Summary
Burada, genetik kod genişlemesini kullanarak asetillenmiş histone proteinlerini ifade etmek ve yeniden inşa edilmiş nükleozomları in vitro olarak birleştirmek için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Asetillenmiş histone proteinleri, bir mutant kodlayan Escherichia coli'de kolayca ifade edilebilir, Nε-asetil-lizin (AcK)-spesifik Methanosarcina mazi pirrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) ve onun konyak tRNA (tRNAPyl)siteye özgü asetillenmiş histonları ile yeniden inşa mononükleozomları birleştirmek için. MmAcKRS1 ve tRNAPyl, Escherichia coli'deçeviri sırasında tercih ettiği mRNA'daki bir kehribar mutasyon bölgesinde AcK sağlar. Bu teknik, H3 lizin sahalarında ACK'yı dahil etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Pyrrolysyl-tRNA sentezi (PylRS) ayrıca bölgeye özgü protein modifikasyonu veya fonksiyonelleştirme için diğer nonkanonik amino asitleri (ncAA'lar) içerecek şekilde kolayca geliştirilebilir. Burada MmAcKRS1 sistemini kullanarak AcK'yı histone H3'e dahil etmek ve asetillenmiş H3 proteinlerini yeniden inşa edilmiş mononükleozomlara entegre etmek için bir yöntem detaylandırıyoruz. Asetillenmiş yeniden inşa edilmiş mononükleozomlar biyokimyasal ve bağlayıcı tahlillerde, yapı belirlemede ve daha fazlasında kullanılabilir. Modifiye mononükleozomların elde edilmesi, yeni etkileşimler keşfetmek ve epigenetiği anlamakla ilgili deneyler tasarlamak için çok önemlidir.
Introduction
Biz sentezlemek ve siteye özgü asetillelenmiş histonlar ile yeniden inşa mononükleozomları birleştirmek içinPylRS ve tRNA Pyl kullandık. PylRS, post translational modifikasyonlara (PTM) sahip proteinler üretmek için genetik kod genişletme aracı olarak paha biçilmez olduğunu kanıtlamıştır ve genetik olarak yaklaşık 200 farklı nTA'yı içerecek şekilde evrimleştirilmiştir. PylRS, çeviri sırasında diğer amino asitlerden kaynaklanan rekabeti ortadan kaldırarak kehribar stop kodonuna dahil olur. PylRS ilk olarak metanojenik arkealarda keşfedilmiştir ve o zamandan beri kimyasal biyolojide yeni reaktif kimyasal grupları proteinlere dahil etmek için1,2.
MmAcKRS1, Methanosarcina mazei PylRS'den evrimleşmiştir ve laboratuvarımızda asetillenmiş proteinlerin sentezi için sıklıkla3, 4,5,6. MmAcKRS1, Escherichia coli'deçeviri sırasında tercih ettiği mRNA'daki bir kehribar mutasyon bölgesinde AcK sunar. Bu teknik daha önce K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 ve K79 histone H3 lizin sitelerinde Sirtuin 1, 2, 6 ve 7'nin asetilasyonlu mononükleozomlar4,5,6üzerindeki aktivitesini incelemek için kullanılmıştır. Burada asetillenmiş histonları ifade etmek ve asetillenmiş nükleozomları yeniden inşa etmek için bu yöntemi detaylandırıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plazmid yapımı
- Hangi histone proteinin asetilasyona ve hangi lizin bölgesine karar vererek başlayın. Siteye yönlendirilmiş mutagenezi kullanarak siteyi amber stop codon'a (TAG) yönlendirin.
NOT: Histone proteinlerinin ekspresyonu için daha önce tasarlanmış dört plazmid vardır. Dört histone proteini de N-terminal histidin etiketiyle pETDuet-1 vektörüne klonlandı. Histone H4 ayrıca bir SUMO etiketi, yaklaşık 40 kopya numarasına sahip çoğaltma colE1'in kökeni, ampisiline dayanıklı ve bir T7 promotörü içerir.- Dört histone protein plazmidinden birinde istenen yerde (mevcut bir lizin kodonunu kehribar durdurma kodonu ile değiştirerek) TAG mutasyonu içeren ileri ve ters astarlar tasarlayın.
