Summary
Denne protokol beskriver en undersøgelse af de tidlige interaktioner mellem viralt inficerede nasale epitelceller og medfødt celleaktivering. Individuelle undergrupper af immunceller kan skelnes ud fra deres aktivering som reaktion på virusinfektioner. De kan derefter undersøges yderligere for at bestemme deres virkninger på tidlige antivirale reaktioner.
Abstract
De tidlige interaktioner mellem næseepitellaget og de medfødte immunceller under virusinfektioner forbliver et underudforsket område. Betydningen af medfødt immunitetssignalering i virusinfektioner er steget betydeligt, da patienter med luftvejsinfektioner, der udviser høj medfødt T-celleaktivering, viser et bedre sygdomsresultat. Derfor tillader dissekering af disse tidlige medfødte immuninteraktioner belysning af de processer, der styrer dem, og kan lette udviklingen af potentielle terapeutiske mål og strategier til at dæmpe eller endda forhindre tidlig progression af virusinfektioner. Denne protokol beskriver en alsidig model, der kan bruges til at studere tidlig krydstale, interaktioner og aktivering af medfødte immunceller fra faktorer udskilt af viralt inficerede luftvejsepitelceller. Ved hjælp af en H3N2-influenzavirus (A/Aichi/2/1968) som den repræsentative virusmodel er medfødt celleaktivering af mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) blevet analyseret ved hjælp af flowcytometri for at undersøge de delmængder af celler, der aktiveres af de opløselige faktorer, der frigives fra epitelet som reaktion på virusinfektionen. Resultaterne demonstrerer gating-strategien til differentiering af delmængder af celler og afslører de klare forskelle mellem de aktiverede populationer af PBMC'er og deres krydstale med kontrol- og inficeret epitel. De aktiverede delmængder kan derefter analyseres yderligere for at bestemme deres funktioner såvel som molekylære ændringer, der er specifikke for cellerne. Resultater fra en sådan crosstalk-undersøgelse kan afdække faktorer, der er vigtige for aktiveringen af vitale medfødte cellepopulationer, som er gavnlige for at kontrollere og undertrykke udviklingen af virusinfektion. Desuden kan disse faktorer anvendes universelt på forskellige virussygdomme, især på nyopståede vira, for at dæmpe virkningen af sådanne vira, når de først cirkulerer i naive menneskelige populationer.
Introduction
Respiratoriske vira er måske blandt de mest udbredte patogener, der forårsager alvorlig sundhedspleje og økonomisk byrde. Fra de periodiske globale udbrud af nye epidemiske stammer (f.eks. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) til de sæsonbestemte influenzastammer hvert år er vira en konstant trussel mod folkesundheden. Selvom vacciner udgør hovedparten af svaret på disse globale folkesundhedsudfordringer, er det tankevækkende at bemærke, at disse modforanstaltninger kun erlydhøre 1,2. Desuden er en forsinkelse mellem fremkomsten af en ny smitsom stamme og den vellykkede udvikling af dens vaccine uundgåelig3, hvilket fører til en periode, hvor de foranstaltninger, der er til rådighed for at bremse spredningen af virusset, er stærkt begrænsede.
Disse forsinkelser understreges yderligere af de omkostninger, der påføres samfundet økonomisk og socialt. Sæsoninfluenzaen alene er ansvarlig for ca. 8 milliarder dollars i indirekte omkostninger, 3,2 milliarder dollars i medicinske omkostninger og 36,3 tusind dødsfald i USA årligt4. Dette er før overvejelse af de forskningsomkostninger, der er nødvendige for at finansiere vaccineudvikling. Epidemiske udbrud har endnu mere alvorlige virkninger på samfundet, forværret af den stigende globaliseringshastighed hvert år, som det fremgår af de globale forstyrrelser forårsaget af fremkomsten og hurtig spredning af alvorligt akut respiratorisk syndrom coronovirus 2 (SARS-CoV-2) 5,6,7.
Nylige undersøgelser har vist, at inficerede patienter med en større population af aktiverede medfødte T-celler har tendens til at have et bedre sygdomsresultat 8,9,10. Desuden er den medfødte T-cellepopulation kategoriseret i flere undergrupper: de slimhinde-associerede invariant t (MAIT) celler, Vδ1 γδ T-celler, Vδ2 γδ T-celler og de naturlige dræber-T-celler (NKT). Disse undergrupper af medfødte T-celler udviser også heterogenitet inden for deres populationer, hvilket øger kompleksiteten af interaktionerne mellem de cellepopulationer, der er involveret i det medfødte immunrespons11. Derfor kan mekanismen, der aktiverer disse medfødte T-celler og kendskabet til de specifikke undergrupper af medfødte T-celler, give en anden forskningsvej for at begrænse de infektiøse virkninger af disse vira på den menneskelige vært, især i perioden med vaccineudvikling.
Epitelceller inficeret med influenza producerer faktorer, der aktiverer medfødte T-celler hurtigt 12,13,14. På baggrund af dette fund har denne kontaktfri Air-Liquid Interface (ALI) co-kulturmodel til formål at efterligne de tidlige kemiske interaktioner (medieret af opløselige faktorer frigivet af det inficerede epitellag) mellem det inficerede nasalepitellag og PBMC'erne under tidlig infektion. Den fysiske adskillelse mellem næseepitellaget (dyrket på membranindsatser) og PBMC'erne (i kammeret nedenunder) og epitelintegriteten forhindrer direkte infektion af PBMC'erne med virussen, hvilket muliggør en detaljeret undersøgelse af virkningerne af epitelafledte opløselige faktorer på PBMC'erne. De identificerede faktorer kan derfor undersøges yderligere for deres terapeutiske potentiale til at fremkalde den passende medfødte T-cellepopulation, der kan beskytte mod influenzainfektion. Dette papir har derfor detaljeret beskrevet metoderne til etablering af en co-kultur til undersøgelse af medfødt T-celleaktivering fra epitelafledte opløselige faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Se tabel 1 for opskrifter af medier, der anvendes i denne protokol.
BEMÆRK: hNECS dyrket på 12-brønds transwell har vist sig at vokse til mere optimal tykkelse for opløselige faktorer til let at nå basalkammeret, når de er inficeret med influenzavirus. Derfor anbefales brug af 12-brønds størrelse transwell til co-kultur.
1. Etablering af 3T3-føderlaget
- Etablering fra frosne lagre
- Optø et kryovial af NIH / 3T3 fibroblaster fra frosne lagre. Tilføj indholdet af cryovialet til 2 ml komplet Dulbecco's Minimal Essential Media (DMEM) og resuspend cellerne.
