Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Cellefraksjonering av U937-celler ved isopycnic tetthetsgradientrensing

Published: August 12, 2021 doi: 10.3791/62119
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne fraksjoneringsprotokollen vil tillate forskere å isolere cytoplasmatiske, kjernefysiske, mitokondrielle og membranproteiner fra pattedyrceller. De to sistnevnte subcellulære fraksjonene blir videre renset via isopycnic tetthetsgradient.

Abstract

Denne protokollen beskriver en metode for å oppnå subcellulære proteinfraksjoner fra pattedyrceller ved bruk av en kombinasjon av vaskemidler, mekanisk lysis og isopynisk tetthetsgradient sentrifugering. Den største fordelen med denne prosedyren er at den ikke er avhengig av eneste bruk av oppløsende vaskemidler for å oppnå subcellulære fraksjoner. Dette gjør det mulig å skille plasmamembranen fra andre membranbundne organeller i cellen. Denne prosedyren vil lette bestemmelsen av proteinlokalisering i celler med en reproduserbar, skalerbar og selektiv metode. Denne metoden har blitt brukt til å isolere cytosoliske, kjernefysiske, mitokondrielle og plasmamembranproteiner fra den humane monocytcellelinjen, U937. Selv om den er optimalisert for denne cellelinjen, kan denne prosedyren tjene som et passende utgangspunkt for subcellulær fraksjonering av andre cellelinjer. Potensielle fallgruver i prosedyren og hvordan du kan unngå dem diskuteres, og det samme er endringer som kanskje må vurderes for andre cellelinjer.

Introduction

Subcellulær fraksjonering er en prosedyre der celler lyses og separeres i deres bestanddeler gjennom flere metoder. Denne teknikken kan brukes av forskere til å bestemme proteinlokalisering i pattedyrceller eller for anrikning av proteiner med lav overflod som ellers ikke ville kunne oppdages. Mens metoder for subcellulær fraksjonering for tiden eksisterer, som kommersielle sett som kan kjøpes, lider de av flere begrensninger som denne prosedyren forsøker å overvinne. De fleste cellefraksjoneringsmetoder er utelukkende vaskemiddelbaserte1,2, avhengig av bruk av buffere som inneholder økende mengder vaskemiddel for å oppløse forskjellige cellulære komponenter. Selv om denne metoden er rask og praktisk, resulterer den i urene fraksjoner. Disse er designet for å tillate forskere å enkelt isolere en eller to komponenter i cellen, men er ikke komplekse nok til å isolere flere subcellulære fraksjoner fra en prøve samtidig. Å stole utelukkende på vaskemidler resulterer vanligvis i membranlukkede organeller og plasmamembranen blir ukritisk oppløselig, noe som gjør separasjon av disse komponentene vanskelig. En ekstra komplikasjon ved bruk av disse settene er manglende evne til forskere å endre / optimalisere dem for spesifikke applikasjoner, da de fleste komponentene er proprietære formuleringer. Endelig kan disse settene være uoverkommelig dyre, med begrensninger i antall bruksområder som gjør dem mindre enn ideelle for større prøver.

Til tross for tilgjengeligheten av sett for isolering av mitokondrier som ikke er avhengige av vaskemidler, er de ikke designet for å isolere plasmamembranen og gi betydelig lavere mengder prøve enn standard isolasjonsprotokoller 3,4. Mens differensielle sentrifugeringsmetoder er mer tidkrevende, resulterer de ofte i forskjellige fraksjoner som ikke kan oppnås med utelukkende vaskemiddelbaserte sett1. Separasjon uten bruk av løselige vaskemidler tillater også ytterligere rensing ved bruk av ultracentrifugation og isopycnic tetthetsgradienter, noe som resulterer i mindre krysskontaminering. Denne fraksjoneringsprotokollen demonstrerer isoleringen av subcellulære fraksjoner fra U937-monocytter ved bruk av en kombinasjon av vaskemiddel- og høyhastighets sentrifugeringsbaserte tilnærminger. Denne metoden vil lette isoleringen av kjernefysiske, cytoplasmatiske, mitokondrielle og plasmamembrankomponenter i en pattedyrcelle med minimal forurensning mellom fraksjonene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered buffere og reagenser