- Plazmid içeren TAG'i yükseltmek için tam plazmid PCR kullanın. Astarlar için uygun bir tavlama sıcaklığı belirleyin. Genel olarak, astarların eksi 5 °C'nin erime sıcaklığı (Tm)yeterli olacaktır. Bir PCR ürünü elde etmekte zorluk yaşanırsa, tavlama sıcaklığını amplifikasyon için optimize etmek için Tm - 5 °C civarında bir sıcaklık gradyanı kullanılabilir.
NOT: Bu deneyde, aşağıdaki koşullarla 30 döngü boyunca şirket içinde ifade edilen bir PFU polimeraz kullanılmıştır: 30 s (denatürasyon) için 94 °C, 30 s için tavlama sıcaklığı ve 6 dakika (veya kilobase çiftleri başına 1 dk) için 72 °C. Bu tür PCR yöntemi hakkında daha fazla bilgiiçin bkz. - Üreticinin protokolüne uyarak PCR ürününü pcr temizleme kiti ile temizleyin. PCR ürününü agarose jel elektroforezi ve daha sonra ethidyum bromür lekeleme ile analiz edin.
- Plazmidi 16 °C'de bir gecede T4 ligaz ile inkübasyon yaparak lige edin.
- İlk plazmid (AmpR)içeren TAG'i kimyasal olarak yetkin Escherichia coli'yedönüştürün. Dönüşümden en az 4 koloni seçin ve plazmidi arındırın. Standart yöntemleri kullanarak gliserol ile her birinin hücre stoklarını yapın ve -80 °C'de saklayın. İstenen TAG mutasyonu onaylamak için sıralama için gönderin.
- Dizi onaylandıktan sonra, pEVOL-AckRS (ChlR)ile TAG içeren plazmid (AmpR)ile birlikte ısı şoku yöntemini kullanarak BL21 hücrelerinin silinmesini kimyasal olarak yetkin CobB'ye (E. coli.)bilinen tek histone lizin deacetylazı) dönüştürün. pEVOL, düşük kopya numarası p15A kökenli bir orta kopya numarasına sahip bir plazmiddir.
NOT: pEVOL plazmid serisi, ortogonal aaRS/tRNATyr çiftinin protein kesilmesini azaltmada ve mutant proteinlerin genel verimini artırmada etkili olduğunu gösteren önceki çalışmalara dayanarak inşa edilmiştir8. CobB silme hücrelerine erişilemediyse, kimyasal olarak yetkin BL21 hücreleriyle devam edin. CobB sirtuin benzeri bir histone lizin deacetylazdır ve Nicotinamide alternatif bir yaklaşım olarak CobB'yi inhibe etmek için histone protein ekspresyonu sırasında 5 mM son konsantrasyonda eklenebilir9. - Bir hücre stoğu yapın ve -80 °C'de saklayın.
2. Asetillenmiş histone protein ekspresyonu
- Bir kültür şişesinde 1 L otomatik kapatılmış 2YT ortamı (veya seçim hacmi) hazırlayın.
- TAG içeren plazmid (AmpR)ve pEVOL-AckRS (Chl R) içeren ve 37 °C ila OD = 0,6(4-6 h) arasında büyüyen ortak dönüştürülmüş hücre stoğu ile uygun antibiyotikleri içeren 2YT ortam 20 mL aşıla.
- 1 L otoklavlı 2YT ortama uygun antibiyotikleri ekleyin ve 20 mL başlangıç kültürü ile aşıleyin. 37 °C'de OD = 0,6-0,8 (2-3 saat) arasında büyüyün.
- IPTG 1 mM, %0,2 arabinoz ve AcK 5 mM'nin son konsantrasyonlarına indükleme ajanları ve asetilsin (AcK) ekleyin.