- Centrifugering i 5 minutter ved 300 × g og stuetemperatur/tryk (rtp), og fjern supernatanten. Genophæd cellerne i komplet DMEM.
- Tæl cellerne ved hjælp af trypan blå farvning. Der tilsættes 10 μL trypanblå til 10 μL af den resuspenderede cellesuspension. Bland grundigt, og tilsæt 10 μL af suspensionen til et hæmocytometer for at tælle cellerne.
- Frøceller med en massesitet på 1 × 104 celler/cm2 i en passende dyrkningsskål (f.eks. T75-kolbe). Den resulterende dyrkningskolbe inkuberes i 3 dage ved 37 °C i en 5 % CO2 - atmosfære.
- Mitomycin C behandling
- Efter 3 dage skal du sikre, at sammenløbet er 60% -80%, fjern mediet og vask cellerne med 1x fosfatbufret saltvand (PBS).
BEMÆRK: Det er vigtigt, at 3T3-føderlaget ikke når fuld sammenløb; Ellers vil mitomycin C-behandlingen ikke være effektiv. - Der tilsættes mitomycin C-suppleret komplet DMEM til kolben, og der inkuberes i 3,5 timer ved 37 °C i en 5 % CO2 - atmosfære. Fjern det mitomycin C-holdige medium, og vask cellerne 2x med 1x PBS.
- Efter 3 dage skal du sikre, at sammenløbet er 60% -80%, fjern mediet og vask cellerne med 1x fosfatbufret saltvand (PBS).
- Såning af 3T3 celler i 6-brønds plader
- Der tilsættes 3 ml 1x trypsin-EDTA til kolben i 3-5 minutter for at adskille cellerne. Saml de disassocierede celler i et nyt 15 ml rør. Centrifugering af 15 ml røret i 5 minutter ved 300 × g, rtp; kassér supernatanten. Genophæd cellerne i komplet DMEM.
- Tæl cellerne ved hjælp af trypan blå farvning. Frø cellerne i en 6-brønds plade ved 7,5 × 10 5-2,5 × 106 celler / brønd. Inkuber pladen natten over ved 37 °C i en 5 % CO2 -atmosfære.
BEMÆRK: 3T3-føderlaget betragtes som klar, hvis cellerne er sunde. På dette tidspunkt frø de humane nasalepitelstamme / stamceller (hNESPC'er) på fødelaget til ekspansion. - Tilsæt komplet DMEM til kolben og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 natten over for 3T3 celler til at komme sig efter mitomycin C-behandling.
2. Etablering af human nasal epitelcelle (hNEC) kultur
BEMÆRK: Kliniske prøver bør udtages fra patienter, der er fri for symptomer på øvre luftvejsinfektion.
- Behandling af næsevæv til enkeltcellesuspension
- Vask næsevæv i 1x Dulbeccos PBS (dPBS) (PBS uden Mg2+ og Ca2+) indeholdende 100 μL/ml af en antibiotika-antimykotisk blanding. Vævet skæres i små fragmenter, og prøven behandles i 10 mg/ml af en neutral protease natten over ved 4 °C med omrystning.
- Centrifugering i 5 minutter ved 200 × g, og fjern supernatanten efter centrifugering. Inkuber pelleten i 1-2 ml 1x trypsin-EDTA (37 °C, 15 min), og sluk ved at tilsætte et volumen føtalt kvægserum svarende til 10% af volumenet i røret.
- Mekanisk dissocieres det fordøjede væv i enkeltcelleaggregater ved pipettering, og før derefter den resulterende suspension gennem en 70 μm cellesil. Genophæd cellerne i komplet DMEM.
BEMÆRK: Efter dette trin er cellesuspensionen en blanding af terminalt differentierede celler og stamceller, der betegnes som humane nasale epitelstam/stamceller (hNESPC'er). Formålet med de efterfølgende trin er at udvælge og berige hNESPC-populationen fra blandingen af forskellige cellepopulationer.
- Såning af en enkeltcellesuspension på 3T3-føderlaget til udvælgelse af hNESPC'er
- Centrifugering af cellesuspensionen fra trin 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp), og fjern supernatanten. Resuspend cellerne i 3-5 ml medium 3.
BEMÆRK: Medium 3 er formuleret til at fremme den selektive vækst af hNESPC'er. - Tæl cellerne via trypan blå farvning. Frø 1 x 106 celler i 2 ml medium 3 pr. brønd på 6-brønds plade indeholdende forberedt 3T3 føderlag efter fjernelse af mediet i 6 brøndpladen. Inkuber den resulterende samkultur ved 37 °C i en 5 % CO2 - atmosfære.
BEMÆRK: Efter såning skal du passe på ikke at omrøre pladen, da det vil påvirke fastgørelsen af hNESPC'erne. - Skift medium 3 (2 ml) hver 2-4 dage ved at fjerne det gamle medium helt og erstatte det med frisk medium 3.
BEMÆRK: Medium ændres for at genopbygge næringsstoffer og for at forhindre alt for sure forhold i at påvirke væksten af hNESPC'erne negativt. Intervallet mellem hver mediumændring afhænger af, hvor surt (gult) mediet bliver. Intervaller skal forkortes, hvis mediet hurtigt bliver surt. - Efter 7-10 dage skal du observere, at hNESPC'er har en sammenløbethed, der er egnet til at overføre dem til membranindsatser. Se figur 1 for repræsentativ morfologi af hNESPC'er på 3 forskellige tidspunkter (2 dage, 5 dage og 10 dage).
- Centrifugering af cellesuspensionen fra trin 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp), og fjern supernatanten. Resuspend cellerne i 3-5 ml medium 3.
- Overførsel af hNESPC'er til membranindsatser
BEMÆRK: På grund af mitomycin C-behandlingen nedbrydes 3T3-føderlaget langsomt i løbet af hNESPC-ekspansionsperioden. Dette vil resultere i en svækket vedhæftning til brøndens overflade, hvilket gør det muligt at løsne dem ved at skylle med en pipette og kun efterlade de sunde hNESPC'er.- Fjern mediet, og tilsæt 500 μL 1x dPBS til hver brønd. Skyl cellerne 3x med en mikropipette for at løsne 3T3-cellerne, og kassér 1x dPBS. Observer under mikroskopet, at de runde hNESPC'er forbliver, mens det spindelformede 3T3-føderlag løsnes.
