Engenharia confiável e controle de circuitos genéticos estáveis em células mamíferas

Summary

O controle confiável das células mamíferas responsivas à luz requer a padronização dos métodos optogenéticos. Em direção a esse objetivo, este estudo descreve um pipeline de construção de circuitos genéticos, engenharia celular, operação de equipamentos optogenéticos e ensaios de verificação para padronizar o estudo da expressão genética induzida pela luz usando um circuito genético optogenético de feedback negativo como estudo de caso.

Abstract

O controle confiável da expressão genética em células de mamíferos requer ferramentas com variação de dobra alta, baixo ruído e funções determinadas de transferência de entrada para saída, independentemente do método utilizado. Nesse sentido, os sistemas de expressão genética optogenética ganharam muita atenção na última década para o controle espacial dos níveis de proteínas em células de mamíferos. No entanto, a maioria dos circuitos existentes que controlam a expressão genética induzida pela luz variam na arquitetura, são expressos a partir de plasmídeos e utilizam equipamentos optogenéticos variáveis, criando a necessidade de explorar a caracterização e a padronização de componentes optogenéticos em linhas de células estáveis. Aqui, o estudo fornece um pipeline experimental de construção, integração e caracterização de circuitos genéticos confiáveis para controlar a expressão genética indutível de luz em células de mamíferos, usando um circuito optogenético de feedback negativo como exemplo de caso. Os protocolos também ilustram como a padronização de equipamentos optogenéticos e regimes de luz podem revelar de forma confiável características do circuito genético, como ruído de expressão genética e magnitude da expressão proteica. Por fim, este artigo pode ser útil para laboratórios não familiarizados com optogenéticas que desejam adotar tal tecnologia. O oleoduto descrito aqui deve se aplicar a outros circuitos optogenéticos em células de mamíferos, permitindo uma caracterização mais confiável e detalhada da expressão genética no nível transcricional, proteômico e, finalmente, fenotípico em células mamíferas.

Introduction

Semelhante a outras disciplinas de engenharia, a biologia sintética visa padronizar protocolos, permitindo que ferramentas com funções altamente reprodutíveis sejam utilizadas para explorar questões relevantes para sistemas ^{biológicos1,2}. Um domínio em biologia sintética onde muitos sistemas de controle foram construídos é a área de regulação da expressão ^genética3,4. O controle da expressão genética pode atingir tanto os níveis de proteína quanto a variabilidade (ruído ou coeficiente de variação, CV = σ/μ, medido como o desvio padrão sobre a média), que são características celulares cruciais devido aos seus papéis em estados celulares fisiológicos e patológicos5,6,7,8. Muitos sistemas sintéticos que podem controlar níveis de proteína e ruídos4,9,10,11,12 foram projetados, criando oportunidades para padronizar protocolos entre ferramentas.

Um novo conjunto de ferramentas que podem controlar redes genéticas que surgiram recentemente é a optogenética, permitindo o uso da luz para controlar a expressão genética13,14,15,16,17. Semelhante aos seus antecessores químicos, circuitos genéticos optogenéticos podem ser introduzidos em qualquer tipo de célula, desde bactérias até mamíferos, permitindo a expressão de qualquer gene a jusante de ^{interesse18,19}. No entanto, devido à rápida geração de novas ferramentas optogenéticas, muitos sistemas surgiram que variam na arquitetura do circuito genético, mecanismo de expressão (por exemplo, integração plasmida versus viral) e equipamentos de controle de fornecimento de luz11,16,20,21,22,23,24,25 . Portanto, isso abre espaço para a padronização de características optogenéticas, como construção e otimização de circuitos genéticos, método de utilização do sistema (por exemplo, integração versus expressão transitória), ferramentas experimentais utilizadas para indução e análise de resultados.

Para progredir na padronização dos protocolos optogenéticos em células de mamíferos, este protocolo descreve um pipeline experimental para projetar sistemas optogenéticos em células mamíferas usando um circuito genético de feedback negativo (NF) integrado às células HEK293 (linha de células renais embrionárias humanas) como exemplo. A NF é um sistema ideal para demonstrar padronização, uma vez que é altamente abundante 26,27,28 na natureza, permitindo que os níveis de proteína sejam ajustados e a minimização do ruído ocorra. Resumindo, a NF permite um controle preciso da expressão genética por um repressor reduzindo sua própria expressão suficientemente rápida, limitando assim qualquer mudança longe de um estado estável. O estado estável pode ser alterado por um indutor que inativa ou elimina o repressor para permitir mais produção de proteínas até que um novo estado estável seja alcançado para cada concentração indutora. Recentemente, foi criado um sistema optogenético NF projetado que pode produzir uma resposta dinâmica ampla da expressão genética, manter o baixo ruído e responder a estímulos de luz permitindo o potencial de controle de expressão genética ^espacial11. Essas ferramentas, conhecidas como sintonizadores indutíveis por luz (LITers), foram inspiradas por sistemas anteriores que permitiram o controle da expressão genética em células vivas4,10,29,30 e foram firmemente integradas em linhas celulares humanas para garantir o controle da expressão genética a longo prazo.

Aqui, usando o LITer como exemplo, um protocolo é delineado para a criação de circuitos genéticos responsivos à luz, induzindo a expressão genética com um aparelho de placa de luz (LPA, um hardware de indução optogenética)³¹, e analisar respostas das linhas celulares projetadas e optogeneticamente controláveis para estímulos de luz personalizados. Este protocolo permite que os usuários utilizem as ferramentas LITer para qualquer gene funcional que desejam explorar. Também pode ser adaptado para outros sistemas optogenéticos com diversas arquiteturas de circuito (por exemplo, feedback positivo, regulação negativa, etc.) através da integração dos métodos e equipamentos optogenéticos descritos abaixo. Semelhante a outros protocolos de biologia sintética, as gravações de vídeo e protocolos optogenéticos aqui descritos podem ser aplicados em estudos unicelulares em diversas áreas, incluindo, mas não se limitando à biologia do câncer, desenvolvimento embrionário e diferenciação de tecidos.

