pipettering i spissen av mikroinjeksjonspipetten.
Etter injeksjonen ble EGFP-uttrykket sjelden påvist i de konstruerte semi-klonede embryoene da cytoplasmaet til DKO-phaESCs hadde spredt seg i den store cytoplasma av oocytten (Figur 3D). I sjeldne tilfeller kan et rundt punkt med intens EGFP-uttrykk observeres i ooplasma. Denne observasjonen var sannsynligvis forårsaket av utilsiktet injeksjon av intakte DKO-phaESCs. Unnlatelse av å sprekke DKO-phaESC cellemembranen er sannsynligvis ikke kompatibel med videre embryoutvikling og bør unngås. En time etter injeksjonen ble embryoer aktivert ved behandling med strontiumklorid18. Seks timer etter aktiveringen ble det observert opptil 3 polarlegemer under mikroskopet (figur 3E). Disse polarlegemene tilsvarer den første og andre polare kroppen av oocytten og en pseudo polar kropp fra DKO-phaESC7. I tillegg ble to pronuclei observert under et differensialinterferenskontrastmikroskop, som lignet det pronukleære stadiet av zygoter etter normal befruktning med sædceller.
For å demonstrere utviklingskompetanse ble halvklossede embryoer dyrket til blastocyststadiet (figur 5A). Videre ble en fulltidsmus oppnådd etter overføring av halv klonede 2-cellers stadium embryoer til oviduktene til en mottaker kvinne (Figur 5B). Som forventet var musen avledet fra et semi-klonet embryo en kvinne da verken oocytter eller oocyttavlede phaESCs bærer et Y-kromosom. Den halv klonede musen var altfor normal og produserte sunne avkom når den var parret med en wildtype Swiss Webster-mann. Inntil nå har den halvkloste musen vært i live i over 600 dager uten tilsynelatende helseproblemer.
Figur 1: Oversikt over anvendelsen av DKO-phaESCs som sædutskifting. (A) En tidsramme for prosedyrene i protokollen. (B) Oppsettet viser trinnene for å opprette DKO-phaESC-linjer (trinn 1–6). (C) Ordningen viser trinnene for å konstruere halvklomet embryoer ved intracytoplasmatisk injeksjon av en DKO-phaESC i en MII oocyte (trinn 7-14). Forkortelser: DKO = dobbel knockout; phaESC = parthogenetisk haploid embryonal stamcelle; FACS = fluorescensaktivert cellesortering; MEF = mus embryonal fibroblast. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Etablering av DKO-phaESC-linjer ved CRISPR/Cas9-medierte slettinger av H19- og IG-DMRs. (A) Flow cytometri analyse av phaESCs etter transfeksjon med piggyBac plasmider for stabile EGFP uttrykk og med 4 CRISPR / Cas9 plasmider. Ikke-transfekerte phaESCer vises som kontroll. DNA-profilen (øverst) viser cellesyklusfordelingen av haploide og diploide celler. G1/S-fase haploide celler som uttrykker EGFP er indikert av den grønne porten (bunn, høyre). (B) Genotyping av phaESC-underkloner som ble dyrket på MEFer (første genotyping) og etter fjerning av MEFer (andre genotyping). Under klonede phaESC-linjer 1, 2, 3 og 4 representerer wildtype-celler, celler med H19-DMR-sletting, med en IG-DMR-sletting, og med henholdsvis kombinert H19- og IG-DMR-sletting. DKO-phaESC linje 5-8 har både H19-DMR og IG-DMR slettinger og er fri for wildtype alleler. Forkortelser: DKO = dobbel knockout; phaESC = parthogenetisk haploid embryonal stamcelle; DMR = differensialt metylert region; MEF = mus embryonal fibroblast; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; WT = wildtype. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Injeksjon av mitotically arrestert DKO-phaESCs i MII oocytes. (A) Morfologi av en DKO-phaESC kultur som bærer en CAG-EGFP transgene og sletting av H19- og IG-DMRs; skala bar = 50 μm. (B) Representativ strømning cytometri analyse av DKO-phaESCs etter arrestasjon med demecolcine for 8 h. DKO-phaESCs uten demecolcin behandling er vist som kontroll. (C) Morfologi av DKO-phaESCs i mikroinjeksjonspipetten. En enkelt intakt DKO-phaESC før (venstre) og etter (høyre) rupturing plasmamembranen ved pipettering er vist; skala bar = 20 μm. (D) Konstruerte embryoer ved 1 time etter injeksjon av DKO-phaESCs i MII oocytter. Et sammenslått bilde av EGFP fluorescens og lyst felt vises. Svarte pilspisser indikerer runde flekker av intens EGFP-uttrykk etter injeksjon av intakte DKO-phaESCs, som bør unngås; skala bar = 50 μm. (E) Et differensialinterferenskontrastbilde av halv klonede embryoer 6 timer etter initiering av aktivering med strontiumklorid er vist. Hvite pilspisser indikerer embryoer med 3 polarlegemer, inkludert en pseudo polar kropp fra injisert DKO-phaESC; skala bar = 50 μm. Forkortelser: DKO = dobbel knockout; phaESC = parthogenetisk haploid embryonal stamcelle; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Oppsett for intracytoplasmisk injeksjon av DKO-phaESCs i oocytter. (A) Arrangementet av en injeksjonspipette, en pipette og en oocyttt i injeksjonskammeret vises. α bøye vinkelen på mikroinjeksjonspipetten. (B) Oppsett av dråpene i mikromanipuleringsfatet for intracytoplasmatisk injeksjon. Forkortelser: DKO = dobbel knockout; phaESC = parthogenetisk haploid embryonal stamcelle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Utvikling av halvkloste embryoer. (A) Preimplantasjon utvikling av semi-klonede embryoer in vitro. EGFP-uttrykk observeres i utgangspunktet i firecellede embryoer på dag 2 etter intracytoplasmatisk injeksjon. På dag 4 kan intens EGFP-uttrykk observeres i blastocytter; skala bar = 100 μm. (B) En halv klonet mus oppnådd etter 2-cellers embryo overføring til en mottaker kvinne. Ved 74 dpp leverte den halvklostede musen (pilspissen) sine første valper (stjerne) ved naturlig fødsel etter parring med en wildtype Swiss Webster-mann. Semi-klonede embryoer og den halv klonede musen vist i denne figuren er identiske med de som er rapportert i Aizawa et al.3. Forkortelser: EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; .dpp, dager etter partum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Gelatin løsning | |||
| Komponent | Lagerkonsentrasjon | Volum/vekt | Endelig konsentrasjon |
| Vann | - | 500 ml | - |
| Gelatin | - | 1 g | 0.2% |
| Haploid embryonal stamcelle (HaESC) medium | |||
| Komponent | Lagerkonsentrasjon | Volum/vekt | Endelig konsentrasjon |
| NDiff 227 | - | 10 ml | - |
| CHIR 99021 | 10 mM | 3 μL | 3 μM |
| PD 0325901 | 10 mM | 1 μL | 1 μM |
| LIF | 1 x 106 IE/ml | 10 μL | 1 000 IE/ml |
| Penicillin-Streptomycin | 100x | 100 μL | 1x |
| HaESC-vedlikeholdsbuffer | |||
| Komponent | Lagerkonsentrasjon | Volum/vekt | Endelig konsentrasjon |
| HaESC-medium | - | 1 ml | - |
| HEPES-løsning | 1 M | 20 μL | 20 mM |
| Vaskebuffer | |||