- Der tilsættes 500 μL af et celledesassociationsreagens pr. brønd, og der inkuberes ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 5-10 minutter, eller indtil hNESPC'erne har løsnet sig fra brøndoverfladen.
- Saml hNESPC-suspensionen, centrifugen (300 × g, 5 min, rtp), og fjern supernatanten.
- Resuspend pillen i medium 3. Tæl cellerne via trypan blå farvning. Frø 3 × 104 celler i 150 μL medium 3 pr. membranindsats (24-brøndsplade) eller 1 × 105 celler i 300 μL medium 3 pr. membranindsats (12-brøndsplade) (figur 2). Inkuber cellerne ved 37 °C i en 5 % CO2 - atmosfære.
- Skift medium (medium 3) af de apikale og basale kamre hver anden dag. Naviger en pipettespids mellem membranindsatsens støttearme for at få adgang til basalkammeret, fjern det gamle medium, og genindfør derefter frisk medium ved samme metode. Selvom det apikale kammer er let tilgængeligt, skal du passe på ikke at forstyrre det voksende hNESPC-lag.
BEMÆRK: Forstyr ikke mediet i det apikale kammer i mindst 2 dage efter såning, da cellerne har brug for tid til at fastgøre sig til membranen.
- Differentiering af hNESPC'er til hNEC'er
- Når hNESPPC'er når 100% sammenløb (ca. 3-7 dage efter såning på membranindsatsen), skal du starte ALI-kulturen. Skift basalmediet til differentieringsmedium, og fjern mediet fra det apikale kammer. Tilsæt kun medium til basalkammeret uden at tilføje det til det apikale kammer, når mediet skiftes hver 2-3 dage, som angivet i figur 3 og trin 2.3.5.
BEMÆRK: Medium ændres til differentieringsmedium for at fremme differentieringen af hNESPC'erne til hNEC'er i ALI. HNESPC'erne tager cirka 3-4 uger at nå fuld modenhed for at blive hNEC'er i ALI, på hvilket tidspunkt cellerne ville være vokset til et flerlag med forskellige populationer af celler i hvert lag. Cilia skal også observeres ved en forstørrelse på 400x (cilier kan identificeres ved deres slagbevægelse, hvilket får mikroskopfeltet til at se ud som om det vibrerer). På dette tidspunkt er cellerne klar til at blive brugt til co-kulturforsøgene. Se figur 4 for tværsnittet af et fuldt differentieret hNEC-lag. - Efter opnåelse af modne hNEC'er vaskes cellerne i det apikale kammer 3x med 1x dPBS med 2-3 dages intervaller i 1 uge før co-kulturforsøget. Synergiser vasketrinnet med de basale mediumændringer, og udfør vaskene som følger.
- Der tilsættes 50 μL (24 brønd)/150 μL (12-brønd) 1x dPBS i membranindsatsens apikale kammer, og cellerne inkuberes ved 37 °C i 10 minutter. Fjern dPBS efter 10 minutters inkubation for at fjerne akkumuleret slim og døde celler i løbet af differentieringen.
BEMÆRK: Afhængigt af eksperimentets art kan natriumbicarbonatopløsning bruges til at vaske slimlaget helt af. For virusinfektion i co-kulturforsøg bevares slimlaget imidlertid, og kun overskydende slim fjernes med dPBS-vask. Denne tilbageholdelse er at efterligne det fysiologiske slimlag, der er til stede på næseepitelen, der vil interagere med den indkommende virusinfektion.
- Der tilsættes 50 μL (24 brønd)/150 μL (12-brønd) 1x dPBS i membranindsatsens apikale kammer, og cellerne inkuberes ved 37 °C i 10 minutter. Fjern dPBS efter 10 minutters inkubation for at fjerne akkumuleret slim og døde celler i løbet af differentieringen.
- Når hNESPPC'er når 100% sammenløb (ca. 3-7 dage efter såning på membranindsatsen), skal du starte ALI-kulturen. Skift basalmediet til differentieringsmedium, og fjern mediet fra det apikale kammer. Tilsæt kun medium til basalkammeret uden at tilføje det til det apikale kammer, når mediet skiftes hver 2-3 dage, som angivet i figur 3 og trin 2.3.5.
3. Måling af transepitel elektrisk modstand (TEER)
BEMÆRK: Bekræftelse af epitelintegritet er vigtig for at sikre, at der opnås et intakt og sundt epitellag. Et intakt epitellag bestemmes gennem TEER-måling udført på 4 tilfældige brønde ved hjælp af et voltohmmeter.
- Skyl elektroden med 70% ethanol, og steriliser den med ultraviolet lys i 15 minutter før brug for at sikre sterilitet. Skyl med 1x dPBS efter sterilisering.
- Tilsæt 100 μL (til 24-brønd) eller 300 μL (til 12-brønd) af 1x dPBS til det apikale kammer i membranindsatsen. Inkuber pladen ved 37 °C i 10 minutter; Fjern derefter dPBS.'
- For hver brønd, der skal måles, skal du forberede en ubrugt brønd med 1 ml (til 24 brønd) eller 3 ml (til 12 brønd) forvarmet (til 37 ° C) differentieringsmedium. Anbring membranindsatsen i den forberedte brønd, og tilsæt 200 μL (til 24 brønd) eller 600 μL (til 12 brønd) forvarmet differentieringsmedium til det apikale kammer. Ligevægt ved 37 °C (med forbehold af inkubationstemperaturen for den tilsatte virustype, f.eks. 35 °C for influenza) i 15 min.
BEMÆRK: Forbered et tomt (tomt membranindlæg) på samme måde til beregning af TEER. - Ligevægt et 15 ml rør af forvarmet differentieringsmedium ved samme temperatur i 15 minutter også. Anbring elektroderne i 15 ml-røret, og tænd voltohmmeteret.
BEMÆRK: På dette tidspunkt skal aflæsningen være 0 modstand, da elektroderne er i samme medium. Hvis der opnås anden aflæsning, skal elektroden i 15 ml-røret udlignes, indtil aflæsningen er 0. - Start fra emnet, placer elektroderne i hver brønd, således at en elektrode er nedsænket i det apikale kammermedium og den anden i basalkammermediet. Optag kun aflæsningen, når der opnås en konstant aflæsning i en periode på mindst 5 minutter.
- Efter hver måling vaskes elektroden med PBS inden næste måling. For hver veltestet skal der foretages målinger for tre prøver i forskellige positioner af membranen. For at beregne netto-TEER for hver prøve trækkes baggrundsmodstanden, givet af den tomme membranindsats, fra hver måling.