Protocol

1. Design do circuito genético

1. Selecione componentes genéticos para combinar em um único circuito genético/plasmídeo (por exemplo, motivos de sequência de integração de DNA de ^mamíferos32, elementos responsivos à ^luz33 ou genes funcionais34).
2. Usando qualquer software de engenharia genética e/ou clonagem molecular, armazene as sequências de DNA para uso e referência posteriores, anote cada sequência e examine todas as características necessárias (por exemplo, codons START, sequências regulatórias ou traduzidas)³⁵.
3. Desenvolver ou adotar peças de acordo com o design geral do circuito ^genético36. Como exemplo, para repressores otogenéticos como no LITers11, fundir uma codificação de sequência genética para um domínio capaz de degradação indutível à ^luz37,38 ou inativação da capacidade de ligação de DNA de um repressor39, adjacente e na estrutura do gene repressor (por exemplo, TetR)⁴.
   1. Para ativadores optogenéticos, garanta a presença de um ativaror ^domain40 que promova a expressão genética na ligação de DNA induzida pela ^luz41. Para a autoregulação negativa ou positiva, garanta a presença de um site de vinculação regulatória ou upstream do promotor do gene regulador (por exemplo, sites tetO dentro ou upstream do promotor de expressão TetR)⁴².
4. Projete os primers para amplificação de sequência de DNA ou sequenciamento do plasmídeo usando o software de clonagem molecular para cada circuito genético.
5. Validar os primers computacionalmente para construção plasmida através das festas incorporadas do software de clonagem molecular (por exemplo, alinhamento de sequência).
6. Peça primers de oligonucleotídeos do fabricante. Plasmids construídos e usados neste trabalho podem ser encontrados no material de suporte ^original11 , juntamente com os primers projetados e usados.
7. Diluir os primers para 100 mM de concentração de estoque em água duplamente destilada (_ddH2O).
8. Diluir o estoque de primers de estoque de 100 mM para concentração de 10 mM para PCR.
9. Prepare a mistura pcr com 1 μL de primer dianteiro, 1 μL de primer reverso, 1 μL de DNA de modelo para uma massa total de 0,5-500 ng para genômico ou 0,5 pg-5 ng para DNA plasmid ou viral, 12,5 μL de dna polymerase 2x mix mestre (ou o volume que satisfaz o fator de diluição do fabricante), e 9,5 μL de _ddH2O para um volume total de reação de 25 μL.
10. Incubar a mistura pcr em um termociclador em configurações apropriadas, dependendo da enzima ^escolhida43. Os ciclos de reação sugeridos incluem:
    Passo 1: Um ciclo de 30 s passo inicial de desnaturação a 95 °C.
    Passo 2: 40 ciclos de 5 s de passo de desnaturação a 98 °C.
    Passo 3: Um ciclo de 30 s de etapa de ressarem a 65 °C (determinado por primers projetados anteriormente).
    Passo 4: Um ciclo de 1 min de extensão a 72 °C (~1 quilobase (kb) comprimento do fragmento).
    Passo 5: Um ciclo de extensão de 2 min a 72 °C.
    Segure a reação a 4 °C até que possa ser testada através de eletroforese de gel. Este protocolo variará dependendo dos reagentes utilizados (por exemplo, polimerase e tampões).
11. Repita o passo 1.9 para amplificar todos os fragmentos a serem usados em uma reação de montagem de DNA necessária para ligar produtos PCR lineares em um único vetor de DNA circular.
12. Execute os produtos PCR em um gel de 1% de agarose seguido de purificação das bandas do comprimento desejado.
13. Prepare a mistura mestre para uma reação de montagem de DNA (Tabela 1).
    NOTA: Neste exemplo, o vetor-mãe é dividido em dois fragmentos para aumentar a eficiência das etapas do PCR sem causar alterações significativas no resultado geral da montagem.
14. Incubar a mistura mestre de reação de montagem de DNA em um termociclador a 50 °C por 1 h (a menos que especificado de outra forma no protocolo de reagente de montagem de DNA) e armazene a reação a 4 °C para usar o produto de reação para transformação bacteriana.
15. Configurar a transformação bacteriana (química ou eletroporação) utilizando células competentes de E. coli (Escherichia coli) e o protocolo de transformação bacteriana correspondente. Após a transformação, utilize as placas de ágar luria-bertani bacteriana (LB) contendo o marcador de seleção bacteriana escolhida (por exemplo, Ampicillin) para emplacar a mistura de transformação. Incubar as placas a 37 °C durante a ^noite44.
16. Verifique as placas no dia seguinte. Para inocular as colônias, escolha colônias individuais das placas e resuspensá-las em um caldo líquido LB com o marcador de seleção bacteriana correspondente em tubos de cultura. Incubar em uma incubadora shaker a 37 °C, 300 rpm durante a noite.
17. Execute o protocolo de preparação plasmídeo para extrair o DNA plasmídeo da cultura bacteriana.
18. Valide o circuito em duas etapas. Primeiro, realize uma digestão de teste usando enzimas de restrição como uma verificação bruta para ver se o produto plasmídeo aproximado foi obtido. Em segundo lugar, se a digestão do teste for aprovada/confirmada, envie o plasmídeo a uma instalação de sequenciamento Sanger (ou processo usando o equipamento disponível) para obter a sequência precisa de DNA para compará-la posteriormente com a sequência esperada no software de design.
    1. Para realizar a digestão do teste, selecione pelo menos duas enzimas de restrição que produzem pelo menos dois fragmentos, com base no software de clonagem molecular utilizado. Uma vez selecionadas as enzimas, prepare as amostras de teste adicionando 1 μL de cada enzima, 5 μL do DNA gerado e 13 μL de água com sais e tampões apropriados, dependendo das enzimas utilizadas. Incubar a reação a 37 °C por 1 h, ou como sugere o fabricante da enzima. Execute os produtos de digestão de teste em um gel de 1% de agarose e determine se as bandas estão corretas.
       NOTA: Se as bandas estiverem corretas, proceda ao sequenciamento.
    2. Para realizar o sequenciamento, gere primers baseados no DNA armazenado no software para que as regiões de renaste dos primers estejam a cerca de 500 bp (pares de base) separadas e cubra o fragmento de interesse (componente do circuito genético) ou o plasmídeo completo. Diluir os primers com água pura sem nuclease (_NF-H2O) para 10 mM de concentração. Prepare as amostras de sequenciamento adicionando 1 μL de DNA de 10 ng/μL, 1 μL de primer e 8 μL de _NF-H2O a um tubo de 0,2 mL. Repita isso para cada cartilha.
       NOTA: Quando as amostras forem preparadas, deixe-as na instalação de sequenciamento e compare os resultados com a sequência plasmida usando software de clonagem molecular.
19. Nesta etapa, gere aproximadamente 100-1000 ng/μL de amostra de DNA para integrar os plasmídeos contendo circuitos genéticos na linha celular apropriada.

2. Engenharia de linha de células estáveis

1. Ordene uma linha celular de mamífero projetada para rápida geração de sub-linhas estáveis que garantam a expressão de alto nível da proteína de interesse de um vetor de expressão de mamíferos. O tipo de célula e a facilidade da engenharia da linha celular podem ser variáveis dependendo do que os usuários preferem ou pretendem alcançar.
   1. Por exemplo, se os usuários preferem a engenharia de linhas celulares com etapas intermediárias mínimas, encomende as células que contêm um único local de integração estável (por exemplo, FRT) em um lócus genômico ativo transcricionralmente. Se for preferida a engenharia celular mais matizada, crie locais de integração em locais preferenciais usando ferramentas de engenharia genética, como CRISPR/Cas9.
2. Cultivar células em 5% de _CO2 em ar umidificado a 37 °C. Ajuste as condições de crescimento conforme necessário para o tipo de célula.
3. Transfeito os circuitos genéticos projetados acima nas células desejadas obtidas das etapas anteriores para iniciar um processo estável de geração de linhas celulares. Para isso, use uma mistura ^lipossa45 do DNA do circuito genético com recombinase apropriada (por exemplo, Flp-recombinase para recombinação Flp-FRT) ou através de outros métodos como eletroporação.
4. Dois dias após a transfecção, divida as células para 25% de confluência.
5. Seis horas após a divisão das células, inicie a seleção de antibióticos trocando a mídia por uma mídia fresca contendo 50 μg/mL de antibiótico de higromicina (ou outro agente antibiótico correspondente ao gene de resistência a antibióticos mamíferos escolhido durante a construção plasmida).
   NOTA: Há uma variedade de genes de resistência a antibióticos mamíferos utilizados na construção de circuitos genéticos, cada um dos quais tem uma curva de morte diferente. Portanto, qualquer gene de resistência a antibióticos mamíferos é escolhido para a construção do circuito, uma curva de morte adequada deve ser estudada nas células de interesse. Esta etapa garante que as células que contêm a carga do circuito genético sejam enriquecidas enquanto aquelas sem o sistema são mortas.
6. Permita que as células cresçam na mídia de seleção de antibióticos, mude para mídia fresca a cada 2-3 dias até que a placa ou frasco tenha algumas dúzias de focos. Culturas aderentes de passagem quando estão na fase de registro antes de atingirem a confluência.
7. Uma vez que há bastantes focos, experimentpsinize as células com 1 mL de 0,25% de trippsina, 0,1% EDTA na solução de sal balanceado (HBSS) de Hank sem cálcio, magnésio e bicarbonato de sódio por vários minutos. Neutralizar a trippsina com mídia fresca e passar todas as células em um recipiente fresco.
8. Uma vez que as células no recipiente fresco são 80%-100% confluentes, congele-as em uma mistura de mídia 45% antiga, 45% mídia fresca e 10% DMSO. Transfira as células restantes para um tubo estéril e realize uma triagem unicelular para isolar células monoclonais em uma placa de 96 poços.
9. Aproximadamente 2-3 semanas pós classificação monoclonal, poços dentro da placa de 96 poços devem ter focos. Quando aproximadamente 50%-60% confluente, divida as células em uma placa de 12 poços.
10. Uma vez que a placa de 12 poços é 80%-100% confluente, divida-se em uma cultura de tecido tratada frasco T-25. Uma vez que as células do frasco T-25 são 80%-100% confluentes, congele as células e mantenha uma passagem para caracterização e teste de linhas de células monoclonais.
    1. Caracterizar as linhas de células monoclonanais por ensaios de microscopia e citometria de fluxo para relatar perfis de expressão genética com base na produção de repórteres fluorescentes induzidos. Verifique a produção funcional de proteínas através da rotulagem de anticorpos fluorescentes e do ensaio de imunofluorescência. Teste a indução de expressão genética de nível transcricional através de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Validar a sequência genética e a precisão de integração através do sequenciamento local e genoma inteiro dos clones.