- Kültürü 37 °C'de 6-8 saat büyütün.
- Pelet hücreleri 15 dakika boyunca 2.700 x g'da.
- Hücre peletini gece boyunca -80 °C'de saklayın.
- Bu adımdan itibaren numuneyi her zaman buzda tutun. Hücre peletini 1 L kültür başına 50 mL histone lizis tamponunda çözün.
- Aşağıdaki döngüye göre sonicate: 1 s açık, 1 s kapalı, toplam zamanında: 3 dk% 60 genlik.
- Pelet dahil vücutları 45 dakika boyunca 41.600 x g'da.
- 30 mL histone liziz tamponunda süpernatant ve resuspend inklüzyon gövdelerini atın. Pelet içerme 30 dakika boyunca 41.600 x g'dadır.
- Süpernatant atın ve 30 mL pelet yıkama tamponunda dahil etme gövdelerini yeniden dirsindirin. Pelet dahil vücutları 30 dakika boyunca 41.600 x g'da.
- Süpernatant atın ve 6 M Guanidine Hidroklorür (GuHCl) tamponunun 25 mL'sinde dahil etme gövdelerini çözün. 1 saat boyunca 37 °C'de ajitasyon ile kuluçkaya yaslanın.
NOT: Gerekirse, dahil etme organları 4 °C'de bir gecede ajitasyon ile inkübe edilebilir. - Pelet içerme 45 dakika boyunca 41.600 x g'dadır. 2 saat boyunca 6 M GuHCl tamponu ile dengelenmiş 1 mL Ni-NTA reçinesi ile süpernatantı kuluçkaya yaslanın.
- Denatüre koşullar altında Ni-NTA saflaştırma ile devam edin. Sütunu 3 sütun hacminde sütun yıkama arabelleğiyle yıkayın. Elute asetillenmiş histone proteini 10 mL elüsyon tamponu ile.
NOT: Proteini burada konsantre etmeye çalışmak bir seçenektir, ancak asetillenmiş histonlar çok öngörülemezdir ve kolayca çökelebilir. Toplam hacimde 2 mL'yi geçmeniz önerilmez. - Tuzları çıkarmak için asetilasyonlu histone proteinini% 5 asetik asit tamponuna karşı kapsamlı bir şekilde dialyze edin. Dialyze 4 °C'de bir seferde 3 saat, en az 6 kez taze tampon alışverişi.
NOT: Geliştirilmiş protein saflığı için saf suya karşı diyalze etme seçeneği vardır. Bununla birlikte, bu, düşük verimli asetillenmiş histone proteinleri için istenmeyen önemli yağış ve verim azalmasına neden olur. - Aliquot ve lyophilize protein, ve süresiz olarak -80 °C depolayın. Yabani tip histone proteinleri genellikle 10-50 mg/L verim, asetilasyonlu histone proteinlerisse özgü lizin bölgesine bağlı olarak 10 mg/L'den az verim verir. Örneğin, H3K79Ac ortalama 5 mg/L' dir.
3. Vahşi tip histon proteini ekspresyonu
- Tam nükleozomları birleştirmek için, 4 histone proteinini de ifade edin. Vahşi tip histonları ifade ederken ve arındırırken protokol, aşağıdakiler dışında asetilen histonları ile aynıdır:
- Birlikte dönüştürme gerçekleştirmeyin. Vahşi tip histone ifadesi için pEVOL-AcKRS kullanmayın. Antibiyotikleri buna göre ayarlayın.
- Hücresel ifadenin indüksiyonu sırasında CobB silme hücresi hattı kullanmayın veya Nikotinamid, AcK veya arabinoz eklemeyin.