- Beregn den samlede TEER-aflæsning for en brønd ved hjælp af følgende ligning:
Epitelintegritet (Ωcm2) = Netto TEER (ohm) × membranområde (cm2)
BEMÆRK: TEER-værdierne for hNEC'er til virusinfektionsforsøg skal være >1000 Ωcm2 13,15,16.
4. Isolering af perifere blodmonocytter og NK-celler
BEMÆRK: Blodprøver skal udtages af raske frivillige og anvendes samme isolationsdag.
- Saml 30-40 ml fuldblod fra hver donor i 10 ml blodopsamlingsrør.
- ISOLER PBMC'er ved hjælp af densitetsgradientcentrifugering, og der opnås PBMC'er fra buffy-frakken efter følgende trin (se også materialetabellen).
- Bland ~ 10 ml blod grundigt fra blodopsamlingsrøret i en vakuum, inden fortynding med et lige så stort volumen afbalanceret saltopløsning (PBS).
- Tilsæt 15 ml densitetsgradientmedium til bunden af et 50 ml rør.
BEMÆRK: Forholdet mellem densitetsgradientmedium og fortyndet blod skal være 2: 3-3,5. - Lag 35 ml fortyndet blod på densitetsgradientmediet med en pipettepistol (med dispenseringsindstillingen indstillet til det lavest mulige) ved at vippe røret med 45 ° og lade det fortyndede blod falde dråbevis ned på rørets indre væg, så laget af densitetsgradientmedium ikke forstyrres.
- Centrifugelysat ved 500 × g, 18-20 °C i 30 min (bremse: slukket). Fjern forsigtigt og kassér det øverste plasmalag uden at forstyrre det nederste lag.
- Overfør buffy coat til et nyt rør uden at blande det røde blodcellelag, gradientdensitet medium lag eller buffy coat. Når buffy coat er blevet samlet i et nyt 50 ml rør, fyldes volumen op til 50 ml med 1x PBS.
- Centrifugelysat ved 800 × g, 18-20 °C, 8 min (bremse: slukket), og fjern supernatanten med en pipettepistol. Resuspend cellepillen med 50 ml 1x PBS og centrifuge ved 120 × g, 18-20 ° C, 10 minutter for at fjerne blodplader.
- Kassér supernatanten ved pipettering uden at forstyrre cellepillen.
BEMÆRK: Da cellepillen kan være løs, er det ikke tilrådeligt at kassere supernatanten ved at hælde. - Resuspend cellepillen med komplet RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium. Udfør et celletal ved at tilsætte 10 μL 3% eddikesyre med methylenblåt til 10 μL af den resuspenderede cellesuspension. Bland grundigt, og tilsæt 10 μL af blandingen til et hæmocytometer for at tælle cellerne.
- PbMC'er fortyndes med komplet RPMI-medium til en densitet på 2 × 106/ml (til 24 brønde) eller 4 × 106/ml (til 12 brønde).
5. hNEC Virusinfektion og overgang til hNEC: PBMC-co-kultur
BEMÆRK: H3N2 (A/Aichi/2/1968) anvendes som den repræsentative infektionsstamme i denne protokol. Multiplicitet af infektion (MOI) på 0,1 anvendes som den repræsentative MOI i denne protokol.
- Dag 0 (Infektion af hNEC'er)
BEMÆRK: En brønd fra hNEC'erne dyrket fra den samme donor bruges til at opnå et repræsentativt celletal for hver brønd, der anvendes i eksperimentet.- I den repræsentative brønd tilsættes 150 μL 1x trypsin-EDTA til membranindsatsens apikale kammer og 350 μL 1x trypsin-EDTA til basalkammeret og inkuberes ved 37 °C i 10 minutter, eller indtil cellerne løsner sig fra membranen.
- Skyl cellerne på membranen ved at pipettere op og ned, og opsaml suspensionen i et 1,5 ml centrifugerør. Tilsæt 200 μL komplet DMEM for at slukke trypsinaktivitet. Tæl celler via trypan blå farvning for at opnå celletal pr. Brønd.
- Beregn den krævede MOI for virussen baseret på celletallet pr. brønd, og fortynd virusbestanden i overensstemmelse hermed med komplet RPMI på is.
BEMÆRK: MOI 0,1 af 1,26 × 106 hNEC pr. brønd = 1,26 × 105 H3N2 virale partikler pr. brønd i 30 μL (for 24 brønd)/100 μL (for 12 brønde) - For de resterende brønde til infektionsforsøget tilsættes 50 μL (for 24-brønd)/150 μL (for 12-brønd) 1x dPBS i de apikale kamre i membranindsatserne, inkuberes ved 37 ° C i 10 minutter og fjern 1x dPBS.
- Skift basalmediet i membranindsatserne for at fuldføre RPMI-mediet ved at overføre indsatserne til en ny plade med komplet RPMI tilsat brøndene (350 μL (til 24 brønd) / 700 μL (til 12 brønd)).
BEMÆRK: Når hNESPC'er er fuldt differentieret til hNEC'er, er de tolerante / tilladelige over for forskellige medier i op til 72 timer uden ændringer i morfologi eller organisation, når mediet skiftes til RPMI12. RPMI bruges til at understøtte væksten og vedligeholdelsen af PBMC-befolkningen. - Tilsæt den tilberedte 30 μL (for 24-brønd)/100 μL (for 12-brønd) af virusinokulumet i membranindsatsens apikale kammer, inkuber ved 35 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 1 time, og virusinokulumet fjernes fra det apikale kammer.
- Membranindsatsens basale medium ændres til et friskt komplet RPMI-medium, og inkuberes ved 35 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 24 timer.
- Dag 1 (etablering af hNEC'er + PBMC'er co-kultur)
- Frø det krævede antal PBMC'er i 150 μL (for 24-brønd)/300 μL (for 12-brønd) af komplet RPMI-medium ved direkte at tilsætte PBMC-suspensionen i basalkammeret i hver brønd af uinficerede eller inficerede hNEC'er fra dag 0 (1,5 × 106 for 24-brøndsplader og 3 × 106 for 12-brøndsplader). Inkuber ved 37 °C i 24/48 timer.
BEMÆRK: Det endelige volumen i basalkammeret efter etableringen af samkulturen er 500 μL (for 24-brønd)/1000 μL (for 12-brønd).
- Frø det krævede antal PBMC'er i 150 μL (for 24-brønd)/300 μL (for 12-brønd) af komplet RPMI-medium ved direkte at tilsætte PBMC-suspensionen i basalkammeret i hver brønd af uinficerede eller inficerede hNEC'er fra dag 0 (1,5 × 106 for 24-brøndsplader og 3 × 106 for 12-brøndsplader). Inkuber ved 37 °C i 24/48 timer.