3. Ensaios de indução do aparelho de placa leve

1. Construa um dispositivo ^LPA31,46 para ser usado para indução de luz de células projetadas. Resumidamente, vários passos amplos são cruciais para a criação de LPA para usar para controlar a expressão genética. Estes incluem componentes de quadro LPA de impressão 3D, construção da placa de circuito, programação do circuito via programador de microcontrolador, montagem dos componentes em um LPA final, programação do cartão de memória via software IRIS e calibração do dispositivo acabado. Para obter uma explicação mais completa, consulte as referências acima.
   1. Imprima as peças 3D conforme descrito em Gerhardt et al. (2016 e 2019)^31,46.
   2. Monte a placa de circuito conforme descrito em Gerhardt et al. (2016 e 2019)^31,46.
   3. Adicione o firmware ao circuito LPA montado usando programador de microcontrolador conforme descrito em Gerhardt et al. (2016 e 2019)^31,46.
   4. Combine peças impressas em 3D e a placa de circuito montada conforme descrito em Gerhardt et al. (2016 e 2019)^31,46. Isso inclui pegar a placa de montagem, a placa de circuito, o espaçador LED (diodos emissores de luz), o adaptador de placa, uma placa de 24 poços, uma tampa de placa, parafusos de montagem e porcas de asa e componentes de empilhamento, como mostrado no vídeo filmado e Figura 2.
   5. Para programação e calibração do cartão de memória do dispositivo, siga os passos descritos abaixo.
2. Use o software IRIS disponível no site do Tabor ^Lab47 para programar um cartão SD para o Aparelho de Placa leve (LPA)³¹ e explorar as condições de luz apropriadas necessárias para iniciar um experimento optogenético.
   NOTA: O software IRIS é um aplicativo baseado na Web para programar o hardware eletrônico optogenético, conhecido como LPA, desenvolvido pelo Tabor Lab. O software permite a programação de valores iris relativos que controlam os diodos emissores de luz individuais (LEDs) em cada poço do hardware LPA.
3. Escolha a opção de subsistência LPA (4 x 6), seguida clicando na abordagem de iluminação apropriada (Estado estável, dinâmico, avançado).
   NOTA: Para este manuscrito, todos os ensaios se concentrarão nos exemplos de estado estável. No entanto, os exemplos avançados de configuração podem ser usados para durações de pulso e regimes de ciclo de dever.
4. Escolha se os LEDs superiores ou inferiores serão iluminados digitando valores nas células correspondentes aos poços da placa. Para os LPAs utilizados neste trabalho, leds azuis colocados na posição superior foram usados em todos os experimentos. Cada LED, uma vez programado, pode proporcionar exposição contínua à luz com uma intensidade constante de luz. O software IRIS permite níveis de intensidade de 4096 que podem ser programados.
5. Uma vez escolhidas as localizações do LED, digite valores de intensidade para o contorno experimental desejado. Por exemplo, digite 8 intensidades de luz diferentes (ou durações de pulso ou ciclos de dever) com três réplicas técnicas por placa (Tabela 2). G.s. refere-se a unidades em escala de cinza - os valores de medição do nível de intensidade de luz utilizados para a programação LPA no software IRIS.
   1. Ao projetar arquivos experimentais IRIS, tenha em mente efeitos de borda de poços adjacentes no dispositivo LPA, toxicidade da luz do aumento das intensidades de exposição à luz azul e determinação do tipo de dose-resposta desejada (por exemplo, monotônico vs. não monotônico).
   2. Se os usuários programam células no LPA em ordem ascendente/descendente de um parâmetro de luz específico (por exemplo, intensidade), os poços podem produzir efeitos de borda do crosstalk leve ou mesmo do calor que pode influenciar poços adjacentes. Isso pode influenciar inadvertidamente o resultado das saídas medidas quando os experimentos estiverem completos. Para aliviar isso, os usuários podem implementar uma matriz de randomização no software IRIS para embaralhar locais de poços, minimizando efeitos de borda. Um exemplo está descrito nos Resultados Representativos abaixo (Figura 4A-B).
   3. Além disso, maiores intensidades de luz azul têm sido encontradas para interferir no crescimento celular e na ^{viabilidade48}. Portanto, para mitigar a toxicidade da luz, é importante produzir uma intensidade leve, duração do pulso ou curva de resposta do ciclo de serviço, dependendo da modalidade que está sendo investigada.
      1. Por exemplo, programe 8 valores de intensidade de luz com três réplicas por placa de 24 poços, com uma faixa de nenhuma luz a uma intensidade máxima do LPA. Em seguida, execute essas amostras em um citómetro de fluxo com um portão SSC-FSC ou uma mancha viva como iodeto de propídio para quantificar a sobrevivência das células vivas (células vivas em comparação com eventos totais, incluindo células mortas/detritos celulares) a cada valor da luz.
      2. Em seguida, determine a quantidade ideal de sobrevivência populacional para a configuração experimental, uma vez que qualquer estímulo pode afetar negativamente a proliferação, expressão genética ou sobrevivência (por exemplo, estabelecendo 80% de sobrevivência celular como uma troca apropriada). Por exemplo, neste trabalho, uma vez calibrado, a intensidade não excedeu 3000 g.s. unidades (~3/4 a intensidade máxima do dispositivo LPA). Um exemplo disso está descrito nos Resultados Representativos abaixo.
   4. Além de restringir os valores da luz por causa da toxicidade, os usuários podem querer restringir os valores da luz para caracterizar uma determinada parte da dose-resposta, como a faixa da resposta monótona.
      1. Para isso, inicialmente escaneie uma ampla gama de intensidades de luz, durações de pulso ou ciclos de dever, dependendo da modalidade que está sendo analisada ao determinar a dose-resposta desejada (Tabela 2) para estreitar o regime de luz de interesse, por exemplo, onde a expressão genética se correlaciona positivamente com o aumento dos valores de luz para uma dose-resposta monotônica.
      2. Para determinar a faixa de luz de interesse, programe um único LPA com até 24 poços de diferentes intensidades/duração do pulso/ciclo de serviço/etc. ou mais poços (por exemplo, 48, 72, 96, etc.) dependendo se vários LPAs são calibrados para fornecer quantidades de luz equivalentes e prosseguir com o trabalho de cultura celular ou ensaios descritos abaixo. Portanto, inicie a caracterização de um sistema optogenético com uma ampla gama de doses de estímulos de luz para determinar o intervalo de alcance que dá a expressão genética desejada e, posteriormente, realizar experimentos nessa faixa de dose refinada.
      3. Por exemplo, neste trabalho, uma vez que 3000 g.s. unidades foi determinada como o limiar para a intensidade da luz tóxica; este limiar foi utilizado como o limite superior de luz para ensaios descritos abaixo (por exemplo, imunofluorescência).
         NOTA: As etapas acima são independentes da calibração óptica do LPA e referem-se a uma calibração de nível molecular para cada sistema optogenético.
6. Uma vez que os valores de intensidade de luz apropriados são programados no IRIS, insira um cartão de memória com a tomada USB 3.0 no LPA para baixar e transferir os arquivos.
7. Se a calibração do LPA estiver ^completa31, proceda ao trabalho de cultura celular para o início do ensaio de indução de luz. Se a calibração não tiver sido feita, calibrar o LPA usando um método de análise de imagem (etapas 3.7.1-3.7.3) uma vez que o LPA seja programado com o programador de microcontrolador.
   1. Programe brevemente o LPA para ter o mesmo nível de IRIS descrito por Gerhardt et al. (2016)³¹.
      NOTA: Para calibração, o LPA foi programado para ter um valor de 2000 g.s.
   2. Uma vez que o dispositivo é programado com o cartão de memória e o botão de reset (botão físico no LPA) é pressionado, adquira uma imagem de todo o dispositivo (por exemplo, imager de estação de gel, dispositivo de scanner, etc.). Para a calibração, adquira duas imagens com o dispositivo girado em 180°.
   3. Em seguida, use software de código aberto projetado por Gerhardt et al. (2016)³¹ para mostrar a variabilidade na intensidade de LED na placa LPA e calcular os valores de compensação do LED para tornar a intensidade igual entre os poços. Um exemplo disso está descrito nos resultados representados abaixo (Figura 3). Uma vez que esta calibração esteja completa, proceda ao trabalho de cultura celular para o início do ensaio de indução de luz.
8. Obtenha frascos de células monoclonais projetadas da seção anterior para investigar efeitos de indução de luz na expressão genética.
9. Remova a mídia antiga do frasco.
10. Adicione 1 mL de trippsina às células e incubar por 5 minutos.
11. Após 5 min, neutralize a trippsina adicionando 4 mL do meio da Águia modificada por Dulbecco (DMEM ou outra mídia desejada) complementada com os produtos químicos necessários (este trabalho utilizou 50 μg/mL de hipgromicina, 1% penicilina/streptomicina solução, 10% de soro bovino fetal, FBS).
12. Adicione ~75.000 células por poço em uma placa preta de 24 poços em um volume total de 500 μL. O número de células semeadas pode variar dependendo da duração do experimento desejado e do tipo celular utilizado.
    NOTA: Além disso, observe que a densidade de semeadura celular afeta a manutenção da cultura e, potencialmente, a duração do experimento. A partir de um número menor de células por poço garante durações de tempo mais longas antes que a cultura atinja a confluência. Além disso, o tipo de componentes optogenéticos integrados aos circuitos genéticos de interesse influenciará quando a expressão genética atingir um estado estável e, portanto, afetar a duração dos experimentos. Outros fatores que podem ser considerados são taxas de crescimento específicas da linha celular, composição da mídia e efeitos de crescimento condicional (ou seja, luz).
13. Após o revestimento, coloque as células em uma incubadora umidificada com 5% de _CO2 para permitir que elas se contentem com 2-6 h.
14. Após a incubação, transfira as células para uma capa de cultura tecidual, remova a tampa plástica e adicione uma tira de papel alumínio adesiva ao topo da placa (Figura 2D). Esta etapa permite uma transferência mínima de luz entre os poços, já que a parte superior e as laterais dos poços são revestidas, e a luz agora só pode entrar a partir da parte inferior do poço onde o LED é colocado.
15. Coloque a placa nas partes 3D instaladas do LPA. Em seguida, cubra a placa com a tampa LPA impressa em 3D, que se encaixa sobre os parafusos do dispositivo em cada canto.
16. Conecte o dispositivo à fonte de alimentação e pressione o botão de reset no dispositivo LPA para garantir que as configurações atualizadas do experimento LPA sejam aplicadas.
17. Incubar as células dentro do sistema experimental por um período de tempo adequado, dependendo da densidade original de semeadura, velocidade de crescimento específica da linha celular e condições de crescimento. Neste exemplo, as linhas celulares foram induzidas por 3 dias continuamente para que a expressão genética chegasse a um estado estável. No entanto, deve-se notar que muitos sistemas optogenéticos (por exemplo, VVD) podem atingir a expressão genética de estado estável muito mais cedo (por exemplo, 24 h), e, portanto, os tempos de indução experimental podem ser reduzidos ou prolongados conforme necessário.
18. No final do experimento de indução de luz, utilize as amostras para qualquer um dos quatro ensaios seguintes para caracterizar as linhas celulares projetadas (seções 4-7).