4. 601 DNA'nın hazırlanması
NOT: Nükleozom konumlandırmasını yönlendirmek için önceden tasarlanmış optimize edilmiş bir DNA dizisi, yüksek verimli mononükleozom üretmek için histone oktamers ile birleştirilir. Bu dizi 601 DNA veya Widom dizisi olarak adlandırılır. Bu dizi, kromatin remodeling testlerinden tek molekül ölçümlerine kadar nükleozomların in vitro çalışmaları için standart DNA dizisi haline gelmiştir10.
- Nükleozom montajı için önemli miktarlarda 601 DNA hazırlamak için pGEM-3z/601'i Top 10 hücrelerine dönüştürün ve plazmid amplifikasyon ve ekstraksiyon için 10 mL kültür yetiştirin. Plazmid çıkarma kiti kullanın ve üreticinin tavsiyesine uyun.
- Bu amplifikasyon protokolü için şirket içinde ifade edilmiş bir PFU polimeraz (daha verimli) kullanın. PCR reaksiyonsu ayarlama: 250 μL reaksiyon için, 207.5 μL otoklavlı MQ H2O, 25 μL 10x PFU Tampon, 5 μL İleri Astar: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Ters Astar: acaggatgtatatctgacacg, 5 μL dNTP karışımı, 2.5 μL PFU enzimi kullanın. Genellikle aynı anda 60 reaksiyon çalıştırarak bir araya yetecek kadar DNA elde ederiz.
- PFU polimeraz kullanıyorsanız, 30 s için 52 °C tavlama sıcaklığı ve 30 s uzatma süresi kullanın. Aksi takdirde üreticilerin önerdiği koşulları izleyin.
- PCR yapıldıktan sonra, PCR ürününü saflaştırmak için tercih edilen bir PCR temizleme kiti kullanın.
5. Histone oktamer montajı
- H2A, H2B, H3 ve H4 histone protein peletlerinin aliquotlarını çözün, böylece GuHCl Buffer'daki her histone proteininin ayrı bir stoğu vardır ve toplam hacmi 100 μL'dir.
- A280 emiciliği ölçerek her bir histon proteininin konsantrasyonunu hesaplayın.
- Emicilik herhangi bir protein için 1'den büyükse, daha doğru bir konsantrasyon elde etmek için GuHCl tamponu ile seyreltin.
- H2A ve H2B proteinlerini 1:1 molar oranında birleştirin ve toplam 4 μg/μL protein konsantrasyonuna seyreltin.
- Dialyze bir gecede 2 M TE arabelleğe karşı 4 °C'de sırayla, 2 h için 1 M TE arabellek ve 5 saat için 0,5 M TE arabellek.
NOT: Diyalizin ikinci ve üçüncü adımları, çökeltmek için kararsız protein uyumlarına neden olur. Bu adımlarda yoğun yağış görülmesi bekleniyor. - 4 °C'de 16.800 x g'da santrifüjleme ile çökeltmeleri çıkarın.
- Yine, A280 emiciliğini ölçen histone dimer (H2A/H2B karışımı) ve tetramerlerin (H3/H4 karışımı) konsantrasyonunu hesaplayın.
- Dimerleri ve tetramerleri 1:1 molar oranında karıştırın ve katı NaCl ilavesi ile NaCl'i 2 M'ye ayarlayın.
- Histone oktamer 4 °C'de saklanabilir ve dimer ve tetramerlerden daha kararlıdır. Demonteye neden olabileceği için asla histone oktamerini dondurmayın.
- Asetillenmiş histonlarla bir araya getiriyorsanız, vahşi tip proteini prosedürdeki asetilasyonlu proteinle değiştirmenız yeterlidir.
6. Nükleozom montajı
- 601 DNA'yı 2M TE arabelleğe ayarlamak için 100x TE arabellek ve katı NaCl kullanın. 2M TE tampondaki 601 DNA'yı 0.85:1 ila 0.90:1 molar oranında histone oktamerine ekleyin. Jel kayma analizinde serbest DNA varsa daha düşük bir DNA oranı eklenebilir.