| Komponent | Lagerkonsentrasjon | Volum/vekt | Endelig konsentrasjon |
| DMEM / F-12 | - | 100 ml | - |
| BSA-brøk | 7.5% | 7,1 ml | 0.5% |
| MEF-medium | |||
| Komponent | Lagerkonsentrasjon | Volum/vekt | Endelig konsentrasjon |
| DMEM | - | 500 ml | - |
| FBS | - | 56 ml | 10% |
| β-Mercaptoethanol | 14.3 mol/l | 3,9 μL | 100 μM |
| Penicillin-Streptomycin | 100x | 5,6 ml | 1x |
| Lysis buffer | |||
| Komponent | Lagerkonsentrasjon | Volum/vekt | Endelig konsentrasjon |
| Vann | - | 8,25 ml | - |
| Tris-HCl (pH 8,5) | 1 M | 1 ml | 100 mM |
| Edta | 0,5 M | 100 μL | 5 mM |
| SDS-løsning | 10% | 200 μL | 0.2% |
| Nacl | 5 M | 400 μL | 200 mM |
| Proteinase K | 20 mg/ml | 50 μL | 100 μg/ml |
| Aktiveringsmedium | |||
| Komponent | Lagerkonsentrasjon | Volum/vekt | Endelig konsentrasjon |
| KSOM | - | 1 ml | - |
| Strontiumklorid | 1 M | 5 μL | 5 mM |
| EGTA | 0,5 M, pH 8,0 | 4 μL | 2 mM |
| PVP-løsning | |||
| Komponent | Lagerkonsentrasjon | Volum/vekt | Endelig konsentrasjon |
| M2-medium | - | 5 ml | - |
| Pvp | - | 0,6 g | 12% |
| PMSG-løsning | |||
| Komponent | Lagerkonsentrasjon | Volum/vekt | Endelig konsentrasjon |
| Pbs | - | 450 μL | - |
| PMSG | 500 IE/ml | 50 μL | 50 IE/ml |
| hCG-løsning | |||
| Komponent | Lagerkonsentrasjon | Volum/vekt | Endelig konsentrasjon |
| Pbs | - | 450 μL | - |
| Hcg | 500 IE/ml | 50 μL | 50 IE/ml |
| Hyaluronidase medium | |||
| Komponent | Lagerkonsentrasjon | Volum/vekt | Endelig konsentrasjon |
| M2-medium | - | 380 μL | - |
| Hyaluronidase | 10 mg/ml | 20 μL | 0,5 mg/ml |
| Forkortelser: LIF = leukemi hemmende faktor; MEF = mus embryonal fibroblast; | |||
| FBS = foster bovint serum; DMEM = Dulbeccos modifiserte ørnemedium; BSA = bovint serumalbumin; | |||
| EDTA = etylendimintetraketisk syre; SDS = natriumddecylsulfat; EGTA = etylen-bis (oksyetylennitrilo)tetraedsyre; | |||
| PBS = fosfatbufret saltvann; PVP = polyvinylpyrrolidon; hCG = human choriongonadotropin; | |||
| PMSG = gravid mare serum gonadotropin. | |||
Tabell 1: Oppskrift av medium, buffer og løsning.
| navn | Sekvens (5 til 3') | Programmet | |
| H19-DMR-P1 | GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG | Genotyping | |
| H19-DMR-P2 | AGA TGG GGT KATT TCT TTT CC | Genotyping | |
| H19-DMR-P3 | TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT | Genotyping | |
| IG-DMR-P1 | TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG | Genotyping | |
| IG-DMR-P2 | CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA | Genotyping | |
| IG-DMR-P3 | ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG | Genotyping | |
| H19-DMR-gRNA1-F | CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG | gRNA | |
| H19-DMR-gRNA1-R | AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG | gRNA | |
| H19-DMR-gRNA2-F | CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG | gRNA | |
| H19-DMR-gRNA2-R | AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA1-F | CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA1-R | AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA2-F | CAC CCT GCT-KODE AGG TAC TAC GCT | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA2-R | AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG | gRNA | |
Tabell 2: Liste over oligonukleotider.