4. Microscopia de fluorescência de células projetadas induzidas pela luz

1. 24-72 h pós-indução, remova as células do LPA da incubadora e coloque-as em uma capa de cultura tecidual.
2. Retire a tira de papel alumínio e deixe a placa sentar por 1-2 min. Isso evita que a condensação se forme na tampa plástica, se colocada imediatamente na placa.
3. Depois de 1-2 min de sessão, coloque a tampa de plástico original de volta na placa.
4. Imagem das células com o contraste de fase apropriado ou microscópio de fluorescência.
5. Dependendo do instrumento, ajuste o tempo de exposição, intensidade da fonte de luz e ganho para exibição de células projetadas. Neste experimento, foram aplicados os seguintes parâmetros: 50 ms para fitc/GFP (proteína fluorescente verde) tempo de exposição da fonte leve e 1-5 ms para tempo de exposição de contraste de fase a 100% de intensidade para cada um.
   NOTA: Deve-se notar que os tempos de exposição ideais, os níveis de ganho e as intensidades da fonte de luz são frequentemente derivados empiricamente da experiência deste trabalho para minimizar a supersaturação no repórter de fluorescência, minimizar danos celulares e capturar imagens adequadas para análise qualitativa e quantitativa. Ao determinar os níveis de cada um desses parâmetros, os aspectos a serem mente incluem maximizar as relações sinal-ruído, minimizar a fototoxicidade, minimizar a supersaturação de sinais de fluorescência e aumentar a capacidade de amplificar sinais fracos de fluorescência.
   1. Otimizar esses parâmetros grosseiramente ad-hoc; no entanto, valores experimentais anteriores (por exemplo, intensidade de fonte de luz causando a supersaturação do repórter de fluorescência) podem guiar futuras configurações experimentais quando aplicável. Por exemplo, as configurações de ganho, os tempos de exposição e os valores iniciais de intensidade da luz de um circuito (LITer1.0) ou configuração experimental (por exemplo, intensidade de luz) podem ser usados como ponto de partida quando se movem para um circuito genético semelhante, mas diferente (LITer2.0)¹¹ ou uma modalidade de luz diferente (por exemplo, ciclo de serviço de luz).
6. Simplifique a imagem da placa por um modelo de coordenada programado no software de microscopia permitindo que todo o tamanho da placa (por exemplo, 24 poços) tenha a aquisição automatizada de imagens de vários locais de imagem por poço.

5. Citometria de fluxo de células projetadas induzidas pela luz

1. 24-72 h pós-indução, remova as células do LPA na incubadora ou do microscópio após a imagem e coloque-as na capa da cultura tecidual.
2. Se for removido diretamente do LPA, remova a tira de papel alumínio e deixe a placa sentar por um minuto ou dois.
3. Aspire a mídia de cada poço (de toda a placa de 24 poços se todos os poços forem usados).
4. Adicione 100 μL de 0,25% de trippsina a cada poço, cubra a placa com uma tampa plástica e coloque-a de volta na incubadora.
5. Deixe as células imperturbáveis na incubadora por 5 minutos.
6. Depois de 5 minutos, remova a placa e devolva-a ao capô da cultura tecidual.
7. Neutralize cada trypsinized bem com 400 μL de DMEM.
8. Rotule um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL com coador de células (ou tubo de citometria de fluxo apropriado que pode ser filtrado para remover grandes aglomerados de células não totalmente experimentadas) com um nome correspondente a cada poço.
9. Use uma pipeta P1000 para pipetizar o conteúdo de cada poço para cima e para baixo 6-8 vezes para quebrar aglomerados celulares e criar amostras unicelulares para citometria ^{de fluxo49}.
10. Transfira todo o conteúdo de cada poço (~500 μL) para os tubos rotulados com o coador.
11. Leve as células ao instrumento de citometria de fluxo apropriado com lasers dos comprimentos de onda corretos (pode trazer tubos com células dentro ou fora do gelo).
    NOTA: O citómetro de fluxo utilizado neste trabalho fazia parte de uma instalação central localizada no hospital universitário.
12. Crie um portão de dispersão para a frente e para o lado (FSC e SSC, respectivamente) para capturar as células únicas do tamanho e granularidade apropriados para excluir detritos e aglomerados celulares no software de citometria de fluxo.
13. Uma vez que o portão esteja pronto, capture aproximadamente 10.000 células com o portão apropriado. Ajuste esse número dependendo da quantidade de dados celulares que os usuários estão buscando. Repita para cada tubo contendo as células do experimento.
14. Uma vez que o experimento esteja concluído, importe os dados para o software de dados de citometria de fluxo disponível para análise.
15. Crie um portão FSC-SSC (como antes durante a aquisição) e aplique-o a cada lote de dados experimentais. Um poço de referência da população celular não induzida é usado para criar este portão neste manuscrito, mas existem outras métricas para a criação de portão, como portões baseados em densidade.
16. Com as condições experimentais fechadas com um portão FSC-SSC, plote os dados de citometria de fluxo como histogramas ou represente de outras maneiras para ilustrar os padrões de expressão obtidos. Neste experimento, a fluorescência foi capturada pelos canais GFP/FITC ou PE/TexasRed.

6. Extração de RNA e PCR quantitativo de componentes do circuito genético

1. 24-72 h pós-indução, remova as células do LPA na incubadora ou do microscópio após a imagem e coloque-as na capa da cultura tecidual.
2. Se for removido diretamente do LPA, remova a tira de papel alumínio e deixe a placa sentar por um minuto ou dois.
3. Aspire a mídia de cada poço (de toda a placa de 24 poços se todos os poços forem usados).
4. Prossiga para extrair RNA das células usando o kit de extração de RNA apropriado.
5. Uma vez concluída a extração do RNA, realize uma reação de transcrição reversa de cada amostra (Tabela 3).
6. Além disso, realize o PCR quantitativo de cada amostra (Tabela 4). Utilize uma polimerase de DNA e protocolo associado para configurar reações pcr. Para este passo, configure uma reação multiplexada com um gene de limpeza e um gene de interesse, ou crie reações separadas. Neste exemplo, foram sondados os níveis de GFP, KRAS e glicealdeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Após concluir o experimento qRT-PCR, proceda com a análise via software disponível para ilustrar a mudança da dobra do circuito genético no nível rna.