- DNA-histon karışımını bir diyaliz torbasına aktarın ve yaklaşık 200 mL 2M TE tampona (veya birden fazla numuneyi monte ediyorsanız daha fazla) yerleştirin ve 4 °C'de çok hafifçe karıştırın.
- Tuz TE tamponunda yavaşça damlatmak için temizlemek için peristaltik bir pompa ayarlayın. Hacim kabaca iki katına çıktığında, hacmin yarısını dökün. Bunu toplamda en az 4 kez yapın. Bir pompa ile bu, başlangıç hacmine bağlı olarak 4-8 saat sürebilir. Tuz konsantrasyonu 150 mM'ye düşürüldüğünde nükleozomlar oluşur (tuzluluk ölçer ile ölçülür).
- Tuz konsantrasyonu 150 mM'ye düşürüldükten sonra, bir gecede 20 mM TE tampona karşı dialyze edin.
- Çökeltme ile çökeltmeleri çıkarın ve bir plaka okuyucu kullanarak nükleozomların konsantrasyonunu A260 okuma ile ölçün.
- His-TEV proteazını ekleyin (TEV: nükleozom 1:30, w:w) ve tüm histidin etiketlerini kaldırmak için 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın. Ni-NTA reçinesi aşağı çekerek nükleozom çözeltisinden histidin etiket safsızlıklarını çıkarın.
- Nükleozomları konumlandırmak ve numuneyi homojenize etmek için 1 saat boyunca 60 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Özellikle kararsız olan asetillenmiş siteler için bu adım tavsiye edilmeyebilir. - Nükleozomları 4 °C'de kısa süreli (birkaç hafta) saklayın.
- Uzun süreli depolama için, nükleozomları depolama tamponuna karşı dialyze edin ve -80 °C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dimerler, tetramerler ve oktavlar% 12 SDS PAGE jeli (Şekil 1 ve Şekil 2)çalıştırılarak değerlendirilebilir. Burada, bazı asetilasyonlu tetramerlerin diğerlerinden daha düşük verime sahip olduğunu görebilirsiniz (Şekil 1). Aslında, çekirdek bölgeye ne kadar yakınsa, verim o kadar düşük gözlenir. Bu büyük olasılıkla, tetramer montajına müdahale eden asetilasyondan kaynaklanmaktadır. Octamers monte edildikten sonra benzer bir etki gözlenir (Şekil 2). Oktamers 601 DNA dizisi ile monte edildikten sonra, nükleozom ethidyum bromür ile boyama ile takip edilen% 5 1x TBE Native PAGE jel kullanılarak değerlendirilebilir (Şekil 3). TEV sindirimi öncesinde nükleozom bandı 10k baz çifti işaretinin yakınında gözlenir. TEV sindirimlerinden sonra nükleozom bandı merdivene göre aşağı kayar. Termal konumlandırmadan önce, gözlemlenen nükleozom bantları çok geniş ve muhtemelen çizgili olacaktır (Şekil 4).