Discussion
Kloning av pattedyr ved somatisk celle kjernefysisk overføring (SCNT) har vært banebrytende på 1990-tallet19,20,21. Denne utviklingen fulgte kloning studier utført 30 år tidligere i amfibier22. Den betydelige forsinkelsen gjenspeiler vanskeligheten med embryologi og genomisk avtrykk hos pattedyr. Utviklingen av pattedyr SCNT er grunnlaget for anvendelsen av haESC for å erstatte sæd, som er detaljert i denne protokollen.
Cellesyklussynkronisering er en viktig faktor for suksessen til SCNT23. Dette er også tilfelle for injeksjon av haESC i denne protokollen. Å introdusere et donorgenom i en mottaker krever at cellesyklusfasene tilpasses for å unngå kromosomal brudd eller aneuploidier som vil avvike embryoutvikling. Semi-kloning har den ekstra kompleksiteten som to genomer og en cytoplast må være kompatible. En tidligere rapport har vist at injeksjon av M-fase-arresterte androgenetiske heSCCer ga bedre utviklingsrater av halvkloste embryoer enn injeksjon av G1-fase haESC i oocytter7. Denne rapporten foreslår M-fase som et passende synkroniseringspunkt for halvkloning. Følgelig ble phaESCs mitotically arrestert i metafase med demecolcine og injisert i ooplasma av MII oocytter, som naturlig ble arrestert i metafase II av meiosis. Viktigst, M-fase arrestasjon kan oppnås i mus ESCs med høy effektivitet, noe som gir utmerket synkronisering mellom donor og mottaker celle sykluser.
Under mitose bryter atommembranen ned og en spindel dannes som de replikerte kromosomene festes til. Etter injeksjon av M-fase DKO-phaESCs, søster kromotider er segregert i en pseudo polar kropp og zygote7 (Figur 3E). Følgelig bidrar et enkelt sett med kromosomer fra en DKO-phaESC til det halvkloste embryoet. Det er kritisk at søsterkromotider av DKO-phaESC-kromosomer kan skilles riktig etter injeksjon. Plasmamembranen til en intakt DKO-phaESC forhindrer segregering i en pseudo polar kropp. Vi observerte faktisk sjeldne tilfeller der plasmamembranen til DKO-phaESCs ikke ble revnet, og embryoer viste intakte DKO-phaESCs i ooplasma etter injeksjon (Figur 3D). Derfor må det tas hensyn til å fjerne plasmamembranen til DKO-phaESCs ved pipettering. Under injeksjonen er det like viktig å unngå forstyrrelsen av den meiotiske spindelen av oocytten, noe som kan føre til kromosomsegregeringsfeil og indusere aneuploidy også.
Hos pattedyr begrenser genomisk avtrykk anvendelsen av phaESCs som sæderstatning. Parthenogenetic haESCs har en mors konfigurasjon av genomiske avtrykk, mens sæd har en farskonfigurasjon. Derfor har generering av fulltids valper ikke skjedd etter injeksjon av wildtype phaESCs som sædutskifting. For å overvinne denne begrensningen er slettinger av IG- og H19-DMRs konstruert i phaESCs. Modifikasjon av avtrykket uttrykk på mors Igf2-H19 og Gtl2-Dlk1 loci er tilstrekkelig til å endre konfigurasjonen av genomiske avtrykk for å tillate generering av halvkloste mus med en frekvens på over 5,1%, basert på overførte 2-cellers embryoer. Disse observasjonene tyder på at målretting av to trykte gener bytter genomet til phaESCs til en funksjonell farskonfigurasjon som kan erstatte sæd hos mus. Likevel er det nødvendig med en permanent genetisk modifikasjon av phaESCs for denne strategien. Som en alternativ strategi kan androgenetisk heESC vurderes. Androgenetic haESCs er avledet fra sperm genomet og har farsavtrykk. Det har vært rapporter om at wildtype androgenetic haESCs bidro som sæderstatning for å generere fulltids valper med en frekvens mellom 1,3% og 1,9% av overførte embryoer4,7,24. Fulltids valper har også blitt oppnådd ved å injisere androgenetiske haESCer med sletting av IG- og H19-DMRs med en frekvens på 20,2% av overførte 2-cellers embryoer24. Den økte effektiviteten ved halvkloning ved hjelp av modifiserte androgenetiske heSCCer er sannsynligvis fordi avtrykk kan bli ustabile i kulturen. Avtrykksfeil korrigeres ved genetisk sletting av kritiske DMRs.