7. Imunofluorescência de componentes do circuito genético

1. Use um banho de gelo ou um freezer para esfriar o metanol.
2. 24-72 h pós-indução, remova as células do LPA na incubadora ou do microscópio após a imagem e coloque-as na capa da cultura tecidual.
3. Se for removido diretamente do LPA, remova a tira de papel alumínio e deixe a placa sentar por 1-2 min.
4. Aspire a mídia de cada poço (de toda a placa de 24 poços se todos os poços forem usados).
5. Adicione 100 μL de 0,25% de trippsina a cada poço, cubra a placa com uma tampa plástica e coloque-a de volta na incubadora.
6. Deixe as células imperturbáveis na incubadora por 5 minutos.
7. Depois de 5 minutos, remova a placa e devolva-a ao capô da cultura tecidual.
8. Neutralize cada trypsinized bem com 400 μL de DMEM.
9. Rotule tubos de mini-centrífugas com nomes correspondentes a cada poço.
10. Use uma pipeta P1000 e pipeta o conteúdo de cada poço para cima e para baixo 6-8 vezes para quebrar os aglomerados celulares.
11. Transfira todo o conteúdo de cada poço (~500 μL) para os tubos rotulados.
12. Centrifugar as células por 5 min a 400 x g.
13. Quando estiver completo, descarte o sobrenaspeuta e mova as amostras para um capô de fumaça química.
14. Resuspend as células (use uma pipeta P1000 e pipeta para cima e para baixo 6-8 vezes em cada tubo para quebrar aglomerados celulares) em 750-1000 μL de 4% de paraformaldeído (diluído em soro fisco tamponado de fosfato, PBS).
15. Deixe as células sentarem por 15 minutos à temperatura ambiente.
16. Após a incubação, adicione 750-1000 μL de PBS. Pipeta para cima e para baixo várias vezes.
17. Centrifugar as células por 5 min a 400 x g.
18. Quando estiver completo, descarte o sobrenaspeuta e mova as amostras para um capô de fumaça química.
19. Resuspend as células (use uma pipeta P1000 e pipeta para cima e para baixo 6-8 vezes em cada tubo para quebrar aglomerados de células) em 750-1000 μL de metanol gelado.
20. Deixe as células sentarem por 30 minutos no gelo ou em um congelador de -20 °C.
21. Após a incubação, adicione 750-1000 μL de PBS. Pipeta para cima e para baixo várias vezes.
22. Centrifugar as células por 5 min a 400 x g.
23. Quando estiver completo, descarte o sobrenaspeuta e mova as amostras para um capô de fumaça química.
24. Dependendo do tipo de anticorpos utilizados, modifique o protocolo a partir deste ponto. Siga os passos 7.24.1-7.24.14 ou 7.24.15-7.24.22.
    1. Se usar um anticorpo primário e secundário, resuspenja as células usando uma pipeta P1000/P200 e pipeta para cima e para baixo 6-8 vezes em cada tubo para quebrar aglomerados celulares em 100 μL de anticorpo primário. Neste caso, foi feita uma diluição de 1:800 para anticorpos de estoque, incluindo anticorpo KRAS ou anticorpo ERK, e foi permitido sentar-se por 1h à temperatura ambiente. Os anticorpos foram diluídos em um tampão de incubação feito de 1x PBS com 0,5 g de BSA.
       NOTA: Determine a diluição exata do anticorpo empiricamente criando uma curva padrão de diluições de anticorpos versus o antígeno de interesse.
    2. Depois de adicionar anticorpos, cubra os tubos com uma folha para evitar efeitos de luz em anticorpos rotulados.
    3. Após a incubação, adicione 750-1000 μL do buffer de incubação. Pipeta para cima e para baixo várias vezes.
    4. Centrifugar as células por 5 min a 400 x g.
    5. Quando estiver completo, descarte o sobrenaspeuta e mova as amostras para um capô de fumaça química.
    6. Resuspenja as células usando uma pipeta P1000/P200 e pipeta para cima e para baixo 6-8 vezes em cada tubo para quebrar aglomerados de células em 100 μL de anticorpo secundário. Neste caso, as células foram resuspended em 100 μL anticorpo secundário a uma diluição de 1:800 para anticorpo KRAS ou 1:2000 para anticorpo ERK e permitido sentar-se por 30 minutos à temperatura ambiente. Semelhante aos anticorpos primários, diluir os anticorpos secundários no tampão de incubação descrito acima. Determinar as diluições dos anticorpos secundários com base nos achados empíricos de uma curva padrão.
    7. Após adicionar anticorpos, cubra os tubos com uma folha para evitar efeitos de luz nos anticorpos rotulados.
    8. Após a incubação, adicione 750-1000 μL do buffer de incubação. Pipeta para cima e para baixo várias vezes.
    9. Centrifugar as células por 5 min a 400 x g.
    10. Quando estiver completo, descarte o sobrenaspeuta e mova as amostras para um capô de fumaça química.
    11. Resuspenja as células usando uma pipeta P1000 e pipeta para cima e para baixo 6-8 vezes em cada tubo para quebrar aglomerados de células em 500 μL de PBS.
    12. Transfira todo o conteúdo de cada tubo (~500 μL) para os tubos rotulados com coador.
    13. Leve as células para instrumentos de citometria de fluxo apropriados com lasers dos comprimentos de onda corretos (pode trazer tubos com células dentro ou fora do gelo).
        NOTA: Deve-se notar que ter vários controles são importantes para o progresso com a medição da citometria de fluxo e análise da expressão genética celular projetada. Por exemplo, tendo células completamente manchadas, células manchadas apenas com anticorpos primários, e células manchadas apenas com anticorpos secundários podem ser úteis para comparar resultados com sinais de fundo de anticorpos.
    14. Em seguida, prossiga com a análise conforme descrito na seção 5.
    15. Se usar apenas um anticorpo primário, resuspenja as células usando uma pipeta P1000/P200 e pipeta para cima e para baixo 6-8 vezes em cada tubo para quebrar aglomerados celulares em 100 μL de anticorpo primário rotulado. Determine a diluição adequada do anticorpo e incubar por 1h à temperatura ambiente. Determine a diluição do anticorpo da curva padrão empiricamente.
    16. Depois de adicionar anticorpos, cubra os tubos com uma folha para evitar efeitos de luz em anticorpos rotulados.
    17. Após a incubação, adicione 750-1000 μL do buffer de incubação. Pipeta para cima e para baixo várias vezes.
    18. Centrifugar as células por 5 min a 400 x g.
    19. Resuspenja as células usando uma pipeta P1000 e pipeta para cima e para baixo 6-8 vezes em cada tubo para quebrar aglomerados de células em 500 μL de PBS.
    20. Transfira todo o conteúdo de cada tubo (~500 μL) para tubos rotulados com coador.
    21. Leve as células para instrumentos de citometria de fluxo apropriados com lasers dos comprimentos de onda corretos (pode trazer tubos com células dentro ou fora do gelo).
        NOTA: Deve-se notar que ter vários controles são importantes para o progresso com a medição da citometria de fluxo e análise da expressão genética celular projetada. Ter células completamente não manchadas e células manchadas apenas com anticorpos primários são úteis para comparar resultados com sinais de fundo de anticorpos.
    22. A partir deste ponto, prossiga com a análise conforme descrito na seção 5.

Representative Results

O conjunto do circuito genético e a geração de linhas de células estáveis neste artigo foram baseados em células HEK-293 comerciais e modificadas contendo um local FRT ativo transcricionalmente e único estável (Figura 1). Os circuitos genéticos foram construídos em vetores que tinham locais FRT dentro do plasmídeo, permitindo a integração Flp-FRT no genoma celular HEK-293. Essa abordagem não se limita às células Flp-In, pois os sites FRT podem ser adicionados a qualquer linha de interesse celular em qualquer lugar do genoma usando tecnologia de edição de DNA, como CRISPR/^Cas950.

Uma vez construídas e validadas linhas celulares apropriadas para a inserção correta, o software LPA e IRIS foram escolhidos como um protocolo padronizado para indução de luz da expressão ^{genética31,51}. O sistema LPA permite que 24 poços sejam programados para a indução de células mamíferas em múltiplas condições experimentais, dependendo da intensidade da luz, duração do pulso e ciclo de serviço (Figura 2). Dentro deste artigo, foram priorizadas intensidade de luz espacialmente uniforme, duração do pulso e ciclo de serviço. No entanto, os pesquisadores podem usar o software IRIS e o LPA para uma programação mais avançada de padrões de ondas de luz temporal.

Um aspecto crucial sobre o LPA a ser abordado antes de iniciar experimentos é a calibração óptica que pode ser realizada para dispositivos únicos ou múltiplos. O método de análise de imagem anteriormente ^descrito31 usado para calibração requer uma imagem de toda a LPA com todos os LEDs de interesse ligados, que podem ser adquiridos a partir de uma variedade de ^fontes52, incluindo um imager de gel. Aqui, um scanner de computador foi usado para aquisição de imagens (Figura 3A). Uma vez que a imagem foi adquirida, o software de código aberto criado por Gerhardt et al. (2016)³¹ foi usado para calcular valores de compensação para cada LED para garantir que cada LPA emita a mesma intensidade a um determinado valor de escala de cinza. O software subtrai o sinal de fundo, limiar a imagem em uma categoria binária e calcula a intensidade do pixel (Figura 3B). A partir da calibração, foi encontrada uma variação mínima entre os LEDs, com um CV de 0,04 entre 96 poços (ou 4 placas calibradas, Figura 3C). Por fim, o software de calibração demonstrou a variação do LED por localização (Figura 3D) e criou um ajuste em escala de cinza (Figura 3E) para que cada LED seja normalizado com a mesma intensidade.

Além da calibração, outros aspectos importantes do uso do LPA incluem a integração de vários controles no pipeline experimental que podem minimizar erros sistêmicos limitando variáveis de confusão, como efeitos de toxicidade da luz e limitações de design baseadas em materiais experimentais. Por exemplo, a Figura 4 ilustra duas configurações diferentes para programar diferentes intensidades de luz nos poços LPA. O primeiro subpanel da Figura 4A mostra uma organização ascendente de intensidade de luz. Isso pode facilitar a programação e a análise de dados, mas pode produzir efeitos de borda onde a linha inferior do LPA tem a maior intensidade de luz e pode potencialmente causar indução indesejada de calor e luz de poços próximos. Da mesma forma, no segundo subpanel da Figura 4A, uma matriz de randomização foi aplicada ao software IRIS, criando várias intensidades de luz em posições aleatórias. Isso pode minimizar influências sistêmicas dos efeitos da borda. Uma matriz descrambled (Figura 4B) é criada com o software IRIS, que pode então ser utilizado para determinar as condições experimentais após a conclusão do experimento e durante a análise. Semelhante à randomização de poços, os usuários também devem estar cientes dos efeitos da toxicidade da luz que podem ocorrer (luz azul dentro deste trabalho). Na Figura 4C, duas intensidades de luz diferentes usadas para a indução de circuito genético são mostradas com o mesmo portão FSC-SSC baseado na população não induzida de células projetadas. Como tal, os usuários devem realizar uma dose-resposta na modalidade leve de interesse (por exemplo, pulso, ciclo de dever, etc.) para determinar efeitos de toxicidade da luz que podem ocorrer na extremidade alta da exposição (Figura 4D). Aqui, o aumento dos níveis de luz azul causou detritos celulares dependentes de doses, células mortas e aglomerados em comparação com células não estimuladas. Como tal, a intensidade contínua da luz foi restrita a cerca de 3/4 da intensidade máxima de LPA (~3000 g.s. unidades).