- Dag 2-3 (høst af PBMC'er 48/72 timer efter virusinfektion)
- Indsamling af apikale supernatanter (48/72 timer efter viral infektion)
- Der tilsættes 50 μL (til 24 brønde)/150 μL (til 12 brønde) 1x dPBS til hvert apikalt kammer, og der udruberes ved 37 °C i 10 minutter. Saml 1x dPBS i 1,5 ml rør. Aliquot 25 μL (for 24-brønd)/50 μL (for 12-brønd) af supernatanten til plaque-assay i et nyt 1,5 ml rør og fryses straks både bestanden og alikvoterne ved -80 °C.
- Indsamling af cellulært RNA fra hNEC'er (48/72 timer postviral infektion)
- Overfør membranindsatsen til en ren brønd, tilsæt 300 μL (til 24 brønd) / 600 μL (til 12 brønd) RNA-lysisbuffer til det apikale kammer og inkuber ved rtp i 5 minutter. Saml supernatanten i et 1,5 ml centrifugerør, og opbevar det ved -80 °C indtil RNA-ekstraktion til molekylær analyse.
- Høstning af PBMC'er (48/72 timer efter viral infektion)
- Med den brede base af en steril pipettespids skrabes forsigtigt overfladen af brønden for at løsne de aktiverede PBMC'er, der kan klæbe til brøndoverfladen. Opsaml basalmediet indeholdende PBMC'er i et 2 ml centrifugerør.
- Skyl brøndene 2x med 300 μL 1x dPBS, og saml vasken i det samme 2 ml rør. Centrifugering af 2 ml-røret (500 × g, 5 min, rtp) og opsaml supernatanten i et nyt 2 ml rør uden at forstyrre cellepillen. Supernatanten opbevares ved -80 °C til cytokin- og kemokinanalyse; resuspend cellepillen i 200 μL 1x dPBS.
- Indsamling af apikale supernatanter (48/72 timer efter viral infektion)
6. Flowcytometri
BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen fortsættes direkte fra det foregående afsnit ved hjælp af PBMC-cellesuspensionen fra trin 5.3.3.2. Sørg for minimal lyseksponering under følgende trin i dette afsnit. Et prøvepanel af overfladefarvningsmarkører findes i tabel 2.
- Overfladefarvning
- Overfør den resuspenderede PBMC-cellepille til en 96-V bundbrøndeplade. Centrifugelysat ved 800 × g i 3 min. og fjern supernatanten.
- Inkuber alle PBMC'er (undtagen de "ufarvede") med 100 μL levedygtighedsplet i 15 minutter ved rtp. Påd op til 200 μL med 150 μL MACS-buffer (Magnetic-Enabled Cell Sorting). Centrifugelysere ved 800 × g i 3 min. og kassere supernatanten.
- Forbered et panel af overfladefarvningsantistoffer af interesse med passende fortyndingsforhold og et endeligt volumen på 50 μL pr. reaktion (påløb med MACS-buffer for at opnå det endelige volumen). Udfør overfladefarvning ved at tilsætte 50 μL af den fremstillede antistofblanding til cellerne ved hjælp af en flerkanalspipette. Inkuber ved 4 °C i 15 minutter i mørke.
- Vask ved at tilsætte 150 μL MACS-buffer. Centrifugelysat ved 800 × g i 3 minutter, og kassér supernatanten. Hvis intracellulær farvning ikke er påkrævet, skal du fortsætte direkte til 15 minutters inkubation i trin 6.3.
- Intracellulær farvning (hvis nødvendigt)
- Tilsæt 100 μL af en fikserings- og permeabiliseringsopløsning til hver brønd. Inkuber ved 4 °C i 20 minutter i mørke. Påd brøndene med 100 μL 1x MACS-buffer.
- Centrifugering (800 × g, 3 min, 25 °C), og fjern supernatanten. Gentag vasken ved at tilsætte 200 μL 1x Permeabilization Wash buffer. Centrifugering (500 × g, 3 min, 25 °C), og fjern supernatanten.
- Forbered fortyndingerne til antistofpanelet af interesse for at opnå et endeligt volumen på 50 μL ved hjælp af 1x Permeabilization Wash buffer. Inkuber på is i 30 minutter i mørket. Tilsæt 200 μL 1x Permeabilization Wash buffer.
- Centrifuger cellerne (800 × g, 3 min, 4 °C), og fjern supernatanten. Resuspend cellerne i 100 μL fluorescensaktiveret cellesorteringsbuffer.
- Pipette 200 μL af en lyseropløsning i hver brønd. Inkuber i 15 minutter ved rtp. Centrifugelysat ved 800 × g i 3 minutter og kassér supernatanten.
- Resuspend cellepillerne i 200 μL MACS-buffer. Udfør flowcytometri i overensstemmelse med de tidligere13 beskrevne indstillinger, eller opbevar ved 4 °C i mørke.
7. Bestemmelse af cytokin- og kemokinniveauer
- Proces 25 μL af basalkammersupernatanten ved anvendelse af et immunologisk multipleksassay i henhold til producentens protokol18.
- Beregn koncentrationen af hver analyt ved hjælp af multiplex manager-software ved hjælp af en kurvetilpasningsalgoritme (5 parametre) til standardkurven.
8. Vurdering af viruskontaminering
- Uddrag viralt RNA ved hjælp af et ekstraktionssæt på 4 sæt opløsninger: lager H3N2-opløsningen, MOI 0.1-fortyndingen til infektion, de 10x serielle fortyndinger af MOI 0.1 og basalmediet fra prøverne (både 48 og 72 timer postviral infektion)12.
- Vælg ikke-strukturelt gen (NS1) og matrix (M1) som mål for polymerasekædereaktion (PCR) (se materialetabellen for primere, der anvendes i det repræsentative eksperiment).
- Udfør reverse-transcription-PCR (RT-PCR) (42 °C, 60 min) for at konvertere det virale RNA til cDNA, før du udfører kvantitativ PCR (qPCR) for at måle NS1- og M1-niveauer som proxy for viral tilstedeværelse, og korrelere niveauerne med standardkurven opnået fra RT-qPCR udført på 10x seriel fortynding af MOI 0.1-alikvoten. Se tabel 3 for sammensætningen af reaktionsblandingerne, og anvend følgende betingelser: præinkubering ved 95 °C i 10 minutter efterfulgt af en 3-trins forstærkning i 40 cyklusser: 95 °C i 10 s, 60 °C i 10 s, 72 °C i 30 s; smeltekurve: 95 °C i 10 s, 65 °C i 60 s og 97 °C i 1 s.