  1. Forbered friske løsninger av fosfatase og proteasehemmere.
    1. Tilsett 17,4 mg fenylmetansulfonylfluorid (PMSF)til 1 ml 100% etanol for å fremstille et lager på 100 mM.
      MERK: Bruk verneutstyr ved håndtering av PMSF, da det er farlig ved inntak eller innånding og ved kontakt med hud eller øyne. Det er etsende for øyne og hud.
    2. I henhold til produsentens instruksjoner, lag en kommersielt tilgjengelig proteasehemmercocktail (100x).
    3. Tilsett 91,9 mg natriumortovanadat (SOV) til 1 ml avionisert vann for å tilberede en 500 mM stammasse.
      MERK: Bruk verneutstyr ved håndtering av SOV, da det er farlig ved inntak, innånding eller ved kontakt med øynene. Alvorlig overeksponering kan føre til døden.
  2. Forbered lysisbuffer A, cytoplasmatisk isolasjon (CI) buffer, celleoppløseliggjøring (CS) buffer, nukleær lysis (NL) buffer, lysis buffer B, cellehomogenisering (CH) buffer, jodixanol fortynningsmiddel og vaskemidler.
    1. Tilsett 8,7 g natriumklorid (NaCl) og 50 ml 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES, 1 M, pH 7,4) til 950 ml avionisert vann for å fremstille lysisbuffer A (endelige konsentrasjoner på 150 mM NaCl og 50 mM HEPES).
    2. Forbered stamløsninger av vaskemidler som følger: Tilsett 0,1 g natriumdodecylsulfat (SDS) til 10 ml lysisbuffer A (endelig konsentrasjon på 1% SDS), tilsett 0,1 g natriumdeoksykolat til 10 ml lysisbuffer A (endelig konsentrasjon på 1%), tilsett 2,5 mg digitonin til 10 ml lysisbuffer A (endelig konsentrasjon på 250 μg / ml), og tilsett 1 ml ikke-ionisk, ikke-denaturerende vaskemiddel (se materialtabellen) til 9 ml lysisbuffer A (endelig konsentrasjon på 10 % (v/v)).
    3. Klargjør CI-buffer ved å tilsette 10 μL PMSF-stammasse (100 mM), 10 μL proteasehemmer (100x), 2 μL SOV-stammasse (500 mM) og 100 μL lagerdigitonin (250 μg/ml) til 878 μL lysisbuffer A (endelige konsentrasjoner av 1 mM PMSF, 1x proteasehemmer, 1 mM SOV og 25 μg/ml digitonin). Hold løsningen på is til tilsetning til cellepellets.
    4. Klargjør CS-buffer ved å tilsette 10 μL PMSF-stammasse (100 mM), 10 μL proteasehemmer (100x), 2 μL SOV-stammasse (500 mM), 100 μL ikke-ionisk, ikke-denaturerende vaskemiddelbeholdning (se materialtabellen) (10%) og 118 μL heksylenglykolbeholdning (8,44 M) til 760 μL lysisbuffer A (endelige konsentrasjoner på 1 mM PMSF, 1x proteasehemmer, 1 mM SOV, 1% ikke-ionisk, ikke-denaturerende vaskemiddel og 1 M heksylenglykol). Hold løsningen på is til tilsetning til cellepellets.
    5. Klargjør NL-buffer ved å tilsette 10 μL PMSF-stam (100 mM), 10 μL proteasehemmer (100x), 2 μL SOV-stammasse (500 mM), 50 μL natriumdeoksykolatbestand (10 %), 100 μL SDS-stamfisk (1 %) og 118 μL heksylenglykolbestand (8,44 M) til 710 μL lysisbuffer A (endelige konsentrasjoner på 1 mM PMSF, 1x proteasehemmer, 1 mM SOV, 0,5 % natriumdeoksykolat (v/v), 0,1 % SDS (w/v) og 1 M heksylenglykol). Hold løsningen på is til tilsetning til kjernepellets.
    6. Tilsett 20 ml HEPES (1 M, pH 7,4), 0,74 g kaliumklorid (KCl), 0,19 g magnesiumklorid (MgCl 2), 2 ml etylendiamintetraeddiksyre (0,5 M EDTA),2 ml etylenglykol-bis(β-aminoetyleter)-N,N,N',N'-tetraeddiksyre (0,5 M EGTA), 38,3 g mannitol og 23,9 g sukrose til 980 ml avionisert vann for å fremstille lysisbuffer B (endelige konsentrasjoner på 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol og 70 mM sukrose).
    7. Forbered CH-buffer ved å tilsette 10 μL PMSF-lager (100 mM) og 2 μL SOV-lager (500 mM) til 988 μL lysisbuffer B (endelige konsentrasjoner på 1 mM PMSF og 1 mM SOV; juster det endelige volumet for å imøtekomme antall celler som lyser). Hold løsningen på is til tilsetning til cellepellets.
    8. Forbered jodxanol fortynningsmiddel ved tilsetning av 12 ml HEPES (1 M, pH 7,4), 447 mg KCl, 114 g MgCl 2, 1,2 ml 0,5 M EDTA,1,2 ml 0,5 M EGTA, 21,3 g mannitol og 14,4 g sukrose til 88 ml avionisert vann (endelige konsentrasjoner på 120 mM HEPES, 60 mM KCl, 12 mM MgCl2, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM mannitol og 420 mM sukrose).
    9. Oppbevar buffere ved 4 °C og digitonin ved -20 °C.