Tatt i betraktning vanskeligheten med å introdusere genetiske modifikasjoner direkte i oocytten eller sædgenomene, er haESC et verdifullt verktøy for å manipulere foreldregenomene separat. Å bruke haESCs som erstatning for sæd gir en bemerkelsesverdig fordel for genomredigering i musens bakterie. En nylig studie har kombinert CRISPR / Cas9-basert genomredigering med anvendelse av haESC for karakterisering av avtrykksregioner som er kritiske for embryonal utvikling12. Denne studien analyserte Rasgrf1-DMRsrolle i kombinasjon med H19-og IG-DMRs i utviklingen av bimaternale mus, og funksjonen til 7 forskjellige DMRs i utviklingen av topaternale mus. Metoden for å erstatte heSCCs for sperm dannet grunnlaget for genetisk screening tilnærminger for å identifisere viktige aminosyrer i DND1-proteinet i primordial bakteriecelleutvikling og for å identifisere gener i beinutvikling24,25,26. Studier på genomisk avtrykk og genetisk screening for å identifisere nøkkelfaktorer i embryonisk utvikling er betydelige tilnærminger for anvendelse av heSCcs som spillgenomer.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Giulio Di Minin for avledning av phaESC linjer og Dr. Remo Freimann for strømning cytometri drift. Vi anerkjenner også Ms. Michèle Schaffner og Mr. Thomas M. Hennek for teknisk støtte med embryooverføring. Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Science Foundation (tilskudd 31003A_152814/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mLTube | Eppendorf | 0030 125.150 | haESC culture |
| 15 ml Tube | Greiner Bio-One | 188271 | haESC culture |
| 12-well plate | Thermo Scientific | 150628 | haESC culture |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | haESC culture |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | haESC culture |
| 96-well plate | Thermo Scientific | 167008 | haESC culture |
| β-Mercaptoethanol | Merck | M6250 | haESC culture |
| BSA fraction | Gibco | 15260-037 | haESC culture |
| CHIR 99021 | Axon | 1386 | haESC culture |
| Demecolcine solution | Merck | D1925 | haESC culture |
| DMEM | Gibco | 41965-039 | haESC culture |
| DMEM / F-12 | Gibco | 11320-033 | haESC culture |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | haESC culture |
| EDTA | Merck | E5134 | haESC culture |
| FBS | biowest | S1810-500 | haESC culture |
| Freezing medium | amsbio | 11897 | haESC culture |
| Gelatin | Merck | G1890 | haESC culture |
| Hepes solution | Gibco | 15630-056 | haESC culture |
| Irradiated MEF | Gibco | A34966 | haESC culture |
| LIF (Leukemia inhibitory factor) | (Homemade) | - | haESC culture |
| Lipofection reagent | Invitrogen | 11668019 | haESC culture |
| NDiff 227 | Takara | Y40002 | haESC culture |
| PD 0325901 | Axon | 1408 | haESC culture |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | haESC culture |
| piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene | Addgene | #40973 | haESC culture |
| piggyBac transposase plasmid | System Biosciences | PB210PA-1 | haESC culture |
| pX330 plasmid | Addgene | #42230 | haESC culture |
| pX458 plasmid | Addgene | #48138 | haESC culture |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | haESC culture |
| DNA polymerase | Thermo Scientific | F549S | Genotyping |
| dNTP Mix | Thermo Scientific | R0192 | Genotyping |
| Ethanol | Merck | 100983 | Genotyping |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | Genotyping |
| Isopropanol | Merck | 109634 | Genotyping |
| Proteinase K | Axon | A3830 | Genotyping |
| SDS | Merck | 71729 | Genotyping |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Genotyping |
| ThermoMixer | Epeendorf | 5384000012 | Genotyping |
| Tris | Merck | T1503 | Genotyping |
| 5 mL Tube | Falcon | 352063 | Flow cytometry |
| 5 mL Tube with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Flow cytometry |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Flow cytometry |
| MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | Flow cytometry |
| 1 mL syringe | Codan | 62.1640 | Superovulation |
| 30-gauge 1/2 inch needle | Merck | Z192362-100EA | Superovulation |
| B6D2F1 mouse | The Jackson Laboratory | 100006 | Superovulation |
| hCG | MSD animal health | 49451 | Superovulation |
| PBS | Gibco | 10010015 | Superovulation |
| PMSG | Avivasysbio | OPPA1037 5000 IU | Superovulation |