Şekil 1: Histone dimerler ve tetramerler. Temsili % 12 SDS PAGE jel vahşi tip histone dimer (şerit 2) ve H3 asetillenmiş tetramerler (şeritler 3-9). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Histone oktavlar. H3 asetillenmiş histone oktavlarının temsili % 12 SDS PAGE jeli (şerit 2-11). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Etiketli H3K64Ac nükleozom kompleksini bir araya getirmiş. Temsili 1x TBE Yerel PAGE jel H3K64Ac nükleozom kompleksi (şerit 2) ile karşılaştırıldığında ücretsiz 601 DNA (Lane 4) etiyum bromür ile görselleştirilmiştir. Lane 3, bir saat boyunca 60 °C'de inkübasyondan sonra H3K64Ac nükleozom gösterir. Şerit 3'te tüm nükleozomların söktürdüğı gözlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Monte edilmiş TEV sindirilmiş nükleozom kompleksi. Vahşi tip TEV sindirilmiş nükleozom kompleksinin temsili 1x TBE Native PAGE jeli ve ücretsiz 601 DNA. Nükleozom termal konumlandırma öncesi ve sonrası karşılaştırması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir deney sırasında bu protokolü her ayrıntıya uymak önemlidir. Nükleozomlar çok kararlı değildir ve bu protokolün belirlenmesinde çok fazla deneme yanılma olmuştur. Partiküller montaj işlemlerine kolayca müdahale edebileceğinden, her adımda (veya gözlendiği zaman) çökeltileri kaldırmak anahtardır. Her zaman ton örneklerini buzda tut. Nükleozomlar 4 °C'de çok uzun süre saklanırsa, kendiliğinden sökülebilirsiniz. Herhangi bir denemede kullanılmadan önce 2 haftadan uzun bir süre 4 °C'de saklanırsa, herhangi bir örneği Native PAGE'e göre kontrol etmeyi unutmayın. Oklamlar ve nükleozomlar girdap kaçının, çünkü bu da sökülmelerine neden olabilir. Dimer, tetramer veya oktav montajında sorunlarla karşılaşılırsa, bu genellikle düşük protein kalitesinin göstergesidir. Protein kalitesini %15 SDS-PAGE ile kontrol edin. Protein saflığı düşükse bir seçenek, proteini saf suya karşı dialyze etmektir. Bu, ağır yağışa neden olacak ve protein verimini büyük ölçüde azaltacak, ancak daha saf bir örnek üretecektir. Her histone asetilasyon bölgesinin birleştirilmesi ve nükleozomal stabilitesi büyük ölçüde değişmektedir. Genel olarak, site N-terminal etki alanına ne kadar yakınsa, histone protein ekspresyonu sırasında verim o kadar düşük olacaktır. Nükleozom stabilitesi için, asetilasyon bölgesi nükleozom çekirdeğine veya DNA bağlama bölgelerine ne kadar yakınsa, birleştirilmiş nükleozom o kadar az kararlıdır. Stabilite sorunlarıyla karşılaşılırsa, nükleozom örneğini her zaman buzda tutmak çok önemlidir. 60 °C'deki nükleozom konumlandırma adımını atlamak gerekebilir, çünkü bu sökme veya çökeltmeye neden olabilir. Asetillenmiş nükleozomların önemli bir sınırlaması istikrarsızlıklarıdır. Nükleozomal çökeltmeye neden olmadan 37 °C gibi daha yüksek sıcaklıklarda tahlilleri önceden yapmak imkansız olabilir. Deneysel prosedürler izin verirse, asetillenmiş nükleozomların çökeltilmelerini önlemek için bunları 4 °C'de gerçekleştirin.
Bu nükleozom üretme yöntemi, bağlayıcı deneyler ve yapı belirlemeleri için modifiye nükleozomlar üretmek için özellikle yararlıdır. Bu yöntem, daha iyi kontrollü deneyler ve daha yüksek çözünürlüklü görüntülerle sonuçlanan kafa karıştırıcı değişkenleri ortadan kaldıran daha yüksek saflığa ve bilinen bir nükleozomal DNA dizisine sahip nükleozomlar üretir. Nükleozom örneğinin bilinen bir DNA dizisi ile homojen olduğu yapı belirlemeleri için çok önemlidir, aksi takdirde yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek imkansız olacaktır.