9. Plaque assay
- Dag 0: såning af MDCK (Madin Darby Canine Kidney) i 24-brønds plader
- Fjern mediet fra en T75-kolbe med sammenflydende MDCK-celler. Vask 2x med 1x PBS for at fjerne alle spor af serum. Trypsiniser MDCK-cellerne ved at tilsætte 10 ml trypsin og inkubere ved 37 °C i en 5 % CO2 - atmosfære i 20-30 minutter, indtil cellerne løsner sig.
BEMÆRK: Tryk ikke på kolben, da dette kan resultere i klumpning. - Pipette celleophænget i et 15 ml rør indeholdende 2 ml komplet Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM). Centrifuge (300 × g, 5 min, rtp), og fjern supernatanten.
- Resuspend cellerne i 6 ml komplet EMEM. Tæl cellerne ved trypan blå farvning.
- MDCK-cellesuspensionen fortyndes til en koncentration på 1 × 105 celler/ml og frø 1 ml af den fortyndede suspension i hver brønd på en steril plade med 24 brønde. Inkuber ved 37 °C i en 5 % CO2 - atmosfære i 24 timer for at opnå et sammenflydende monolag af MDCK-celler i hver brønd.
- Fjern mediet fra en T75-kolbe med sammenflydende MDCK-celler. Vask 2x med 1x PBS for at fjerne alle spor af serum. Trypsiniser MDCK-cellerne ved at tilsætte 10 ml trypsin og inkubere ved 37 °C i en 5 % CO2 - atmosfære i 20-30 minutter, indtil cellerne løsner sig.
- Dag 1: Infektion af MDCK-celler
- Forbered infektionsmediet. Fjern mediet fra MDCK-monolaget i pladen med 24 brønde, og vask 2x med 1x dPBS. Til den anden vask skal PBS efterlades i brøndene, mens du forbereder serielle fortyndinger af virussen.
- Tø virusprøverne op på is, og fortynd dem serielt i en 24-brønds plade for at opnå serielle fortyndinger fra 10-1 til 10-6.
BEMÆRK: Som et eksempel skal du fylde hver brønd i en 24-brønds plade med 270 μL infektionsmedium. - Tilsæt 30 μL af virusprøven til den første brønd i rækken. Bland godt med en ny pipettespids og overfør til den næste brønd i rækken for at fortynde prøven med 10x. Fortsæt, indtil der er opnået 10-6 fortynding; udfør trin 9.2.1-9.2.3 for alle virusprøver.
- Fjern PBS fra MDCK-pladen, og inficer i to eksemplarer med 100 μL af de tilberedte virale fortyndinger. Til kontrolbrønde tilsættes 100 μL af infektionsmediet (uden virusprøven). Inkuber ved 35 °C i en 5 % CO2 - atmosfære i 1 time, og ryst pladen for at fjerne tørre pletter hvert 15. minut.
- Fjern det virale inokulum, og tilsæt 1 ml flydende overlay for hver brønd. Inkuber ved 35 °C i en 5 % CO2 - atmosfære i 72 timer.
- Dag 4 (72 timer efter infektion): plaque visualisering
- Fjern væskeoverlejringen, og fastgør cellerne med 4% formaldehyd i 1x PBS i 1 time. Fjern formaldehydopløsningen, og vask en gang med 1x PBS eller destilleret vand.
- Pletter de faste celler ved at tilsætte 1% krystalviolet opløsning i 15 minutter. Fjern det krystalviolette farvestof, og vask cellerne med rindende vand. Tør pladen ved rtp.
- Når det er tørt, tæl plaques, og beregn den virale titer i henhold til følgende formel:
Antal plaques × fortyndingsfaktor = Antal plak - Dannende enheder i 100 μL
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Selvom konventionelle T-celler udgør det vigtigste repertoire af adaptivt immunrespons mod virusinfektion for at lette viral clearance, arbejder den medfødte T-cellepopulation på tværs af et bredere spektrum for at undertrykke den virale belastning for effektiv clearance på et senere tidspunkt. Derfor skaber denne protokol specifikt en robust tilstand til at studere medfødte T-celler, deres aktivering og deres funktionelle population efter influenzainfektion uden behov for epitel- og immuncelleprøver fra den samme donor. Denne protokol kan også anvendes på andre vira, selvom den kan være begrænset til vira med apikal frigivelse, dvs. ingen virus bør komme ind i basallaget for at komme i kontakt med PBMC-rummet.
Baseret på de repræsentative resultater i figur 1 kan denne protokol bidrage til at opnå hNESPC-populationer dyrket fra en primærcellesuspension i et 3T3-fødelag. Figur 1 giver en prøve af den forventede progression af hNESPC'erne, efterhånden som de vokser på 3T3-føderlaget. Disse celler vil blive brugt til differentiering i ALI-kulturen for at opnå flerlags hNEC'er, komplet med funktionelle cilierede og bægerceller (figur 4). Ved hjælp af hNEC'erne kan medfødt T-celleaktivering undersøges ved hjælp af flowcytometri. Resultaterne vist i figur 5 viser påvisning af MAIT-celle-, γδ-T-celle- og NK-cellepopulationer, som blev signifikant øget i co-dyrkning, der involverede hNEC'er inficeret med influenzavirus. Denne opsætning kan derefter anvendes på andre stammer af influenzavirus for at drille den universelle befolkning på tværs af stammer såvel som andre vira og deres evne til at aktivere medfødte T-cellepopulationer. Derudover kan detektionspanelet også tilpasses i henhold til den medfødte immuncellepopulation af interesse for at observere deres respektive aktivering under co-kulturbetingelser med inficerede epitelceller.