2. Cytosolisk proteinisolasjon

MERK: Følgende trinn vil tillate vekst og utvidelse av U937-celler etterfulgt av ekstraksjon av cytosoliske proteiner. Ved konsentrasjonen som brukes, vil digitonin permeabilisere plasmamembranen uten å forstyrre den, noe som muliggjør frigjøring av cytosoliske proteiner og retensjon av andre cellulære proteiner.

  1. Dyrk cellene i RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C og 5% CO2. Sørg for at cellene dyrkes til en endelig total på 6 x 108 celler.
    MERK: I denne protokollen ble celler talt ved hjelp av et standard hemocytometer og mikroskop.
  2. Sentrifuge de dyrkede cellene ved 400 × g i 10 minutter. Etter at supernatanten er kastet, resuspenderes cellepelleten i romtemperatur fosfatbufret saltvann (PBS) ved en endelig konsentrasjon på 4 × 106 celler/ml, og pipetten forsiktig for å bryte opp klumper.
  3. Sentrifuge cellesuspensjonen ved 400 × g i 10 minutter for å pelletere cellene. Kast supernatanten, og resuspendere cellepelleten i iskald lysebuffer A (fremstilt i trinn 1.2.1) ved en endelig konsentrasjon på 2 × 107 celler/ml.
  4. Fjern 7,5 ml av cellene suspendert i lysisbuffer A (3 × 107 celler), og hold på is for kjernefysisk proteinekstraksjon (seksjon 6). Sentrifuger cellesuspensjonen ved 4 °C, 400 × g i 10 minutter for å pelletere cellene.
    MERK: Utfør alle påfølgende trinn ved 4 °C eller på is, og forkjøl alle buffere.
  5. Kast supernatanten, resuspend cellepelleten i CI-bufferen ved en endelig konsentrasjon på 2 × 107 celler/ml, og pipette forsiktig for å bryte opp klumper. Roter cellesuspensjonen ende-over-ende ved 4 °C i 20 minutter.
  6. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 4 °C, 400 × g i 10 minutter, og overfør supernatanten til et rent sentrifugerør. Lagre cellepelleten, og oppbevar på is. Sentrifuge den oppsamlede supernatanten ved 4 °C, 18 000 × g i 20 minutter for å pelletere cellulært rusk.
    MERK: Dette høyhastighets sentrifugeringstrinnet er avgjørende for å forhindre kontaminering av cytosolisk fraksjon med organelle og membranbundne proteiner.
  7. Kast pelleten etter overføring av supernatanten til et rent sentrifugerør. Gjenta begge sentrifugeringstrinnene i trinn 2.6 til ingen pellet oppnås etter sentrifugering.
  8. Samle supernatanten, som er den cytosoliske fraksjonen. For korttidsoppbevaring (1 måned), sørg for at supernatanten oppbevares ved 4 °C. For langtidsoppbevaring (>1 måned) kombiner supernatanten med 1x Laemmli-buffer som inneholder 1x reduksjonsmiddel, varme ved 95 °C i 7 minutter og oppbevar ved -20 eller -80 °C.
  9. Resuspendere cellepelleten (fra trinn 2.6) i lysisbuffer A ved en endelig konsentrasjon på 4 × 106 celler/ml; pipette forsiktig for å bryte opp klumper.

3. Cell homogenisering

MERK: Følgende trinn vil tillate mekanisk homogenisering av digitoninbehandlede celler (fra trinn 2.9), som er nødvendig for isolering av mitokondrielle og membranproteinfraksjoner.

