Artículo de método

Determinación Semicuantita cuantitativa de la densidad de la neurona dopaminérgica en la sustancia negra de modelos de roedores utilizando el análisis automatizado de imágenes

DOI:

10.3791/62062

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2 de febrero de 2021

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1Krembil Research Institute, Toronto Western Hospital, University Health Network, 2Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Department of Surgery, Division of Neurosurgery, University of Toronto, 4Department of Medicine, Division of Neurology, University of Toronto, 5Department of Medicine, Division of Neurology, Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease and the Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Clinic, Toronto Western Hospital, University Health Network, 6Tanz Centre for Research in Neurodegenerative Diseases, University of Toronto

En este artículo

Resumen

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Aquí presentamos un método automatizado para la determinación semicuantita cuantitativa del número de neuronas dopaminérgicas en el compacta de las igualdades del nigra del substantia de la rata.

Resumen

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La estimación del número de neuronas dopaminérgicas en el nigra del substantia es un método dominante en la investigación preclínica de la enfermedad de Parkinson. Actualmente, el conteo estereológico imparcial es el estándar para la cuantificación de estas células, pero sigue siendo un proceso laborioso y lento, que puede no ser factible para todos los proyectos. Aquí, describimos el uso de una plataforma de análisis de imágenes, que puede estimar con precisión la cantidad de celdas etiquetadas en una región predefinida de interés. Se describe un protocolo paso a paso para este método de análisis en el cerebro de rata y demostrar que puede identificar una reducción significativa en las neuronas positivas de la tirosina hidroxilasa debido a la expresión de mutante α-sinucleína en el nigra substantia. Se validó esta metodología mediante la comparación con los resultados obtenidos por estereología imparcial. En conjunto, este método proporciona un proceso eficiente en el tiempo y preciso para detectar cambios en el número de neuronas dopaminérgicas, y por lo tanto es adecuado para la determinación eficiente del efecto de las intervenciones en la supervivencia celular.

Introducción

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La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno del movimiento neurodegenerativo prevalente caracterizado por la presencia de agregados proteicos que contienen α-sinucleína (α-syn) y la pérdida preferencial de neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra pars compacta (SNpc)1. La cuantificación del número de neuronas dopaminérgicas es una parte vital de la investigación de la EP, ya que permite la evaluación de la integridad del sistema nigroestriatal, lo que proporciona un criterio de valoración importante para evaluar la eficacia de la terapéutica potencial modificadora de la enfermedad. Actualmente, el estándar para la cuantificación del nú....

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Protocolo

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Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Red de Salud de la Universidad y se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones establecidas por el Consejo Canadiense de Cuidado Animal.

1. Inyección estereotáctica

  1. Ratas Sprague-Dawley hembras adultas de casas de pareja (250-280 g) en jaulas con ropa de cama de madera y acceso ad lib a alimentos y agua. Mantener la colonia de animales en un ciclo regular de luz/oscuridad de 12 h (luces encendidas a las 06:30) con temperatura y humedad constantes.
  2. Realizar la inyección estereotáctica unilateral de AAV directamente al SNpc e....

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Resultados

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Mediante la aplicación de los métodos anteriores al tejido cerebral recogido 6 semanas después de las inyecciones de AAV, hemos demostrado que la inyección estereotáctica de AAV que expresa el mutante A53T α-syn (AAV-A53T) en el SNpc del cerebro de rata resulta en una reducción significativa en la densidad de las neuronas dopaminérgicas en comparación con la inyección del vector vacío AAV (AAV-EV) como un control(Figura 5A,B). El número malo de neuronas TH-positivas/mm2.......

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Discusión

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La evaluación confiable de la integridad del sistema dopaminérgico en modelos preclínicos del paladio es crítica determinar la eficacia de la terapéutica enfermedad-que modifica potencial. Por lo tanto, es importante controlar y minimizar las posibles confundciones que pueden reducir la fiabilidad y reproducibilidad de los datos histopatológicos. Los resultados cuantitativos cuidadosos pueden proporcionar más información que las descripciones cualitativas o semicuantitaticas por sí solas. Al mismo tiempo, debemos reconoc.......

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Divulgaciones

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Los autores no divulgan n° intereses que compiten.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer a todo el personal del Centro de Microscopía Óptica Avanzada (AOMF) de university health network por su tiempo y asistencia en el desarrollo de este protocolo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo A-SynThermoFisher Scientific32-8100
ABC EliteVector LabsPK-6102
Alexa Fluor 488 anticuerpo secundarioThermoFisher ScientificA-11008
Alexa Fluor 555 anticuerpo secundarioThermoFisher ScientificA-28180
IgG anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalinaJackson Immuno111-055-144
IgG biotinilada anti-ratónVector LabsBA-9200
Albúmina sérica bovinaSigmaA2153
DAKO medio de montaje fluorescenteAgilentS3023
HALO™Indica Labs
Histo-Clear IIDiamedHS202
ImmPACT DAB Sustrato de peroxidasaVector LabsSK-4105
LSM880 Microscopio confocalZeiss
NeuN AnticuerpoMilliporeMAB377
Suero de cabra normalVector LabsS-1000-20
OCTTissue-Tek
ParaformaldehídoBioShopPAR070.1
Microtomo deslizanteLeicaSM2010 R
Stereo InvestigatorMBF Bioscience
SacarosaBioShopSUC700
TH AnticuerpoThermoFisher ScientificP21962
VectaMount medio de montajeVector LabsH-5000
Vector Azul Sustrato de fosfatasa alcalinaVector LabsSK-5300
Zen Black SoftwareZeiss
Zen Blue SoftwareZeiss

Referencias

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  1. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson's disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
  2. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fra....

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Etiquetas

Dopaminergic Neuron DensitySubstantia NigraAutomated Image AnalysisParkinson s DiseaseTyrosine Hydroxylase StainingConfocal MicroscopyUnbiased StereologyCell DetectionRodent BrainAlpha Synuclein

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