Bu yöntemin potansiyel uygulamalarının bolluğu vardır. Özellikle, epigenetik alanında. Modifiye protein elde etmek inanılmaz derecede zor olabilir. Modifiye proteinlerin elde edilmesi, iyi anlaşılmayan birçok epigenetik yoldaki yazarların, okuyucuların ve silgilerin yapısını ve işlevini yok etmek için çok önemlidir. Bu tekniği daha önce H3 asetilasyon bölgeleri K18, K36 ve K56'daki nükleozmal DNA'nın Pst1 sindirimine erişilebilirliğini araştırmak için kullandık ve her mutant oktamerini bir Pst1 sindirim bölgesi içeren değiştirilmiş bir 601 DNA dizisi ile birleştirdik. Bu teknik, AcK dışındaki NCAA'leri içerecek şekilde daha da değiştirilebilir. Ayrıca Nε-(7-azidoheptanoyl)-L-lizin(AzHeK) amber codon tarafından Escherichia coli'de birkaç AzHeK içeren histone H3 proteininin rekombinant ekspresyonu için birkaç asetilasyon bölgesinde SIRT7'nin histone deakilasyon aktivitesini araştırmak için bir araya geldik. Bu yaklaşım, SIRT7'nin H3K36'nın deakilasyonuna yönelik yüksek aktiviteye sahip olduğunu ve H3K37'yi deacylate etmek için katalistik olarak aktif olduğunu ortaya koydu. H3K36 deakilasyonun nükleozom bağımlı olduğu daha da gösterildi ve acyl-nucleosome substratına, yerel kromatin6'dakinükleozomlar arasındaki köprüleme DNA'sını taklit eden kısa bir çift iplikli DNA eklenerek önemli ölçüde geliştirilebilir.
Bu yöntem, çeşitli senaryolarda yararlı olabilecek hiçbir değişiklik olmadan vahşi tip nükleozomlar üretmek için de değiştirilebilir. Grubumuz yakın zamanda Dr. Pingwei Li'nin grubuyla işbirliği içinde, döngüsel GMP-AMP sintazının (cGAS) ikinci DNA bağlama bölgesi11aracılığıyla histone H2A ve H2B tarafından oluşturulan negatif yüklü asidik bir yama ile sıkı bir şekilde bağlanmasını gösteren bir yapı yayınladı. cGAS, STING-TBK1-IRF3 sinyalekseni12, 13 , 14 ,15,16aracılığıyla tip I interferonlarının indüksiyonuna aracılık eden döngüsel bir dinükleotid cGAMP sentezini katalizleyen bir dsDNA sensörüdür.
Tamamen monte edilmiş nükleozomları kullanmanın yararı, epigenetik ile ilgili herhangi bir sayıda proteinin aktivitelerini veya bağlama yeteneklerini araştırmak için daha iyi bir model olarak hizmet eden çekirdeklerin yerli durumuna daha yakından benzemesidir. Nükleozom substratları ile araştırıldığında sonuçları büyük ölçüde değiştiren çıplak DNA veya histone peptit substratlarına doğru sınırlı veya tamamen yoktur enzim aktivitesinin sayısız örneği vardır. Yukarıda bahsedilen örnekte olduğu gibi, SIRT7 için başka türlü bilinmeyen bir nükleozom substratı kullanılarak yeni bir deakilasyon alanı keşfedilmiştir. Bu tür sistemleri incelerken yerel substratların kullanılması çok önemlidir. Bu teknik, pirolizin genetik kod genişletme tekniği tarafından dahil edilebilen herhangi bir modifikasyonun okuma, yazma ve silme aktivitesini veya bağlama yeteneğini araştırmak için kullanılabilir. Pirolizil-tRNA sentezi zaten doğal olarak karışıktır ve birincil sınırlayıcı faktörü araştırmacının yaratıcılığı haline getiren herhangi bir sayıda sistemde bu tekniği kullanmak için kapıyı açan bir dizi başka substrat için tasarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbiri tarafından beyan edilen rakip finansal çıkarlar yoktur.
Acknowledgments
Dr. Wesley Wang'a bu protokole ve değerli akıl hocalığına zemin hazırlayıp verdiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (GrantS R01GM127575 ve R01GM121584) ve Welch Foundation (Grant A-1715) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
References
- Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Umehara, T., et al. N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo. FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).
- Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).
- Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes. ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).
- Wang, W. W., et al. A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7. Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide. PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Zhao, B., et al. The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS. Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).
- Burdette, D. L., Vance, R. E. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol. Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).
- Barber, G. N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).
- Ablasser, A., et al. cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).
- Gao, P., et al. Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).
- Zhao, B., et al. A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1. Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).