  1. Sentrifuger cellesuspensjonen i lysisbuffer A (fremstilt i trinn 2.9), lagre pelleten og kast supernatanten for å fjerne overflødig digitonin og cytosoliske forurensninger fra cellepelleten.
    MERK: Gjentatte vasker i lysebuffer A kan utføres for å fjerne overflødig cytosolisk forurensning.
  2. Resuspendere cellepelleten i iskald CH-buffer (fremstilt i trinn 1.2.7) ved en endelig konsentrasjon på 4 × 106 celler/ml. Inkuber cellesuspensjonen på is i 30 minutter.
  3. Hvis du bruker en perlebasert metode for mekanisk lysis, plasser 30 g forvasket rustfritt stål 3,2 mm perler i et 50 ml skjørtrør, fyll med 15 ml lysisbuffer B og legg på is for å avkjøle. Hvis du bruker en Dounce homogenisator (med en tettsittende B-pestle), fyll med et passende volum lysisbuffer B, sett inn pestle og legg på is for å avkjøle.
  4. Etter inkubasjon (trinn 3.2), kast lysisbuffer B fra dråperørene (eller Dounce homogenisator), og overfør 15 ml av cellesuspensjonen til perlerøret (eller et passende volum til homogenisatoren).
  5. Hvis du bruker den perlebaserte metoden, plasserer du de skjørtede perlerørene som inneholder cellesuspensjonen i blenderenheten, og konfigurerer den til å kjøre i 5 minutter ved hastighet 8. Hvis du bruker en Dounce homogenisator, hold den på is, og utfør 40 passerer med pestle ved hjelp av langsomme, jevne slag (eller bruk en alternativ metode for mekanisk cellelyse som beskrevet i diskusjonsdelen).
    MERK: Hvis du bruker en annen blenderenhet enn den som brukes her, kan det hende at hastighet og tid må bestemmes empirisk.
  6. Overfør homogenatet til et rent sentrifugerør, og sentrifuger det ved 400 × g i 10 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et rent sentrifugerør og spar; kast pelleten.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her og homogenatet lagres ved 4 °C på kort sikt (24 timer).

4. Fjerning av rusk og isolering av rå mitokondrielle og membranfraksjoner

MERK: Følgende trinn vil tillate fjerning av cellulært rusk ved å sentrifugere homogenatet ved økende hastigheter. Dette etterfølges av differensiell sentrifugering for isolering av rå mitokondrielle og membranfraksjoner.

  1. Sentrifuge homogenatet (fra trinn 3.6) ved 500 × g i 10 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et rent sentrifugerør, og kast eventuell pellet.
  2. Sentrifuge supernatanten (fra trinn 4.1) ved 1000 × g i 10 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et rent sentrifugerør, og kast eventuell pellet.
  3. Sentrifuge supernatanten (fra trinn 4.2) ved 2000 × g i 10 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et rent sentrifugerør, og kast eventuell pellet.
  4. Sentrifuge supernatanten (fra trinn 4.3) ved 4000 × g i 20 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et rent sentrifugerør, og lagre pelleten, som er den rå mitokondrielle fraksjonen.
  5. Sentrifuge supernatanten (fra trinn 4.4) ved 18 000 × g i 1 time ved 4 °C. Kast supernatanten, og lagre pelleten, som er den rå membranfraksjonen.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her, og de pelleterte prøvene lagres ved 4 °C på kort sikt (24 timer).

5. Isopycnic tetthet gradient rensing

MERK: Følgende trinn benytter isopycnic tetthetsgradient sentrifugering for å rense de rå mitokondrielle og membranfraksjonene.

  1. Klargjør en 50% (v / v) arbeidsløsning av jodxanol ved å blande 1 del fortynningsmiddel (fremstilt i trinn 1.1.3) til 5 deler jodxanol (60% stamløsning (w / v)). Forbered 10%, 15%, 20%, 25%, 30% og 35% jodixanolløsninger (v / v) ved å blande 50% arbeidsløsning (v / v) med lysisbuffer B i passende mengder.
  2. Resuspend de rå mitokondrielle og membranpellets (fra trinn 4.4 og 4.5) hver i 200 μL lysisbuffer B. Juster til 45% jodxanol (v / v) ved å tilsette 1800 μL arbeidsjodixanoloppløsning (50% (v / v)) til 200 μL av den resuspended pelleten.
  3. Lag en iodixanol diskontinuerlig gradient som følger (juster volumene etter behov for kapasiteten til ultracentrifuge-røret): Tilsett 1 ml 15% jodxanol (v / v) til bunnen av et 8 ml, åpent, tynnvegget ultrasentrifugerør, plasser 1 ml 20% jodixanol (v / v) under det første laget (ved underliggende teknikk), etterfulgt av underlag 1 ml på 25%, 1 ml på 30 % og 1 ml på 35 % jodxanol (v/v).
    MERK: Det skal opprettes 2 gradienter på dette trinnet, 1 for mitokondriell fraksjon og 1 for membranfraksjonen.
  4. I 1 gradient, legg til 2 ml av rå mitokondriell pellet (suspendert i 45% jodxanol (v / v)) ved hjelp av underlagsteknikken til bunnen av røret under 35% jodxanol (v / v). I den andre gradienten legger du til 2 ml av råoljemembranpelleten (suspendert i 45% jodxanol (v / v)) ved hjelp av underlagsteknikken til bunnen av røret under 35% jodxanol (v / v).
  5. Tilsett 1 ml 10% jodxanol (v / v) til toppen av hvert gradientrør ved å legge det på toppen av 15% laget. Balanser rørene innen 0,1 g av hverandre ved tilsetning av 10% jodxanol (v / v).
  6. Spinn tetthetsgradientrørene ved 4 °C i 18 timer ved 100 000 × g. Pass på å sette akselerasjon og retardasjon til minimumsverdiene for ultracentrifugen som brukes.
    MERK: I mitokondriell gradient vil det være et synlig bånd ved grensesnittet mellom 25% og 30% jodxanol (v / v). Dette er den rene mitokondrielle fraksjonen. I membrangradienten vil det være et synlig bånd i 15% jodxanol (v / v) fraksjonen. Dette er den rene membranfraksjonen. Det kan være flere bånd i 25% og 30% iodixanol (v / v) fraksjonene i membrangradienten. Dette er mitokondriell forurensning.
  7. Samle fraksjoner fra toppen av røret i 1 ml aliquots, vær forsiktig med å minimere volumet av fraksjonen som inneholder de synlige båndene og endre pipettespissen etter at hvert lag er samlet. Alternativt kan du punktere siden av det tynnveggede røret med en nål, og samle de synlige båndene.
  8. Oppbevar prøvene som beskrevet i trinn 2.8 til verifisering ved proteinanalyse og western blot.