| 10-cm dish | Thermo Scientific | 150350 | Embryo manipulation |
| 4-well plate | Thermo Scientific | 179830 | Embryo manipulation |
| 50 mL tube | Greiner Bio-One | 227261 | Embryo manipulation |
| 6 cm dish | Thermo Scientific | 150288 | Embryo manipulation |
| Center-well dish | Corning | 3260 | Embryo manipulation |
| Digital rocker | Thermo Scientific | 88880020 | Embryo manipulation |
| EGTA | AppliChem | A0878 | Embryo manipulation |
| Hyaluronidase | Merck | H4272 | Embryo manipulation |
| KSOM | Merck | MR-020P-5F | Embryo manipulation |
| M16 medium | Merck | M7292 | Embryo manipulation |
| M2 medium | Merck | M7167 | Embryo manipulation |
| Mineral oil | Merck | M8410 | Embryo manipulation |
| Glass capillary | Merck | P1049-1PAK | Embryo manipulation |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | Embryo manipulation |
| Strontium chloride | Merck | 13909 | Embryo manipulation |
| 5ml syringe | Codan | 62.5607 | Microinjection |
| Borosilicate glass cappilary | Science product | GB100T-8P | Microinjection |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Microinjection |
| Fluorinert FC-770 | Merck | F3556 | Microinjection |
| Holding pipette | BioMedical Instruments | - | Microinjection |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | Microinjection |
| Microforge | Narishige | MF-900 | Microinjection |
| Microinjection pipette | BioMedical Instruments | - | Microinjection |
| Microlaoder tips | Eppendorf | 5252 956.003 | Microinjection |
| Micromanipulaor arms | Narishige | NT-88-V3 | Microinjection |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | Microinjection |
| PiezoXpert | Eppendorf | 5194000016 | Microinjection |
| PVP (Polyvinylpyrrolidine) | Merck | PVP360 | Microinjection |
| Syringe filter | SARSTEDT | 83.1826.001 | Microinjection |
References
- Ellegren, H., Galtier, N.
- Huijbers, I. J. Generating genetically modified mice: A decision guide. Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).
- Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells. PloS One. 15 (9), 0233072 (2020).
- Li, W., et al. Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice. Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).
- Li, Z., et al. Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells. Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).
- Wan, H., et al. Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice. Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).
- Yang, H., et al. Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell. 149 (3), 605-617 (2012).
- Zhong, C., et al. Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection. Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).
- Elling, U., et al. Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).
- Leeb, M., Wutz, A. Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos. Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).
- Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).
- Li, Z. K., et al. Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions. Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).
- Elling, U., et al. Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells. Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Shuai, L., et al. Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection. Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).
- O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones. Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).
- Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).
- Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).
- Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).
- Gurdon, J. B. Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells. Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).
- Campbell, K. H., Alberio, R. Reprogramming the genome: role of the cell cycle. Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).
- Zhong, C., et al. CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library. Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).
- Bai, M., et al. Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development. PLoS Biology. 17 (7), 3000350 (2019).
- Li, Q., et al. CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development. Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).