Figur 1: hNESPPC'er dyrket på et 3T3-fødelag 2/5/10 dage efter såning. Dag 2: Bemærk holmene af hNESPC'er (et eksempel er afgrænset med en hvid pil), der skal observeres 2 dage efter såning på 3T3-fødelaget. Dag 5: De holme, der blev observeret på dag 2, skal nu være større (eksempler på øer af hNESPC'er er afgrænset af grønne cirkler), og 3T3-laget skal observeres for at være degenererende. Dag 10: HNECPS'erne skal dominere hele pladen med få eller ingen 3T3-celler synlige. Skalabjælker for dag 2 og dag 5 = 50 μm baseret på en forstørrelse på 200x, skalabjælke for dag 10 = 100 μm baseret på en forstørrelse på 100x. Forkortelse: hNESPC'er = humane nasalepitelstamme/stamceller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Brønddiagrammer for membranindsatser i plader med 24 brønde og 12 brønde. Bemærk det mellemstore volumen, der skal bruges til hvert rum. hNESPC'er podes i de apikale kamre i membranindsatserne. Forkortelse: hNESPC'er = humane nasalepitelstamme/stamceller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Brønddiagrammer for membranindsatser i 24-brønds og 12-brønds plader til ALI co-kultur etablering. Bemærk det mellemstore volumen, der skal bruges til hvert rum. Bemærk forskellene i medium volumen, der skal anvendes for de forskellige intervaller (2 dage/3 dage) mellem mellemstore ændringer. Forkortelse: ALI = luft-væske interface. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: β4-Tubulin og MUC5AC co-plet af et hNEC-lag. β4-Tubulin er farvet i grønt, mens MUC5AC er farvet i rødt. Kernerne er farvet i blåt med DAPI. MUC5AC indikerer tilstedeværelsen af slimproducerende bægerceller, mens β4-tubulin indikerer tilstedeværelsen af ciliater på cilierede celler. Skalabjælke = 20 μm baseret på 600x forstørrelse. Forkortelser: hNEC = human nasal epitelcelle; MUC5AC = mucin 5AC; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative resultater af PBMC'er inkuberet med eller uden nasal epitel eller influenzainficeret epitel i 24 timer. Aktivering af MAIT-, Vδ1 T-celler, Vδ2 T-celler og NK-celler blev bestemt af celletypespecifikke markører, herunder Vα 7.2 TCR, Vδ1 TCR, Vδ2 TCR, CD56 og CD69-farvning. Værdierne over portene angiver procentdelen af CD69-positive celler. Forkortelser: PBMC'er = mononukleære celler i perifert blod; Epith = nasal epitel; INFLUENZA-Epith = influenzainficerede epitel; MAIT = slimhinde-associerede invariante T-celler; NK = naturlig morder; TCR = T-cellereceptor; CD = klynge af differentiering. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Medium | Opskrift | Sammensætning | Kommentarer |
| Mellem 3 | DMEM / næringsstofblanding F-12 | 500 ml | |
| Vækstfaktor for humant epitel | 5 ng/ml | ||
| Insulin | 2,5 μg/ml | ||
| Koleratoksin | 0,1 nM | ||
| Hydrocortison | 0,5 μg/ml | ||
| 3,3',5-triiodo-l-thyronin | 2 nM | ||
| N-2 supplement | 5 ml | 10 μL/ml | |
| Antibiotikum-antimykotisk | 5 ml | ||
| Differentiering medier | PneumaCult-ALI basalt medium | 441 ml | |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | 50 ml | ||
| Hydrocortisonopløsning (200x) | 2,5 ml | ||
| 0,2 % (2 mg/ml; 1000 IE/ml) heparinnatriumsalt i phosphatbufret saltvand | 1 ml | ||
| Antibiotikum-antimykotisk (100x) | 5 ml | ||
| PneumaCult-ALI vedligeholdelsestillæg (100x) | 500 μL | Kun for at blive tilføjet lige før brug | |
| Komplet Dulbeccos Minimal Essential Medium (DMEM) | DMEM / Høj glukose | 450 ml | |
| Varmeinaktiveret føtal kvægserum | 50 ml | ||
| Antibiotikum-antimykotisk (100x) | 5 ml | ||
| Komplet Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium | RPMI 1640 (w L-glutamin) | 445 ml | |
| Varmeinaktiveret føtal kvægserum | 50 ml | ||
| Antibiotikum-antimykotisk (100x) | 5 ml | ||
| Komplet Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) | EMEM (w L-glutamin) | 450 ml | |
| Varmeinaktiveret føtal kvægserum | 50 ml | ||
| Infektion Medium | EMEM (w L-glutamin) | 4 ml | |
| TPCK Trypsin (500 μg/ml) | 8 μL | Endelig TPCK Trypsinkoncentration på 1 μg/ml | |
| Magnetisk aktiveret cellesorteringsbuffer | 1x PBS | 498 ml | |
| 0,5 M EDTA | 2 ml | ||
| BSA (vævskulturkvalitet) | 2,5 g | ||
| Mitomycin C-suppleret komplet DMEM | Komplet DMEM | 10 ml | |
| Mitomycin C | 500 μL | Mitomycin C (10 μg/ml) |
Tabel 1: Opskrift på anvendte medier.
| Celle overflade markør | Fluorofor |
| Vδ1 T-cellereceptor (TCR) | Fluoresceinisothiocyanat (FITC) |
| Vδ2 TCR | Peridinin-cholorphyll-protein (PerCP) |
| CD3 | V500 |
| CD8 | Allophycocyanin-Cyanin 7 farvestof (APC-Cy7) |
| CD14 | Fycoerythrin (PE)-CF594 |
| Cd56 | Fycoerythrin (PE)-cyanin 7 (Cy7) |
| Svendborg, Svendborg | Strålende violet 421 (BV421) |
| Svendborg, Svendborg | Allophycocyanin (APC) |
| Cd161 | Strålende violet 605 (BV605) |
| Vα 7.2 | Fycoerythrin (PE) |
| Svendborg, Svendborg | Strålende UltraViolet 395 (BUV395) |
Tabel 2: Prøvemarkører til overfladefarvning.