6. Nukleær protein isolasjon

MERK: Ved hjelp av ioniske og ikke-ioniske vaskemidler samt teknikker som sonikering og sentrifugering, vil følgende trinn oppløse alle cellulære membraner og tillate isolering av nukleære proteiner.

  1. Sentrifuge 7,5 ml aliquot av celler suspendert i lysisbuffer A (fra trinn 2.4), og kast supernatanten. Tilsett 800 μL iskald CS-buffer (fremstilt i trinn 1.2.4), og resuspender pelleten ved pipettering og virvel. Inkuber prøvene på is (eller ved 4 ° C) i 30 minutter for å forstyrre plasma- og organellemembranene mens du beskytter atomproteinene.
  2. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 7000 × g i 10 minutter ved 4 °C, og kast supernatanten. Tilsett 800 μL iskald NL-buffer (fremstilt i trinn 1.2.5) til kjernepelleten etter inklusjon av 1U/μL benzonase. Resuspend pelleten ved forsiktig pipettering. Inkuber på en ende-over-ende-rotator i 30 minutter ved 4 °C for å forstyrre kjernemembranen.
  3. Sonikere for 5 s ved 20% effekt med prøverør avkjølt i et isbad (3x, med 5 s pauser mellom pulser), som sammen med benzonase (tilsatt i trinn 6.2), vil skjære nukleinsyrene.
  4. Sentrifuger sonikatet ved 7 800 × g i 10 minutter ved 4 °C. Samle og lagre supernatanten, som er atomfraksjonen. Pass på at du ikke forstyrrer den uoppløselige pelleten mens du samler supernatanten. For lagring kan prøver fremstilles som beskrevet i trinn 2.8.

7. Proteinkvantifisering og western blot-analyse

MERK: Følgende trinn vil kvantifisere totalt protein i hver fraksjon og bekrefte renheten av de subcellulære fraksjonene.

  1. Utfør en standard Bradford-analyse for å kvantifisere totalt protein i hver fraksjon. Se tabell 1 for forventede proteinutbytter.
    Andre proteinanalyser som bicinchoninic acid (BCA) analyse eller absorbans ved 280 nm kan brukes til å måle totalt protein i stedet for en Bradford-analyse.
  2. Kombiner fraksjoner med 1x Laemmli buffer som inneholder 1x reduksjonsmiddel, og varme ved 95 °C i 7 min. Legg 10 μg av hver fraksjon i en standard SDS-polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) gel, og kjør gelen ved 20 mA i 1 time.
  3. Overfør de oppløste proteinene til en polyvinyldifluorid (PVDF) membran ved å utføre en standard immunoblotoverføring ved 100 V i 30 minutter. Blokker PVDF-membranen med 5% melk i 1x Tris-bufret saltvann (TBS) som inneholder 0,1% av et ikke-ionisk vaskemiddel (v / v) i 30 minutter ved romtemperatur.
  4. Tilsett passende primære antistoffer for å oppdage rengjøringsproteiner som er spesifikke for hver subcellulære fraksjon, og inkuber over natten ved 4 ° C. Vask membranen med 5% melk i 1x TBS som inneholder 0,1% av det ikke-ioniske vaskemiddelet (v / v) i 10 minutter ved romtemperatur.
    MERK: For denne protokollen ble antistoffer mot glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH, 1: 10000), histon H3 (1: 2000), spenningsavhengig anionkanal (VDAC, 1: 1000) og Na, K + -ATPase brukt for henholdsvis cytosoliske, kjernefysiske, mitokondrielle og membranfraksjoner.
  5. Tilsett passende pepperrotperoksidase (HRP)-konjugerte sekundære antistoffer til membranen (fortynnet i henhold til produsentens instruksjoner), og inkuber ved romtemperatur i 1 time. Vask membranen med 5% melk i 1x TBS som inneholder 0,1% av det ikke-ioniske vaskemiddelet (v / v) i 10 minutter ved romtemperatur. Utvikle flekken ved hjelp av standard kjemiluminescens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et skjematisk flytskjema for denne prosedyren (figur 1) oppsummerer visuelt trinnene som ble tatt for å fraksjonere U9375-celler dyrket i suspensjon. Fraksjoner samlet fra toppen av isopycnic tetthetsgradienten i like store mengder (1 ml) viser rensing av mitokondrielle og membranfraksjoner (figur 2). Ved bruk av et antistoff mot VDAC, et protein lokalisert til den ytre mitokondrielle membranen6, viser at mitokondriell fraksjon migrerte til 25% og 30% jodixanol (v / v) fraksjonene (figur 2A). Ved hjelp av et antistoff mot Na,K+-ATPase α1-underenheten, en del av en integrert membran heterodimer som hovedsakelig finnes i plasmamembranen7, viser separasjonen av membrankontaminering fra den rene mitokondrielle fraksjonen (figur 2A). Den rene membranfraksjonen migrerte til de minst tette fraksjonene, 10% og 15% jodixanol (v / v) (figur 2B). Mitokondriell forurensning av membranfraksjonen ble separert av gradienten.