Uma vez configurada a instalação do equipamento adequado, a expressão genética foi então induzida em circuitos genéticos LITer projetados através de microscopia de fluorescência (Figura 5). As células foram induzidas em diferentes durações de pulso de luz no LPA, o que deu uma leve dose-resposta da expressão genética no nível populacional. As células dentro deste trabalho foram imagens para a expressão GFP usando 50 ms para tempo de exposição da fonte de luz FITC/GFP e para imagens de campo brilhante usando 1-5 ms para tempo de exposição de contraste de fase. Dada a robustez deste protocolo de engenharia de linha celular, qualquer marcador de fluorescência poderia ser usado em vez de GFP. As células podem ser induzidas com múltiplos regimes de luz e produzir uma grande gama de respostas (Figura 5). Este último é benéfico no controle da expressão de genes funcionais (por exemplo, KRAS (G12V) oncogene no trabalho ^original53).

Imediatamente após a microscopia de fluorescência, as células poderiam ser analisadas em uma variedade de protocolos experimentais, incluindo citometria de fluxo, qRT-PCR e imunofluorescência. Neste trabalho, a citometria de fluxo foi realizada como primeiro procedimento de validação e realizada seguindo os métodos descritos acima (Figura 6). Semelhante à microscopia, as células foram induzidas em diferentes valores de comprimento do pulso, e mostraram uma dose-resposta da expressão genética de mais de quatro vezes a alteração de estados não induzidos no nível populacional (Figura 6A-B). Da mesma forma, a redução do ruído da expressão genética pode ser demonstrada comparando vários valores de intensidade de luz (Figura 6C-D) para o sistema LITer versus um sistema de regulação positiva (sem feedback) como o VVD/^LightOn54. Ao comparar o LITer com o sistema VVD, o feedback negativo alcança mais de cinco vezes a redução de ruído de expressão genética. As mesmas células pré-induzidas imagens em microscopia também poderiam ser analisadas via qRT-PCR (Figura 7). Semelhante à citometria de fluxo, as células LITer projetadas poderiam expressar os níveis de RNA de forma responsiva de dose (mais de 10 vezes a indução de estados não induzidos), correspondendo à dose-resposta dos níveis de proteína quantificados pela expressão GFP na citometria de fluxo. Os dados de microscopia de fluorescência e citometria de fluxo mencionados podem ser calibrados usando células não fluorescentes, expressando constitutivamente células fluorescentes e contas de validação fluorescentes de 6 a 8 picos (por exemplo, contas verdes e fluorescentes do canal FL1). Cada um desses componentes pode permitir a normalização da expressão genética em um único experimento. No entanto, esses fatores também podem permitir a normalização de circuitos e células projetadas em diferentes placas experimentais, condições experimentais e dias para permitir a comparação e padronização dos dados de expressão genética.

Por fim, os circuitos genéticos LITer podem ser projetados para expressar genes funcionais, como o KRAS (G12V, Figura 8). A versatilidade deste pipeline permite que os usuários utilizem a arquitetura LITer com engenharia celular para qualquer gene funcional de interesse, possivelmente incorporando arquiteturas adicionais, como feedback positivo. O LITer mostrou quantidades crescentes de luz azul que resultaram em aumento dos níveis de produção do circuito genético (KRAS (G12V) e, consequentemente, níveis fosforilados-ERK, ambos podem ser quantificados através de ensaios de imunofluorescência.

Fragmento	Relação	Tamanho (bp)	Concentração de peso do fragmento de DNA (ng/μL)	Concentração molar de fragmento de DNA (fmol/μL)	Volume (μL)	Massa molar de DNA resultante (fmol)
Fragmento de Vetor mãe 1	1	3414.00	18.20	8.63	4.09	35.29
Fragmento de Vetor mãe 2	1	4642.00	18.10	6.31	5.59	35.29
Gene de Interesse	1	549.00	37.90	111.70	0.32	35.29
Total					10.00	105.87

Tabela 1: Cálculo do mix mestre da reação de montagem de DNA (etapa 1.13). As colunas 2 e 3 baseiam-se no tamanho dos fragmentos de DNA montados e na concentração desses fragmentos após a amplificação do PCR e extração de gel de agarose (etapa 1.11). A célula inferior da ^4ª coluna (volume total de reação) pode ser modificada; no entanto, recomenda-se o volume declarado. Células não sombreadas são geradas automaticamente.

0	100	200	400	500	750
1500	3000	0	100	200	400
500	750	1500	3000	0	100
200	400	500	750	1500	3000

Tabela 2: Programação IRIS de intensidades de luz (g.s.) para experimento de indução de luz em uma placa de 24 poços com três réplicas (passo 3.4). Distribuição de intensidades de luz variando de 0 a 3000 g.s. G.s.-unidades em escala de cinza. Isso pode ser randomizado pelo software IRIS conforme necessário.

	Amostra 1	Amostra 2	Amostra 3
Volume de mixagem mestre de transcriptase reversa (μL)	4.00	4.00	4.00
Modelo de RNA (1000 ng) Volume (μL)	2.00	3.00	4.00
Volume NF-H20 (μL)	14.00	13.00	12.00
Volume Total (μL)	20.00	20.00	20.00

Tabela 3: Cálculo do mix mestre de transcrição reversa (etapa 6.5). A reação recomendada volume total é de 20 μL, e seus componentes são o mix mestre da enzima transcriptase reversa (aqui: 5x), modelo de RNA e água sem nuclease. Neste exemplo, as concentrações de RNA das amostras 1, 2 e 3 são 500, 333 e 250 ng/μL, respectivamente.

	Amostra 1	Amostra 2	Amostra 1 e 2 Multiplexed
Volume da sonda GFP (μL)	1	-----	1
Volume da sonda GAPDH (μL)	------	1	1
Volume de mistura mestre de polimerase de DNA (μL)	10	10	10
cDNA (100 ng) Volume (μL)	2	2	2
Volume NF-H20 (μL)	7	7	7
Volume Total (μL)	20	20	20

Tabela 4: Cálculo do mix mestre do PCR quantitativo (etapa 6.6). A reação recomendada volume total é de 20 μL e seus componentes são a mistura mestre da enzima polimerase de DNA (aqui: 2x), sondas GFP e/ou GAPDH, cDNA (100 ng total) e água livre nuclease (_NF-H20).

