Caracterización de una nueva técnica de cultivo de retina organotípica humana

Resumen

Este estudio tiene como objetivo desarrollar un nuevo modelo de cultivo de retina organotípico humano (HORC) que evite comprometer la integridad de la retina durante el manejo del explante. Esto se logra cultivando la retina con el vítreo resbanante y el epitelio-coroides pigmentario retiniano subyacente (RPE-coroides) y esclerótica.

Resumen

Los modelos previos de cultivo organotípico de retina (HORC) humano han utilizado retinas desprendidas; sin embargo, sin el soporte estructural conferido por el epitelio-coroide pigmentario de la retina (EPR-coroides) y la esclerótica, la integridad de la retina frágil puede verse fácilmente comprometida. El objetivo de este estudio fue desarrollar un nuevo modelo HORC que contenga la retina, la CORoides RPE y la esclerótica para mantener la integridad de la retina al cultivar explantes retinianas.

Después de cortar circunferencialmente a lo largo del limbo para eliminar el iris y el cristalino, se hicieron cuatro incisiones profundas para aplanar el ocular. A diferencia de los protocolos HORC anteriores, se utilizó una trefina para cortar no solo la retina, sino también la COROIDES y la esclerótica. Los explantes de triple capa resultantes se cultivaron durante 72 h. La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) se utilizó para evaluar las estructuras anatómicas y los explantes retinianas se caracterizaron además por inmunohistoquímica (IHC) para la apoptosis, la integridad de las células de Müller y la inflamación de la retina. Para confirmar la posibilidad de inducción de la enfermedad, los explantes fueron expuestos a glucosa alta (HG) y citoquinas proinflamatorias (Cyt), para imitar la retinopatía diabética (RD). El ensayo de perla magnética de Luminex se utilizó para medir las citoquinas relacionadas con DR liberadas en el medio de cultivo.

La tinción de H&E reveló distintas láminas retinianas y núcleos compactos en explantes retinianas con la coroides y la esclerótica subyacentes, mientras que las retinas sin las estructuras subyacentes exhibieron un grosor reducido y una pérdida severa de núcleos. Los resultados de la IHC indicaron la ausencia de apoptosis e inflamación de la retina, así como la preservación de la integridad de las células de Müller. Los ensayos de Luminex mostraron un aumento significativo de la secreción de citoquinas proinflamatorias asociadas a DR en explantes retinianas expuestos a HG + Cyt en relación con los niveles basales a las 24 h.

Desarrollamos y caracterizamos con éxito un nuevo protocolo HORC en el que se preservó la integridad de la retina sin apoptosis ni inflamación de la retina. Además, la secreción inducida de biomarcadores proinflamatorios asociados a la RD al exponer los explantes de retina a HG + Cyt sugiere que este modelo podría usarse para estudios de enfermedad de la retina clínicamente traducibles.

Introducción

La retina es una estructura ocular altamente especializada responsable de transformar la energía de la luz entrante en señales eléctricas, que luego son procesadas por el cerebro para la percepción visual. La retina humana contiene un rango dinámico de tipos de células, altamente organizadas en una estructura lamelar única que consiste en dos capas sinápticas y tres núcleos¹ (Figura 1). La homeostasis retiniana se sustenta en las intrincadas conexiones entre las células neurorretinianas, los vasos sanguíneos, los nervios, los tejidos conectivos y el RPE^1. Debido a la sofisticada anatomía y f....

Protocolo

Las copas de ojos de donantes humanos se obtuvieron del Banco Nacional de Ojos de Nueva Zelanda después de la escisión corneal para trasplante y según lo aprobado por el Comité de Ética de Salud y Discapacidad de Northern B (NTX/06/19/CPD/AM07).

NOTA: El cultivo debe realizarse en un gabinete de bioseguridad de Clase II para garantizar condiciones de cultivo de tejidos estériles. Los tejidos deben cultivarse dentro de las 24 h post mortem para evitar una pérdida significativa de la integridad de la retina.

Resultados

La integridad de la retina se conservó en este modelo HORC. La integridad retiniana se conservó en los explantes retinianas sándwich cultivados, pero se perdió en la retina cultivada sin estructuras adyacentes. H&E se llevó a cabo para examinar la integridad estructural de los explantes retiniana sándwich seccionados después de 72 h en cultivo. Los explantes retinianas sándwich mostraron integridad preservada y una estructura de láminas distinta de GCL a ONL con núcle.......

Discusión

HORC es actualmente el modelo clínicamente más traducible en la investigación preclínica de la retina. En comparación con los modelos de cultivo celular in vitro, HORC puede representar mejor la anatomía de la retina humana in situ, a través de la retención de los tipos dinámicos de células retinianas y sus conexiones con las neuronas, las vasculaturas y el entorno extracelular¹⁹. En comparación con los modelos animales, los HORC son más ventajosos en el estudio de la fisiopatología y el diseño de.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Punzones de biopsia desechables (5 mm)	Integra York PA Inc., EE. UU.	21909-142	Denominados trépanos quirúrgicos en este artículo
IL-1 recombinante humana y beta;	Peprotech, EE. UU.	200-01B	Concentración de trabajo: 10 ng/mL
Recombinante Humano  TNF-a	Peprotech, EE. UU.	300-01A Concentración de	trabajo: 10 ng/mL
DAPI (1 µ g/mL)	Sigma Aldrich, Alemania	#D9542	Tinción nuclear. Dilución de trabajo 1:1000
DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX	Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., EE. UU	10565018	Dulbecco' s Mezcla de nutrientes Modified Eagle Medium F-12 que contiene un 1× Mezcla de antibióticos y antimicóticos (AA, 100 veces; stock)
Tijeras finas - Herramientas de ciencia fina afiladas-romas	(FST)	14028-10	Puntas: afiladas-romas, Filo: 27 mm, Longitud: 10 cm, Aleación/Material: Acero inoxidable, Dentado: No, Forma de la punta:
Pinzas de Graefe	rectas Herramientas de ciencia fina (FST)	11050-10	Longitud:10 cm, Forma de la punta: recta, Puntas: Dentadas, Ancho de la punta: 0,8 mm, Dimensiones de la punta:0,8 x 0,7 mm, Aleación/Materiales: Acero inoxidable
Ratón monoclonal GFAP-Cy3	Sigma Aldrich, Alemania	#C9205	Anticuerpo primario conjugado con Cy3. Dilución de trabajo 1:1000.
Vimentina-Cy3 monoclonal de ratón	Sigma Aldrich, Alemania	#C9080	Anticuerpo primario conjugado con Cy3. Dilución de trabajo 1:50.
TUNEL policlonal de conejo (Kit de detección de muerte celular in situ, fluoresceína)	Sigma Aldrich, Alemania	#11684795910	Anticuerpo primario conjugado con fluoresceína-dUTP. Dilución de trabajo 1:10 con solución tampón enzimática.

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