En western blot8 utført med de ekstra lokaliseringsmarkørene (referert i trinn 7.4) viser renheten til cytosoliske og nukleære fraksjoner, samtidig som det verifiseres at mitokondrie- og membranprøvene er fri for forurensning av proteiner fra andre deler av cellen (figur 3). Bruk av et antistoff mot GAPDH, normalt lokalisert til cytoplasmaet til cellen9, viser at dette proteinet bare finnes i den cytosoliske fraksjonen (figur 3A, Lane 1, første panel), og at det ikke observeres forurensning i de ekstraherte nukleære proteinene, de tetthetsrensede mitokondriene eller membranfraksjonene (figur 3A; Felt 2, 3 og 4; første panel). Sondering for histon H3, et protein som finnes i kjernen og er involvert i kromatinstruktur10, viser en vellykket nukleær ekstraksjon (figur 3A, Lane 2, andre panel), med minimal deteksjon i cytoplasmatisk fraksjon og ingen krysskontaminering i mitokondrielle eller membranfraksjoner.

Sondering for VDAC i alle fraksjoner viser tilstedeværelsen av dette proteinet i den rene mitokondrielle fraksjonen (figur 3A, bane 3, tredje panel), og at det ikke finnes krysskontaminering i de andre fraksjonene (figur 3A; Felt 1, 2 og 4; tredje panel). Sondering for Na/K-ATPase α1-underenheten viser på samme måte at dette proteinet bare befinner seg i den rene membranfraksjonen (figur 3A, bane 4, fjerde panel). Disse fraksjonene ble analysert ved densitometri for å bekrefte reproduserbarhet og statistisk signifikans (figur 3B-E). I motsetning til resultatene fra den vellykkede fraksjoneringen (figur 3), kan feil utførelse av denne metoden (eller manglende overholdelse av alle anbefalte trinn) føre til krysskontaminering av cellulære komponenter (figur 4). En høy konsentrasjon av histon H3 i den cytosoliske fraksjonen (figur 4, Lane 1, andre panel) kan skyldes manglende avklaring av cytosolisk fraksjon (referert i trinn 2.6). Dette kan skje hvis ikke nok avklaringssentrifugespinn utføres, eller hvis den cytosoliske fraksjonen ikke avklares raskt. Hvis cytosolisk fraksjon ikke avklares raskt nok, kan det føre til lysis av cellefragmenter, noe som fører til forurensning av cytosolisk fraksjon.

Unnlatelse av å utføre isopycnic tetthetsrensetrinnet vil resultere i forurensning av membranfraksjonen (figur 4, lane 4, alle paneler), avhengig av hvor heterogen prøven er før tetthetsrensing. Riktig overholdelse av alle trinnene i protokollen er avgjørende for å oppnå ønsket separasjon av de subcellulære fraksjonene. Når kvantifisert ved hjelp av en Bradford-analyse, kan proteinutbyttet for hver fraksjon bestemmes. Forventet proteinutbytte per fraksjon er rapportert i tabell 1. Det er nyttig å utføre en proteinkvantifiseringsanalyse før du utfører vestlige flekker av flere grunner. For det første bekrefter det at fraksjoner faktisk inneholder protein; for det andre tillater det lasting av SDS-PAGE-geler basert på proteinmengde; og til slutt, forutsatt at proteinutbyttet er lik de som forventes (tabell 1), bekrefter det riktig utførelse av prosedyren.