| qPCR-reaktionsblanding | qPCR Master Mix | 5 μL |
| Nukleasefrit vand | 3 μL | |
| Fremadrettet primer (1 mM) | 0,5 μL | |
| Omvendt primer (1 mM) | 0,5 μL | |
| cDNA (12,5 ng/μL) | 1 μL | |
| Samlet reaktionsvolumen | 10 μL | |
| RT-PCR-reaktionsblanding | RT-PCR 5x Buffer | 2,5 μL |
| Tilfældige primere (500 ng/μL) | 0,2 μL | |
| RNase-hæmmer | 0,625 μL | |
| dNTP Mix | 2,5 μL | |
| Omvendt transkriptase | 0,5 μL | |
| RNA (200 ng/μL) | 1 μL | |
| Nukleasefrit vand | 12.675 μL | |
| Samlet reaktionsvolumen | 20 μL |
Tabel 3: Opskrift på reaktionsblandinger af omvendt transkriptionspolymerasekædereaktion (RT-PCR) og kvantitativ PCR (qPCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medfødte immunresponser mod vira er et underunderstuderet fagområde inden for antiviral behandling. Luftvejsepitelcellerne og medfødte immunceller arbejder sammen for at undertrykke viral replikation under en infektion, udover at tjene som en determinant for overaktiv adaptiv respons, hvis den virale belastning ikke holdes i skak 12,13,17. Udviklingen af en relevant human model til undersøgelse af epitel-medfødt immunkrydstale for at undersøge aktiveringen af medfødte immunceller for at give et passende antiviralt respons er dog fortsat en udfordring. Derfor repræsenterer denne ALI co-kulturmodel en alsidig teknik, der kan bruges til at vurdere en lang række interaktioner mellem næseepitellaget og immuncellerne. Da denne model kombinerer in vitro-differentierede hNEC'er, PBMC-aktiveringsanalyse via flowcytometri og virusinfektion, er mange af de afgørende trin blevet klart afgrænset for at sikre succesen med denne protokol. Derudover kan der også foretages yderligere modifikation af den del af luftvejen, der er involveret, hvor in vitro-differentierede celler fra både de øvre og nedre luftveje kan anvendes, hvilket tilføjer endnu et lag af alsidighed til protokollen.
Når man arbejder med epitel-immuncelle crosstalk i virusinfektion, er det imidlertid kritisk, at virusserne ikke interagerer direkte med PBMC'erne for at identificere tidlige lokale epitelafledte opløselige faktorer frigivet af hNEC'erne. Derfor er denne model mere velegnet til at undersøge vira med polariseret virusfrigivelse, hvor vira kun springer ud fra den apikale overflade ind i det apikale kammer, f.eks. influenzavirus12 og SARS-CoV-2-virus19. For at forhindre lækage af apikale frigivelsesvira i basalkammeret, der kompromitterer eksperimentet, er et intakt epitellag af tilstrækkelig tykkelse desuden afgørende. Derfor er det vigtigt, at teer-måling og viral RNA-kvantificering udføres for at sikre, at resultaterne er fri for virale lækager i basalkammeret 13,16,20. En TEER-aflæsning af >1000 indebærer et intakt flerlag af celler, der er egnede til vira med polariseret frigivelse; basalmediet skal være fri for viral RNA-kontaminering 13,15,16. Anvendeligheden af modellen til tovejsfrigivelsesva, såsom rhinovirus, mangler dog stadig at blive undersøgt16. Sådanne vira er ikke begrænset til at frigive deres afkom på en polariseret måde og kan tovejs frigive nye vira i både apikale og basale regioner i epitelet. Yderligere optimering er påkrævet, før denne model kan anvendes på vira med ikke-polariseret frigivelse.
Da denne protokol indebærer at arbejde med humane prøver fra forskellige individer, vil ikke to prøver af hNEC'er udvise de samme egenskaber og svar12,16. For eksempel kan viskositeten af slim produceret af det terminalt differentierede hNEC-lag afvige meget. Hastigheden af cilia udvikling kan også være anderledes. Det er derfor vigtigt at udvise en vis grad af fleksibilitet, når retningslinjerne i denne protokol overholdes. Selvom det bestemt er muligt at anvende epitelcellelinjer, ville dette fjerne kompleksiteten (slim, interaktioner mellem forskellige celletyper) af interaktionerne mellem de forskellige celletyper i epitellaget, hvilket ville være ideelt til undersøgelse af, hvordan epitelkrydstale påvirker PBMC'ernes reaktioner. En primær cellelinje er nødvendig for at efterligne næsevævets fysiologi, hvor cellerne er flerlagede, og de forskellige celletyper er lokaliseret til deres egen individuelle niche, selvom variabilitet kan være et problem. Variabilitet i denne henseende kan overvindes ved at anvende enkeltcellet RNA-sekventering til at differentiere og adskille den heterogene population af celler.
De typer interaktioner, der kan vurderes, er faktisk begrænset af PBMC'ernes og hNEC'ernes oprindelse. Når PBMC'erne og hNEC'erne opnås fra forskellige donorer, er det afgørende at sikre epitelintegritet og adskillelse. Når PBMC'er kommer i kontakt med hNEC'er, kan allogene immunreaktioner forekomme. Derfor er de eneste interaktioner, der er relevante, interaktioner medieret af opløselige faktorer, der kan passere gennem membranindsatserne, som beskrevet i protokollen ovenfor. Men når begge populationer af celler stammer fra det samme individ, har denne model et ekstra lag af nytteværdi, da konventionelle immuncellereaktioner mellem hNEC'erne og PBMC-populationen nu kan vurderes, herunder T-cellemedieret cytotoksicitet og antistofmedierede reaktioner. Derudover kan epigenetiske undersøgelser også udføres for at undersøge, hvordan ændringer i genomet kan påvirke cytokingen / proteinekspression / sekretion.
Desuden kan forskellige cellepopulationer føjes til basalkammeret for yderligere at undersøge en bestemt population. Dette kan udføres ved at isolere cellepopulationerne af interesse (T-celler, NK-celler, monocytter) og indføre dem i basalkammeret i stedet for PBMC'erne. Denne model kan imidlertid ikke bruges til at undersøge cellulære interaktioner, der kræver direkte kontakt på grund af membranens adskillelse af de to cellepopulationer. Som sådan kan undersøgelsen af adaptive immunresponser begrænses af denne detalje. Afslutningsvis tilbyder denne ALI-co-kulturmodel et alsidigt udgangspunkt for in vitro-undersøgelsen af krydstalet mellem næsevæv og immunceller. Protokollen beskrevet i dette manuskript forsøger at give en retningslinje, der vil være nyttig, selvom befolkningerne / forholdene ændres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke forskerstaben i NUS Otolaryngologisk Afdeling og Institut for Mikrobiologi og Immunologi for deres hjælp med hNEC kultur- og viruskulturrelateret arbejde. Vi vil også gerne takke kirurgerne og det kirurgiske team på Rigshospitalet, Otolaryngologisk Afdeling, for deres hjælp med at levere de celle- og blodprøver, der kræves til undersøgelsen.
Denne undersøgelse blev finansieret af National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (til De Yun Wang) og MOH-OFYIRG19may-0007 (til Kai Sen Tan). Kai Sen Tan er modtager af stipendiestøtte fra European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 |
References
- Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
- Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L.
- Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
- Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
- Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M.
- Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).
- Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653 (2016).
- Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).
- Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
- Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
- Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).
- Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986 (2019).
- Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
- Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
- Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).
- Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay,MM_NF-HCP2MAG-62K-PX23?#documentation (2020).
- Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).
- Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).