Figura 1: Projeto de circuito e engenharia celular. (A) Ferramentas de engenharia celular, incluindo circuito genético sintético LITer com locais de integração FRT, enzima recombinase (Flp recombinase) para integração de circuitos, droga usada para seleção de clones genéticos apropriados e linha celular de interesse usada para criar linhas de células mamárias optogenéticas desejadas. (B) Sistemas genéticos projetados podem ser integrados em um local específico de FRT contendo lócus dentro do genoma humano. Estes loci genômicos podem então expressar resistência a antibióticos específicos ou genes fluorescentes para seleção de fitas genéticas devidamente integradas. A integração do circuito genético pode ser iniciada com o uso de recombinases que reconhecem locais específicos dentro do genético original. Isso introduz um novo gene de seleção de resistência a medicamentos que pode garantir a geração de células corretamente projetadas com o circuito genético desejado. Na parte inferior do painel B está a arquitetura do circuito genético para o sistema de feedback optogenético negativo, LITer2.0. Este circuito é composto por uma proteína TetR auto-reprimida fundida com um domínio de sensoriamento de temporização de luz -oxigênio (LOV2), uma sequência de linker P2A que permite uma transcrição multicistrônica, e GFP. Quando a luz azul é aplicada, a sequência TIP abre a partir do domínio LOV2, inibindo a proteína TetR, e permitindo uma transcrição aumentada e responsiva de dose tanto do TetR quanto do repórter GFP. A proteína TetR inibida é incapaz de ligar e reprimir no local do operador de DNA, aumentando assim a transcrição. Este feedback negativo mantém o ruído da expressão genética baixo e permite uma mudança de expressão genética em alta. FRT - alvo de reconhecimento de flip, HygR - resistência à hisgromicina, LacZ - β-galactosidase, ZeoR - resistência à zeocina, T - TetR, proteína repressora tetraciclina, D2ir é um promotor baseado em CMV com locais TwtO, LOV2 é domínio de sensor de temporização de oxigênio leve, TIP é peptídeo inibidor de tet que inibe a proteína TetR. Este número foi modificado de Guinn e Balázsi (2020)⁵⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Programação experimental LPA. (A) Os experimentos podem ser programados usando as ferramentas listadas no site do laboratório ^Tabor47 com flexibilidade para programação LPA de estado estável, dinâmica ou ^avançada31. Além disso, arquivos eletrônicos podem ser salvos para uso futuro para réplicas técnicas ou indução experimental de linhas celulares alternativas. (B) Dispositivo LPA com componentes principais visualizados a partir da parte superior e lateral (C). (D) Imagens de placas seladas com papel alumínio para residir em LPA. LPA - Aparelho de placa leve, LED - diodo emissor de luz. Elementos dessa figura foram modificados a partir de Guinn (2019)¹¹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Calibração do aparelho de placa de luz. (A) Imagem representativa de LPA para LEDs definida para 2000 g.s. com base no software IRIS. (B) Imagem do painel (A) com fundo subtraído e limiar usado para binarizar a imagem para calcular a intensidade do pixel de cada LED. (C) Histograma de intensidades de pixels (determinado pela análise de imagem DO MATLAB) de 96 LEDs (4 placas LPA) definidos para o mesmo valor de software IRIS (por exemplo, 2000 g.s.). A linha vermelha representa a intensidade média do pixel LED, e cv no painel representa o coeficiente de variação para os 96 poços. (D) Mapa de calor mostrando as intensidades de LED da imagem LPA no painel (A) normalizadas até o LED de intensidade máxima. (E) Mapa de calor de valor de calibração determinado para a imagem LPA no painel (A) para criar produção de intensidade igual para cada LED quando programado para o LPA. LPA - Aparelho de placa leve, LED - diodo emissor de luz, CV - coeficiente de variação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Randomização de LPA e efeitos de toxicidade da luz. (A) Imagem representativa de duas configurações de LED LPA programáveis definidas de 25 a 4000 g.s, com base no software IRIS. A primeira configuração é mais provável de permitir que erros sistemáticos, como efeitos de borda de calor e luz, cruzem (por exemplo, a linha inferior do LPA afetando a ^2ª linha mais baixa). A segunda imagem randomiza a localização das intensidades, minimizando assim o erro sistemático (viés) causado por efeitos de borda. (B) Matriz que mostra o local de randomização para intensidades de luz no LPA mostrado no painel (A), que pode ser usado para determinar os resultados dependentes da intensidade de um determinado experimento. (C) Dados de citometria de fluxo para duas intensidades de luz diferentes (1250 e 4000 g.s.) durante 3 dias de indução em iluminação contínua. O portão preto é baseado em células não induzidas. (D) Gráfico de barras mostrando dados de citometria de fluxo, como painel (C), mas para uma ampla gama de intensidades de luz. LPA - Aparelho de placa leve, FSC - dispersão para a frente, SSC - dispersão lateral, g.s. - valor de intensidade de luz medido em escala de cinza. As células ^LITer11 apresentaram uma diminuição responsiva da dose na sobrevida celular que foi estatisticamente significante usando o teste de cauda ANOVA 1 com um valor p de 0,0022. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagens representativas de microscopia de linhas celulares optogenéticas projetadas. As células foram imagens em um microscópio invertido com uma câmera (14 bits) para a aquisição de contraste de fase e imagem de fluorescência. As células foram expostas para 5 ms para contraste de fase (Painel A, imagem representativa de campo brilhante) e 50 ms para aquisição de GFP/FITC (Painel B) com intensidade de fonte de luz de 100%. As células podem ser imagens em vários pontos de tempo, dependendo da aquisição de estado estável desejada ou da resposta dinâmica, levando a um estado estável. As células aqui representam uma titulação de duração do pulso em intensidade fixa (1000 g.s.) que vai desde nenhuma exposição à luz até 3 dias de exposição à luz. O g.s unitário representa um valor de intensidade leve medido em escala de cinza. Esse valor foi modificado a partir de Guinn (2019)¹¹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Citometria de fluxo de linhas celulares optogenéticas projetadas. As células foram analisadas em um citômetro de fluxo BD LSRFortessa, com aproximadamente 10.000 células coletadas dentro de um portão SSC-FSC (dispersão lateral). As células foram então analisadas com o software FCS Express. Histograma ou parcelas de dispersão poderiam ser geradas para quantificar a expressão do gene de interesse (por exemplo, GFP). (A) Células projetadas plotadas em eixos SSC-FSC para gating dentro da linha preta. (B) Células LITer representativas induzidas com duração variável de pulsos de luz a 1000 g.s. até 72 h de indução, ilustrando dose-resposta da expressão genética. (C) Dados representativos de dose-resposta para titulação de intensidade de luz comparando o circuito genético LITer (sistema baseado em TIP) versus sistema VVD ou ^LightOn40, que é um sistema de regulação positivo sem feedback. (D) Histograma correspondente ao sistema VVD, ilustrando distribuição mais ampla (e, portanto, maior ruído de expressão genética) em comparação com o sistema LITer. CV é o coeficiente de variação, uma métrica para o ruído da expressão genética. FSC - dispersão para a frente, SSC - dispersão lateral, FITC - isothiocnato fluoresceína, g.s. - valor de intensidade de luz medido em escala de cinza. Esse valor foi modificado a partir de Guinn (2019)¹¹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: PCR quantitativo em tempo real de linhas celulares optogenéticas projetadas. Dados representativos mostrando que múltiplos níveis de expressão genética podem ser induzidos e quantificados usando a luz como estímulo. A unidade Rq representa quantificação relativa da troca de expressão em comparação com o controle. As células ^LITer11 apresentaram um aumento de dose responsiva na expressão de RNA que foi estatisticamente significante usando o teste de cauda ANOVA com um valor p de 0,0352 e 0,0477 para os níveis de GFP e KRAS, respectivamente. Esse valor foi modificado a partir de Guinn (2019)¹¹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Imunofluorescência de linhas celulares optogenéticas projetadas. Dados representativos que mostram estimativas de nível de proteína com base na imunofluorescência. (A) Níveis de proteína dos níveis de proteína KRAS(G12V) e (B) de fosfoilado-ERK, que o circuito genético LITer induz de acordo com o aumento das quantidades de luz direta e indiretamente, respectivamente. Os dados mostrados nas barras são valores médios, barras de erro são desvio padrão (n = 3). A.U. - unidades arbitrárias, g.s. - valor de intensidade de luz medido em escala de cinza. As células ^LITer11 apresentaram um aumento de dose responsiva nos níveis de proteína que foi estatisticamente significativo usando o teste de cauda ANOVA com um valor p de 2,79E-04 e 0,016 para os níveis KRAS e fosforylated-ERK, respectivamente. Esse valor foi modificado a partir de Guinn (2019)¹¹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Os leitores deste artigo podem obter insights sobre os passos vitais para caracterizar circuitos genéticos optogenéticos (bem como outros sistemas de expressão genética), incluindo 1) projeto de circuito genético, construção e validação; 2) engenharia celular para a introdução de circuitos genéticos em linhas celulares estáveis (por exemplo, recombinação Flp-FRT); 3) indução das células projetadas com uma plataforma baseada em luz, como a LPA; 4) caracterização inicial de ensaios de indução de luz via microscopia de fluorescência; e 5) caracterização final da expressão genética com uma variedade de ensaios, incluindo citometria de fluxo, PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) ou ensaios de imunofluorescência.

Além disso, os métodos descritos acima são altamente modulares para essencialmente qualquer arquitetura de circuito genético expressando genes de interesse, com as principais modificações potenciais do protocolo na etapa de construção do circuito e os ensaios realizados. No caso da construção de circuitos genéticos, a flexibilidade da clonagem molecular permite que qualquer gene de interesse seja trocado ou co-expresso com um marcador de fluorescência com pequenas modificações no projeto de primer ou protocolos de montagem. Além disso, enquanto os procedimentos aqui descritos se concentram principalmente em um projeto de circuito genético NF para controle preciso (de baixo ruído) da expressão genética, outras arquiteturas como regulação positiva ou feedback positivo (PF) podem ser implementadas para alcançar diferentes características, como mudança de alta dobra ou ruído de alta expressão genética, ^{respectivamente56,57} . O uso de uma variedade de arquiteturas de circuitos genéticos (por exemplo, PF, NF, etc.) pode permitir que os pesquisadores explorem diversas questões biológicas, como as funções de magnitudes de nível de proteína e o ruído na resistência a medicamentos ou metástase58. Os protocolos listados aqui também se concentram em várias formas de quantificação da expressão genética, mas qualquer número de ensaios funcionais (por exemplo, motilidade celular, cicatrização de feridas, proliferação, etc.) pode ser adicionado após a aquisição de microscopia com pouco ou nenhum efeito sobre os métodos anteriores. Isso é especialmente relevante para estudos unicelulares onde a optogenética pode usar indução espástica para estudar comportamentos como a dinâmica da expressão ^pulsante59.

Complementando a modularidade do método, a solução de problemas é outra característica importante de cada protocolo principal. Para a construção de circuitos, as principais diferenças residem no design específico do primer do circuito, enquanto métodos posteriores como montagem e amplificação plasmida através do crescimento bacteriano são mais padronizados e normalmente incluem seus próprios procedimentos extensivos de solução de problemas. A engenharia celular pode ser modificada com curvas de titulação de drogas, dependendo da linha celular utilizada. Além disso, se uma linha de células comerciais for usada, guias de solução de problemas podem ser obtidos diretamente do fabricante da linha celular. Além disso, efeitos de luz não intencionais são importantes para quantificar nas linhas celulares projetadas. Por exemplo, devido aos efeitos fototóxicos de 470 nm de luz, uma curva de intensidade leve deve ser criada para investigar a indução de morte ou dano em uma população. Uma vez que uma variedade de valores de luz são testados, os usuários podem criar um portão FSC-SSC ou utilizar um método como a coloração de iodeto de propídio para quantificar células mortas/danificadas e, portanto, servir como uma ferramenta para determinar faixas de luz apropriadas para usar experimentalmente.

Para solução de problemas LPA, os LEDs podem produzir efeitos de borda de luz e mira de calor com poços adjacentes. Por exemplo, poços de alta intensidade podem causar alguma indução em poços adjacentes se houver uma vedação inadequada ou um grande gradiente calor/luz entre os poços. Esses efeitos podem ser máximos se o LPA estiver programado em uma determinada ordem (por exemplo, ascendente/descendente) de um parâmetro de luz. Para combater isso, o software IRIS permite que os usuários empreguem uma matriz de randomização para randomizar as intensidades do poço e, portanto, reduzir erros sistemáticos. Para a solução de problemas aspectos da microscopia de fluorescência, tempo de exposição, ajustes de ganho (controle da sensibilidade da câmera) e intensidade da fonte de luz são os principais parâmetros que podem ser ajustados. A sintonia desses parâmetros pode permitir uma produção de imagem ideal e relações ideais de sinal para ruído, bem como evitar a supersaturação e fototoxicidade.

Para solução de problemas de citometria de fluxo, tensões de tubo fotomultiplier e gating celular são os principais aspectos que podem ser ajustados. A sintonia desses parâmetros pode permitir comparações ideais entre condições experimentais e amostras de controle, aquisição adequada de sinal para sinais fracos ou fortes de fluorescência e exclusão de detritos celulares ou populações de células indesejadas. Deve-se notar que as tensões de citometria de fluxo são idealmente mantidas constantes em todos os experimentos para permitir comparações adequadas. Além disso, para sistemas optogenéticos que requerem múltiplas saídas de fluorescência (por exemplo, FITC e PE), os usuários precisarão estar cientes da compensação da fluorescência dada a conversa cruzada entre fluoroforos. Nesses cenários, os controles são cruciais para determinar sinais adequados de fluorescência. Os controles que serão necessários para que os usuários realizem incluem contas fluorescentes, células manchadas com o marcador de interesse, ou células que expressam constitutivamente a proteína da fluorescência que pode ser usada para criar uma matriz de compensação no software de citometria de fluxo de interesse. Além disso, seja usando um marcador de fluorescência ou mais, todos os usuários devem medir rotineiramente sinais de fluorescência de cada marcador para células não fluorescentes, que produzem sinais de autofluorescência/fundo. qRT-PCR solução de problemas inclui diferentes quantidades de CDNA e design de teste, que muitas vezes são específicos do projeto. Por fim, para a solução de problemas de imunofluorescência, as concentrações de anticorpos são a maior variável para quantificação de ensaios, exigindo uma ótima determinação de concentração.

Um aspecto de solução de problemas que é relevante para a maioria dos métodos acima é o efeito de isolamento do uso de uma placa selada com células cobertas com papel alumínio. Este método pode impedir a troca de gás carbônico necessária para o crescimento adequado de várias linhas celulares. A partir da experiência experimental anterior, este não foi um impedimento significativo para o crescimento celular para um experimento de 3-5 dias usando as linhas celulares projetadas dentro deste manuscrito, mas pode se tornar importante para outras linhas celulares ou durações experimentais. Para resolver essa preocupação, uma adaptação implementada com as placas lacradas inclui o uso de mídia independente de dióxido de carbono, o que não afetou o crescimento das células utilizadas neste estudo. Deve-se notar para outros ensaios ou linhas celulares onde metabolismo, níveis de pH e densidades celulares são importantes, outras intervenções podem ser necessárias, como a mudança de mídia ou nutrientes com mais frequência.

Os limites dos métodos aqui descritos residem no circuito genético utilizado, na precisão da tecnologia optogenética e na interface LPA com outros equipamentos, como microscópios de fluorescência. A tecnologia descrita aqui é acessível, rápida de construir e fácil de ^validar46 para populações de células optogeneticamente projetadas. No entanto, existem certas limitações espaciais, como a incapacidade de controlar células únicas sem modificações na configuração de indução de luz, como a utilização de dispositivos espelho digitais (DMDs), com benefícios recentemente demonstrados em células ^vivas60,61. Além disso, os métodos aqui descritos são limitados no rastreamento de células vivas durante a estimulação optogenética, permitindo apenas a aquisição de dados de ponto final de todo o curso de tempo experimental.

Apesar desses limites, os métodos optogenéticos aqui descritos são complementares à tecnologia existente, como as DMDs, que têm a flexibilidade de controlar células únicas em tempo real, mas são limitadas pelo número de amostras que se pode estimular. Além disso, os métodos de engenharia de linhas celulares estáveis discutidos aqui contrastam os métodos de biologia sintética existentes que muitas vezes caracterizam sistemas genéticos modificados através de transfecções transitórias. As abordagens transitórias de transfecção são inerentemente mais ruisas devido à maior variação do número de cópias do circuito genético entre as células. Em contraste, os métodos aqui apresentados envolvem variantes de células monoclonais, cada uma contendo uma cópia de circuito genético. Linhas celulares estáveis permitem explorar aspectos celulares, como variação da expressão genética, efeitos do nível de proteína em paisagens fenotípicas e métodos unicelulares com maior precisão, uma vez que há maior confiança de que cada célula é idêntica aos seus vizinhos.

O trabalho aqui demonstra uma plataforma para projetar qualquer circuito genético optogenético genomicamente integrado de interesse, induzindo tais sistemas com ferramentas experimentais confiáveis e caracterizando-os com uma variedade de expressão genética e ensaios funcionais/fenotípicos de forma padronizada. Melhorias futuras desses protocolos podem incluir a integração desses métodos com o rastreamento de células vivas usando outras tecnologias optogenéticas, como as DMDs, que permitirão o controle espacial da expressão genética e aplicações funcionais no nível unicelular. Tais avanços permitirão a utilização da luz para produzir o padrão de expressão genética de interesse em células únicas, estabelecer dinâmicas de transcrição/tradução, quantificar os níveis de proteína e estudar seu papel em diversos processos biológicos, incluindo migração celular, proliferação, metástase e diferenciação.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes	Eppendorf	951010006	reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X	Thermo Fisher Scientific	MT25053CI	reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000020	tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000055	tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette	Eppendorf	3123000039	tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap	Corning	352235	reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V	Eppendorf	22628113	equipment for mammalian culture work
Agarose	Denville Scientific	GR140-500	reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates	VWR®	60941-126	tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9518-5G	reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365PR	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140010	reagent for growing bacteria
BD LSRAria	BD	656700	tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa	BD	649225	tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine	Government Scientific Source	SIGA4919-1G	reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC	Corning	353043	plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge	VWR	22628113	instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood	N/A	N/A	instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid	BD	353047	plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask	USA Scientific	CC7682-4825	container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fischer Scientific	BP231-100	reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide	Thermo Fisher Scientific	15-585-011	reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid	Corning	353072	container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express	De Novo Software:	N/A	software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL	Corning	35-010-CV	reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose	Thermo Fisher Scientific	11-965-092	reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL	Life Technologies	10687-010	reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix	Bio-Rad Laboratories	1708890	reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C	VWR	76210-392	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U74VC	equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C	VWR	76359-220	equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg	Sigma-Aldrich	L3022-250G	reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000	Life Technologies	L3000008	reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019	MathWorks	N/A	software for analyzing experimental data
Methanol	Acros Organics	413775000	reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL	VWR	20170-333	plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay	Life Technologies	4331182	qPCR Probe
MultiTherm Shaker	Benchmark Scientific	H5000-HC	equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-NDL-US-CAN	equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix	NEB	M0492S	reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)	New England Biolabs (NEB)	C3019H	bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs (NEB)	E2621L	reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera	Nikon Instruments Inc.	N/A	instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements	Nikon Instruments Inc.	N/A	software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides	IDT	N/A	reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control	Panasonic	MCO-170AICUVHL-PA	instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade	Electron Microscopy Sciences	15710-S	reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x)	Invitrogen	14190144	reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x	Fisher Scientific	15140-122	reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody	Cell Signaling Technology	4370S	primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody	Sigma-Aldrich	WH0003845M1	primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System	Eppendorf	A28137	equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App	Thermo Fisher Scientific	N/A	software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody	Cell Signaling Technology	8889S	secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody	Invitrogen	A11005	secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL	Olympus Plastics	12-102	reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System	Major Science	UVCI-1200	tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene	SnapGene	N/A	software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator	Tokai Hit	INU-TIZ	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444557	reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn	Life Technologies	4326317E	qPCR Probe
Thermocycler	Bio-Rad	1851148	tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated	PerkinElmer	1450-605	plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm	VWR	14673-010	reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System	VWR	89032-290	equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293	Thermo Fisher Scientific	R75007	Engineered cell line with FRT site