Figure 1
Figur 1: Diagram over prosedyren for cellefraksjonering. En oversikt over cellefraksjoneringsprotokollen representert som et flytskjema. Forkortelser: PBS = fosfatbufret saltvann; CS = celleoppløselighet; NL = nukleær lyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Isopycnic tetthet rensing av rå mitokondrielle og membranfraksjoner . (A) Representativ vestlig flekk av alle fraksjoner samlet etter tetthetsgradientrensing av den rå mitokondrielle fraksjonen. (B) Representativ vestlig flekk av alle fraksjoner samlet etter tetthetsgradientrensing av den rå membranfraksjonen. Begge tetthetsgradientrensingene viser migrasjon av mitokondriell markør, VDAC, for 25% og 30% jodixanol (v / v) fraksjoner og migrasjon av membranmarkøren, Na, K + ATPase, for 10% og 15% jodixanol (v / v) fraksjoner. Forkortelse: VDAC = spenningsavhengig anionkanal. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Vellykket isolering av U937 cytosoliske, kjernefysiske, mitokondrielle og membranfraksjoner. (A) Representative vestlige flekker av cellefraksjoner isolert fra en U937-cellekultur med denne teknikken og undersøkt for markører av cytoplasma (GAPDH, første panel), kjerne (Histon H3, andre panel), mitokondrier (VDAC, tredje panel) og membran (Na, K + ATPase α1, fjerde panel). (B-E) Densitometri av vestlige flekker av cellefraksjoner isolert fra U937-cellekulturer med denne teknikken. Resultatene er fra 3 uavhengige eksperimenter. Feilfelt representerer standardavvik. Enveis ANOVA. s<0.001. Forkortelser: GAPDH = glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase; VDAC = spenningsavhengig anionkanal; cyto = cytosolisk; nuc = kjernefysisk; mito = mitokondrielt; mem = membran. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Ufullstendig fraksjonering av U937-cellekomponenter. Representative vestlige klumper av cellefraksjoner isolert fra en U937-cellekultur som viser forurensning av den cytosoliske fraksjonen med histon H3 (Lane 1, andre panel) på grunn av feil avklaring av denne fraksjonen og en rå membranfraksjon som ikke ble utsatt for isopycnic tetthetsgradientrensing (Lane 4, alle paneler). Forkortelser: cyto = cytosolisk; nuc = kjernefysisk; mito = mitokondrielt; mem = membran. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Brøkdel Utbytte (μg/ml) Standardavvik Omtrentlig volum
Cytoplasma 1500 146 5 ml
Kjerne 1200 172 500 μL
Mitokondrier 400 66 500 μL
Membran 200 23 500 μL

Tabell 1: Proteinutbytte for hver subcellulære fraksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne metoden er en modifisert versjon av en tidligere publisert tilnærming til subcellulær fraksjonering uten bruk av høyhastighets sentrifugering11. Denne modifiserte metoden krever mer spesialisert utstyr for å oppnå de beste resultatene, men er mer omfattende og konsekvent reproduserbar.

Utviklingen av den opprinnelige protokollen var nødvendig på grunn av manglende evne til å skille mitokondrielle og membranprøver for analyse av proteinlokalisering under nekroptose12. Forsøk på å bruke de utelukkende vaskemiddelbaserte metodene som finnes i de fleste kommersielt tilgjengelige settene resulterte i en homogen blanding som inneholdt plasmamembranen og alle membranlukkede organeller i cellen. Andre begrensninger av disse settene inkluderer manglende evne til å gjøre endringer i prosedyren, kostnad per prøve, volumbegrensninger og antall prøver som kan behandles. Prosedyren som presenteres her kan endres til hvilken som helst skala, endres for å isolere færre fraksjoner, og kan utføres uten bruk av dyre reagenser. Brøkutbyttet kan økes ved å utnytte flere celler; trinn kan skreddersys til forskningen som utføres; og utførelsen av metoden er fleksibel. For eksempel, hvis forskere ikke undersøker en bestemt subcellulær fraksjon, trenger de ikke å isolere den prøven i løpet av prosedyren. På samme måte kan tilsetning av bestemte hemmere eller reagenser utelates dersom forskeren ikke planlegger å studere fosforyleringstilstanden til proteiner (natriumortovanadat) eller ikke er bekymret for denaturerende proteiner (heksylenglykol).

Bruken av jodxanol som tetthetsgradientløsning er valgfri; Dette reagenset forstyrrer imidlertid ikke etterfølgende undersøkelse av prøver via Western blotting. Det er også mulig å fjerne iodaxanol fra prøver ved fortynning og sentrifugering for å gjenopprette mitokondriene eller membranen, selv om dette vil påvirke det endelige utbyttet. Andre alternative tetthetsgradientløsninger kan brukes, inkludert sukrose. For å oppnå optimale resultater og rene fraksjoner er det flere faktorer å vurdere, og spesielle kritiske trinn i protokollen som krever nøye oppmerksomhet. Denne protokollen er optimalisert for fraksjonering av U937-celler, og konsentrasjonen av celler som anbefales på bestemte punkter i protokollen, er spesifikk for denne cellelinjen. Disse verdiene ble bestemt empirisk og vil mest sannsynlig måtte justeres for forskjellige typer celler, spesielt hvis suboptimale resultater oppnås ved utføring av protokollen.

Klargjøring av cytoplasmatisk prøve bør skje så snart som mulig for å fjerne ubrutte celler og rusk som kan føre til krysskontaminering av proteiner fra andre subcellulære fraksjoner (figur 4, Lane 1, andre panel). Homogenisering kan oppnås med enhver form for mekanisk lysis, selv om resultatene som presenteres her ble oppnådd ved hjelp av en perlebasert metode og blenderanordning. Alternative manuelle former for homogenisering (en Dounce homogenisator eller passasje gjennom en liten gauge nål) kan også benyttes, men kan resultere i reproduserbarhetsproblemer på grunn av variasjon av teknikk av den enkelte som utfører prosedyren. Denne gruppens interesse er først og fremst i sirkulerende leukocytter, og derfor brukes U937-celler i denne prosedyren. Imidlertid kan denne prosedyren brukes på andre suspensjonscellelinjer med sannsynligvis lite behov for endring. Deler som kanskje må justeres for å imøtekomme en annen suspensjonscellelinje inkluderer cellekonsentrasjoner som brukes gjennom hele prosedyren, samt konsentrasjonen av digitonin som brukes til å trekke ut den cytosoliske fraksjonen.

Selv om den ikke er optimalisert for adherente cellelinjer, kan denne prosedyren tjene som et utgangspunkt for hvilke justeringer som kan gjøres for å imøtekomme adherente celler. Disse justeringene inkluderer cellekonsentrasjon, konsentrasjon av digitonin og homogeniseringstid. I tillegg er adherente celler begrenset av overflateareal mens suspensjonsceller er begrenset av volum; Dette gjør oppskalering av suspensjonsceller enklere. For å skalere opp adherente celler må vevskulturplater med stort overflateareal (>500 cm2) benyttes. Denne prosedyren er en kostnadseffektiv, reproduserbar subcellulær fraksjonering med evnen til å skille cytosoliske, kjernefysiske, mitokondrielle og membranfraksjoner med stor renhet. En av de største fordelene ved denne prosedyren er separasjonen av mitokondriell fra membranfraksjonen. Dette er ikke mulig i utelukkende vaskemiddelbaserte prosedyrer. Selv om vaskemidler brukes i denne prosedyren, brukes de til å permeabilisere, men ikke forstyrre plasmamembranen (digitonin) og for å oppnå kjernefraksjonen etter isolering av mitokondrielle og membranfraksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH R15-HL135675-01 og NIH 2 R15-HL135675-02 til T.J.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance 61-BB50-DX
digitonin Sigma D141
end-over-end rotator ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E3889
GAPDH (14C10)  Cell Signalling Technologies 2118
HEPES VWR 97064-360
Hexylene glycol Sigma 68340
Igepal Sigma I7771 Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl Sigma P9333
Mannitol Sigma M9647
MgCl2 Sigma M8266
NaCl Sigma S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm Seton Scientific 7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium Sigma D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML
refrigerated centrifuge ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma 436143
Sodium deoxycholate Sigma D6750
sodium orthovanadate (SOV) Sigma 567540
sonicator ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm Next Advance SSB32
Sucrose Sigma S0389
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 97062-370
Tween 20 non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
  2. Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
  4. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  5. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  6. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  7. Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
  8. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  9. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  10. Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
  11. McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
  12. McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).

Tags

Biokjemi utgave 174 Cellulær fraksjonering Nuclear Mitochondria Membran Cytoplasma Organeller Ultracentrifugation Density Gradient U937

Erratum

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 05/31/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 07/22/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Cellefraksjonering av U937-celler ved isopycnic tetthetsgradientrensing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCaig, W. D., Deragon, M. A.,… More

McCaig, W. D., Deragon, M. A., Truong, P. V., Knapp, A. R., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. J. Vis. Exp. (174), e62119, doi:10.3791/62119 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter