Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Cellefraktionering af U937-celler ved isopycnic densitetsgradientrensning

Published: August 12, 2021 doi: 10.3791/62119
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne fraktioneringsprotokol giver forskere mulighed for at isolere cytoplasmatiske, nukleare, mitokondrie- og membranproteiner fra pattedyrceller. De to sidstnævnte subcellulære fraktioner renses yderligere via isopycnic densitetsgradient.

Abstract

Denne protokol beskriver en metode til opnåelse af subcellulære proteinfraktioner fra pattedyrceller ved hjælp af en kombination af vaskemidler, mekanisk lysis og isopycnic densitetsgradientcentrifugering. Den største fordel ved denne procedure er, at den ikke er afhængig af den eneste anvendelse af opløselige vaskemidler for at opnå subcellulære fraktioner. Dette gør det muligt at adskille plasmamembranen fra andre membranbundne organeller i cellen. Denne procedure vil lette bestemmelsen af proteinlokalisering i celler med en reproducerbar, skalerbar og selektiv metode. Denne metode er med succes blevet anvendt til at isolere cytosoliliske, nukleare, mitokondrielle og plasmamembranproteiner fra den humane monocytcellelinje, U937. Selvom den er optimeret til denne cellelinje, kan denne procedure tjene som et passende udgangspunkt for den subcellulære fraktionering af andre cellelinjer. Potentielle faldgruber i proceduren, og hvordan man undgår dem, diskuteres, ligesom ændringer, der muligvis skal overvejes for andre cellelinjer.

Introduction

Subcellulær fraktionering er en procedure, hvor celler lyseres og adskilles i deres bestanddele gennem flere metoder. Denne teknik kan bruges af forskere til at bestemme proteinlokalisering i pattedyrceller eller til berigelse af proteiner med lav forekomst, som ellers ikke ville kunne detekteres. Mens der i øjeblikket findes metoder til subcellulær fraktionering, ligesom kommercielle kits, der kan købes, lider de af flere begrænsninger, som denne procedure forsøger at overvinde. De fleste cellefraktioneringsmetoder er udelukkende vaskemiddelbaserede1,2, der er afhængige af brugen af buffere, der indeholder stigende mængder vaskemiddel til at opløse forskellige cellulære komponenter. Selvom denne metode er hurtig og praktisk, resulterer den i urene fraktioner. Disse er designet til at give forskere mulighed for let at isolere en eller to komponenter i cellen, men er ikke komplekse nok til at isolere flere subcellulære fraktioner fra en prøve på samme tid. At stole udelukkende på vaskemidler resulterer normalt i membranlukkede organeller, og plasmamembranen opløses vilkårligt, hvilket gør adskillelse af disse komponenter vanskelig. En yderligere komplikation fra brugen af disse kits er forskernes manglende evne til at ændre / optimere dem til specifikke applikationer, da de fleste af komponenterne er proprietære formuleringer. Endelig kan disse sæt være uoverkommeligt dyre med begrænsninger i antallet af anvendelser, der gør dem mindre end ideelle til større prøver.

På trods af tilgængeligheden af sæt til isolering af mitokondrier, der ikke er afhængige af vaskemidler, er de ikke designet til at isolere plasmamembranen og give betydeligt lavere mængder prøve end standardisoleringsprotokoller 3,4. Mens differentielle centrifugeringsmetoder er mere tidskrævende, resulterer de ofte i forskellige fraktioner, der ikke kan opnås med udelukkende vaskemiddelbaserede sæt1. Separation uden udelukkende brug af opløselige vaskemidler tillader også yderligere rensning ved hjælp af ultracentrifugering og isopycniske densitetsgradienter, hvilket resulterer i mindre krydskontaminering. Denne fraktioneringsprotokol demonstrerer isolering af subcellulære fraktioner fra U937-monocytter ved hjælp af en kombination af vaskemiddel- og højhastighedscentrifugeringsbaserede tilgange. Denne metode vil lette isoleringen af de nukleare, cytoplasmatiske, mitokondrielle og plasmamembrankomponenter i en pattedyrcelle med minimal forurening mellem fraktionerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered buffere og reagenser

  1. Forbered friske opløsninger af fosfatase og proteasehæmmere.
    1. Tilsæt 17,4 mg phenylmethanesulfonylfluorid (PMSF) til 1 ml 100% ethanol for at fremstille en 100 mM bestand.
      BEMÆRK: Brug beskyttelsesudstyr, når du håndterer PMSF, da det er farligt, når det indtages eller indåndes og ved kontakt med hud eller øjne. Det er ætsende for øjne og hud.
    2. I henhold til producentens anvisninger skal du forberede en kommercielt tilgængelig proteasehæmmercocktail (100x).
    3. Tilsæt 91,9 mg natriumortovanadat (SOV) til 1 ml deioniseret vand for at forberede en 500 mM bestand.
      BEMÆRK: Brug beskyttelsesudstyr, når du håndterer SOV, da det er farligt, hvis det indtages, indåndes eller ved kontakt med øjnene. Alvorlig overeksponering kan resultere i døden.
  2. Forbered lysisbuffer A, cytoplasmatisk isolering (CI) buffer, celleopløselse (CS) buffer, nuklear lyse (NL) buffer, lysis buffer B, cellehomogenisering (CH) buffer, iodixanol fortyndingsmiddel og vaskemidler.
    1. Der tilsættes 8,7 g natriumchlorid (NaCl) og 50 ml 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES, 1 M, pH 7,4) til 950 ml deioniseret vand for at fremstille lysisbuffer A (slutkoncentrationer på 150 mM NaCl og 50 mM HEPES).
    2. Forbered stamopløsninger af vaskemidler som følger: Tilsæt 0,1 g natriumdodecylsulfat (SDS) til 10 ml lysisbuffer A (endelig koncentration på 1% SDS), tilsæt 0,1 g natriumdeoxycholat til 10 ml lysisbuffer A (endelig koncentration på 1%), tilsæt 2,5 mg digitonin til 10 ml lysisbuffer A (endelig koncentration på 250 μg / ml), og tilsæt 1 ml nonionisk, ikke-denaturerende vaskemiddel (se materialetabellen) til 9 ml lysisbuffer A (endelig koncentration på 10% (v/v)).
    3. Der fremstilles CI-buffer ved at tilføje 10 μL PMSF-lager (100 mM), 10 μL proteasehæmmer (100x), 2 μL SOV-bestand (500 mM) og 100 μL lagerdigitalisering (250 μg/ml) til 878 μL lysisbuffer A (slutkoncentrationer af 1 mM PMSF, 1x proteasehæmmer, 1 mM SOV og 25 μg/ml digitonin). Hold opløsningen på is, indtil der tilsættes cellepellet.
    4. Forbered CS-buffer ved at tilføje 10 μL PMSF-lager (100 mM), 10 μL proteasehæmmer (100x), 2 μL SOV-lager (500 mM), 100 μL non-ionisk, ikke-denaturerende vaskemiddelbestand (se materialetabellen) (10%) og 118 μL hexylenglycolstam (8,44 M) til 760 μL lysisbuffer A (endelige koncentrationer på 1 mM PMSF, 1x proteasehæmmer, 1 mM SOV, 1% ikke-ionisk, ikke-denaturerende vaskemiddel og 1 M hexylenglycol). Hold opløsningen på is, indtil der tilsættes cellepellet.
    5. Der fremstilles NL-buffer ved at tilsætte 10 μL PMSF-lager (100 mM), 10 μL proteasehæmmer (100x), 2 μL SOV-bestand (500 mM), 50 μL natriumdeoxycholatbestand (10%), 100 μL SDS-lager (1%) og 118 μL hexylenglycolbestand (8,44 M) til 710 μL lysisbuffer A (slutkoncentrationer på 1 mM PMSF, 1x proteasehæmmer, 1 mM SOV, 0,5% natriumdeoxycholat (v/v), 0,1% SDS (w/v) og 1 M hexylenglycol). Hold opløsningen på is, indtil der tilsættes nuklear pellet.
    6. Der tilsættes 20 ml HEPES (1 M, pH 7,4), 0,74 g kaliumchlorid (KCl), 0,19 g magnesiumchlorid (MgCl 2), 2 ml ethylendiamintetraeddikesyre (0,5 M EDTA),2 ml ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraeddikesyre (0,5 M EGTA), 38,3 g mannitol og 23,9 g saccharose til 980 ml deioniseret vand til fremstilling af lysisbuffer B (slutkoncentrationer på 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol og 70 mM saccharose).
    7. Der fremstilles CH-buffer ved at tilføje 10 μL PMSF-lager (100 mM) og 2 μL SOV-lager (500 mM) til 988 μL lysisbuffer B (endelige koncentrationer på 1 mM PMSF og 1 mM SOV; juster det endelige volumen for at imødekomme antallet af celler, der lyseres). Hold opløsningen på is, indtil der tilsættes cellepellet.
    8. Der fremstilles iodixanolfortyndingsmiddel ved tilsætning af 12 ml HEPES (1 M, pH 7,4), 447 mg KCl, 114 g MgCl 2, 1,2 ml 0,5 M EDTA,1,2 ml 0,5 M EGTA, 21,3 g mannitol og 14,4 g saccharose til 88 ml deioniseret vand (slutkoncentrationer på 120 mM HEPES, 60 mM KCl, 12 mM MgCl2, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM mannitol og 420 mM saccharose).
    9. Buffere opbevares ved 4 °C og digitonin ved -20 °C.

2. Cytosolisk proteinisolering

BEMÆRK: Følgende trin giver mulighed for vækst og ekspansion af U937-celler efterfulgt af ekstraktion af cytosoliske proteiner. Ved den anvendte koncentration vil digitonin gennemtrænge plasmamembranen uden at forstyrre den, hvilket muliggør frigivelse af cytosoliske proteiner og tilbageholdelse af andre cellulære proteiner.

  1. Dyrkning af cellerne i RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum ved 37 °C og 5% CO2. Sørg for, at cellerne dyrkes til en endelig total på 6 x 108 celler.
    BEMÆRK: I denne protokol blev celler talt ved hjælp af et standard hæmocytometer og mikroskop.
  2. Centrifuger de dyrkede celler ved 400 × g i 10 min. Efter kassation af supernatanten suspenderes cellepelleten i rumtemperaturphosphatbufferet saltvand (PBS) i en slutkoncentration på 4 × 106 celler/ml og pipetteres forsigtigt for at nedbryde klumper.
  3. Centrifuger cellesuspensionen ved 400 × g i 10 minutter for at pelletere cellerne. Supernatanten kasseres, og cellepelleten gensuspenderes i iskold lysisbuffer A (fremstillet i trin 1.2.1) i en slutkoncentration på 2 × 107 celler/ml.
  4. 7,5 ml af cellerne suspenderet i lysisbuffer A (3 × 107 celler) fjernes, og der holdes is til nuklear proteinekstraktion (afsnit 6). Centrifuger cellesuspensionen ved 4 °C, 400 × g i 10 minutter for at pelletere cellerne.
    BEMÆRK: Udfør alle efterfølgende trin ved 4 °C eller på is, og prechill alle buffere.
  5. Supernatanten kasseres, cellepelleten i CI-bufferen genudsættes i en slutkoncentration på 2 × 107 celler/ml, og pipetteres forsigtigt for at nedbryde klumper. Celleophænget drejes ende-over-end ved 4 °C i 20 minutter.
  6. Cellesuspensionen centrifugeres ved 4 °C, 400 × g i 10 minutter, og supernatanten overføres til et rent centrifugerør. Gem cellepillen, og opbevar den på is. Den opsamlede supernatant centrifugeres ved 4 °C, 18.000 × g i 20 minutter for at pelletere celleaffald.
    BEMÆRK: Dette højhastighedscentrifugeringstrin er afgørende for at forhindre forurening af den cytosoliske fraktion med organelle og membranbundne proteiner.
  7. Kassér pelleten efter overførsel af supernatanten til et rent centrifugerør. Begge centrifugeringstrin gentages i trin 2.6, indtil der ikke opnås pellets efter centrifugering.
  8. Saml supernatanten, som er den cytosoliske fraktion. Ved kortvarig opbevaring (1 måned) skal det sikres, at supernatanten opbevares ved 4 °C. Til langtidsopbevaring (>1 måned) kombineres supernatanten med 1x Laemmli buffer indeholdende 1x reduktionsmiddel, opvarmes ved 95 °C i 7 minutter og opbevares ved -20 eller -80 °C.
  9. Cellepelleten (fra trin 2.6) i lysisbuffer A resuspenderes ved en slutkoncentration på 4 × 106 celler/ml; pipette forsigtigt for at bryde klumper op.

3. Cellehomogenisering

BEMÆRK: Følgende trin giver mulighed for mekanisk homogenisering af digitoninbehandlede celler (fra trin 2.9), hvilket er nødvendigt for isolering af mitokondrie- og membranproteinfraktionerne.

  1. Centrifuger cellesuspensionen i lysisbuffer A (forberedt i trin 2.9), gem pelleten, og kassér supernatanten for at fjerne overskydende digitonin og cytosoliske forurenende stoffer fra cellepelleten.
    BEMÆRK: Gentagne vasker i lysisbuffer A kan udføres for at fjerne overskydende cytosoliske forurenende stoffer.
  2. Cellepelleten i iskold CH-buffer (fremstillet i trin 1.2.7) suspenderes i en slutkoncentration på 4 × 106 celler/ml. Inkuber cellesuspensionen på is i 30 min.
  3. Hvis du bruger en perlebaseret metode til mekanisk lysis, skal du placere 30 g forvaskede 3,2 mm perler i rustfrit stål i et 50 ml skørt rør, fylde med 15 ml lysisbuffer B og lægge på is for at køle. Hvis du bruger en Dounce-homogenisator (med en tætsluttende B-pistil), skal du fylde med et passende volumen lysisbuffer B, indsætte pistlen og lægge den på is for at køle af.
  4. Efter inkubation (trin 3.2) kasseres lysisbuffer B fra perlerørene (eller Dounce-homogenisatoren) og overføres 15 ml cellesuspension til perlerøret (eller et passende volumen til homogenisatoren).
  5. Hvis du bruger den perlebaserede metode, skal du placere de skørtede perlerør, der indeholder cellesuspensionen, i blenderenheden og konfigurere til at køre i 5 minutter ved hastighed 8. Hvis du bruger en Dounce-homogenisator, skal du holde den på is og udføre 40 passager med pistlen ved hjælp af langsomme, jævne streger (eller bruge en alternativ metode til mekanisk cellelyse som beskrevet i diskussionsafsnittet).
    BEMÆRK: Hvis du bruger en blenderenhed, der er forskellig fra den, der bruges her, skal hastighed og tid muligvis bestemmes empirisk.
  6. Homogenatet overføres til et rent centrifugerør, og det centrifugeres ved 400 × g i 10 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et rent centrifugerør og gem; Kassér pelleten.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, og homogenatet opbevares ved 4 °C på kort sigt (24 timer).

4. Fjernelse af affald og isolering af rå mitokondrie- og membranfraktioner

BEMÆRK: Følgende trin gør det muligt at fjerne cellulært affald ved centrifugering af homogenatet ved stigende hastigheder. Dette efterfølges af differentiel centrifugering til isolering af rå mitokondrie og membranfraktioner.

  1. Homogenatet centrifugeres (fra trin 3.6) ved 500 × g i 10 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et rent centrifugerør, og kassér enhver pellet.
  2. Supernatanten centrifugeres (fra trin 4.1) ved 1.000 × g i 10 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et rent centrifugerør, og kassér enhver pellet.
  3. Supernatanten centrifugeres (fra trin 4.2) ved 2.000 × g i 10 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et rent centrifugerør, og kassér enhver pellet.
  4. Supernatanten centrifugeres (fra trin 4.3) ved 4.000 × g i 20 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et rent centrifugerør, og gem pelleten, som er den rå mitokondriefraktion.
  5. Supernatanten centrifugeres (fra trin 4.4) ved 18.000 × g i 1 time ved 4 °C. Kassér supernatanten, og gem pelleten, som er den rå membranfraktion.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, og pelleteringsprøverne opbevares ved 4 °C på kort sigt (24 timer).

5. Isopycnic densitetsgradient rensning

BEMÆRK: Følgende trin anvender isopycnic densitetsgradientcentrifugering til at rense de rå mitokondrie- og membranfraktioner.

  1. Der fremstilles en 50% (v/v) arbejdsopløsning af iodixanol ved at blande 1 del fortyndingsmiddel (fremstillet i trin 1.1.3) til 5 dele iodixanol (60% stamopløsning (w/v)). Der fremstilles 10%, 15%, 20%, 25%, 30% og 35% iodixanolopløsninger (v/v) ved at blande 50% arbejdsopløsning (v/v) med lysisbuffer B i passende mængder.
  2. De rå mitokondrie- og membranpellets (fra trin 4.4 og 4.5) hver i 200 μL lysisbuffer B. Juster til 45% iodixanol (v/v) ved at tilsætte 1800 μL arbejdende iodixanolopløsning (50% (v/v)) til 200 μL af den resuspenderede pellet.
  3. Opret en diskontinuerlig gradient af iodixanol som følger (juster volumenerne efter behov for ultracentrifugerørets kapacitet): Tilsæt 1 ml 15% iodixanol (v / v) til bunden af et 8 ml, åbent, tyndvægget ultracentrifugerør, læg 1 ml 20% iodixanol (v / v) under det første lag (ved underlagsteknikken) efterfulgt af underlag 1 ml på 25%, 1 ml på 30% og 1 ml på 35% iodixanol (v/v).
    BEMÆRK: Der skal oprettes 2 gradienter på dette trin, 1 for mitokondriefraktionen og 1 for membranfraktionen.
  4. I 1 gradient tilsættes 2 ml rå mitokondriepellet (suspenderet i 45% iodixanol (v / v)) ved hjælp af underlagsteknikken til bunden af røret under 35% iodixanol (v / v). I den anden gradient tilsættes 2 ml råmembranpellet (suspenderet i 45% iodixanol (v / v)) ved hjælp af underlagsteknikken til bunden af røret under 35% iodixanol (v / v).
  5. Tilsæt 1 ml 10% iodixanol (v / v) til toppen af hvert gradientrør ved at overlejre det oven på 15% laget. Balance rørene inden for 0,1 g fra hinanden ved tilsætning af 10% iodixanol (v / v).
  6. Centrifugeringsrørene drejes ved 4 °C i 18 timer ved 100.000 × g. Sørg for at indstille acceleration og deceleration til minimumsværdierne for den ultracentrifuge, der bruges.
    BEMÆRK: I mitokondriegradienten vil der være et synligt bånd ved grænsefladen mellem 25% og 30% iodixanol (v / v). Dette er den rene mitokondriefraktion. I membrangradienten vil der være et synligt bånd i fraktionen 15% iodixanol (v/v). Dette er den rene membranfraktion. Der kan være yderligere bånd i 25% og 30% iodixanol (v / v) fraktioner i membrangradienten. Dette er mitokondrie forurening.
  7. Saml fraktioner fra toppen af røret i 1 ml aliquoter, og vær omhyggelig med at minimere volumenet af fraktionen, der indeholder de synlige bånd, og skift pipettespidsen, efter at hvert lag er opsamlet. Alternativt kan du punktere siden af det tyndvæggede rør med en nål og samle de synlige bånd.
  8. Prøverne opbevares som beskrevet i trin 2.8 indtil verifikation ved proteinanalyse og western blot.

6. Isolering af nukleart protein

BEMÆRK: Ved hjælp af ioniske og ikke-ioniske vaskemidler samt teknikker som sonikering og centrifugering vil følgende trin opløse alle cellulære membraner og muliggøre isolering af nukleare proteiner.

  1. Der centrifugeres 7,5 ml aliquot af celler suspenderet i lysisbuffer A (fra trin 2.4), og supernatanten kasseres. Der tilsættes 800 μL iskold CS-buffer (fremstillet i trin 1.2.4), og pelleten genoptages ved pipettering og hvirveldannelse. Prøverne inkuberes på is (eller ved 4 °C) i 30 minutter for at forstyrre plasma- og organellemembranerne og samtidig beskytte de nukleare proteiner.
  2. Cellesuspensionen centrifugeres ved 7.000 × g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres. Der tilsættes 800 μL iskold NL-buffer (fremstillet i trin 1.2.5) til kernepelleten efter inkludering af 1U/μL benzonase. Resuspender pelleten ved forsigtigt at pipette. Inkuberes på en end-over-end rotator i 30 minutter ved 4 °C for at forstyrre kernemembranen.
  3. Sonicat i 5 s ved 20% effekt med prøverør afkølet i et isbad (3x, med 5 s pauser mellem pulser), som sammen med benzonase (tilføjet i trin 6.2) vil forskyde nukleinsyrerne.
  4. Sonikatet centrifugeres ved 7.800 × g i 10 minutter ved 4 °C. Saml og gem supernatanten, som er den nukleare fraktion. Sørg for ikke at forstyrre den uopløselige pille, mens du samler supernatanten. Til opbevaring kan prøver fremstilles som beskrevet i trin 2.8.

7. Proteinkvantificering og western blot-analyse

BEMÆRK: Følgende trin kvantificerer det samlede protein i hver fraktion og bekræfter renheden af de subcellulære fraktioner.

  1. Udfør et standard Bradford-assay for at kvantificere det samlede protein i hver fraktion. Der henvises til tabel 1 for forventede proteinudbytter.
    BEMÆRK: Andre proteinassays såsom bicinchoninsyre (BCA) assay eller absorbans ved 280 nm kan anvendes til at måle total protein i stedet for et Bradford-assay.
  2. Kombiner fraktioner med 1x Laemmli buffer indeholdende 1x reduktionsmiddel, og opvarm ved 95 °C i 7 min. Læg 10 μg af hver fraktion i en standard SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) gel, og kør gelen ved 20 mA i 1 time.
  3. Overfør de opløste proteiner til en polyvinyldifluorid (PVDF) membran ved at udføre en standard immunoblotoverførsel ved 100 V i 30 min. Bloker PVDF-membranen med 5% mælk i 1x Tris-buffered saltvand (TBS), der indeholder 0,1% af et ikke-ionisk vaskemiddel (v / v) i 30 minutter ved stuetemperatur.
  4. Tilsæt de relevante primære antistoffer for at detektere husholdningsproteiner, der er specifikke for hver subcellulær fraktion, og inkuberes natten over ved 4 °C. Membranen vaskes med 5% mælk i 1x TBS indeholdende 0,1% af det ikke-ioniske vaskemiddel (v/v) i 10 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Til denne protokol blev antistoffer mod glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH, 1:10000), histon H3 (1:2000), spændingsafhængig anionkanal (VDAC, 1:1000) og Na,K+-ATPase anvendt til henholdsvis cytosoliliske, nukleare, mitokondrielle og membranfraktioner.
  5. Tilsæt de passende peberrodperoxidase (HRP)-konjugerede sekundære antistoffer til membranen (fortyndes i henhold til producentens anvisninger) og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time. Membranen vaskes med 5% mælk i 1x TBS indeholdende 0,1% af det ikke-ioniske vaskemiddel (v/v) i 10 minutter ved stuetemperatur. Udvikl pletten ved hjælp af standard kemiluminescens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et skematisk rutediagram over denne procedure (figur 1) opsummerer visuelt de trin, der blev taget for at fraktionere U9375-celler dyrket i suspension. Fraktioner indsamlet fra toppen af den isopycnic densitetsgradient i lige store mængder (1 ml) viser rensningen af mitokondrie- og membranfraktionerne (figur 2). Brug af et antistof mod VDAC, et protein lokaliseret til den ydre mitokondriemembran6, viser, at mitokondriefraktionen migrerede til 25% og 30% iodixanol (v / v) fraktioner (figur 2A). Ved hjælp af et antistof mod underenheden Na,K+-ATPase α1, en del af en integreret membran heterodimer, der primært findes i plasmamembranen7, viser adskillelsen af membranforurening fra den rene mitokondriefraktion (figur 2A). Den rene membranfraktion migrerede til de mindst tætte fraktioner, 10% og 15% iodixanol (v/v) (figur 2B). Mitokondrieforurening af membranfraktionen blev adskilt af gradienten.

En western blot8 udført med de yderligere lokaliseringsmarkører (refereret i trin 7.4) viser renheden af de cytosoliske og nukleare fraktioner, samtidig med at det verificeres, at mitokondrie- og membranprøverne er fri for forurening med proteiner fra andre dele af cellen (figur 3). Brug af et antistof mod GAPDH, normalt lokaliseret til cytoplasmaet i celle9, viser, at dette protein kun findes i den cytosoliske fraktion (figur 3A, bane 1, første panel), og at der ikke observeres nogen forurening i de ekstraherede nukleare proteiner, de densitetsoprensede mitokondrier eller membranfraktioner (figur 3A; Bane 2, 3 og 4; første panel). Sondering for histon H3, et protein, der findes i kernen og er involveret i kromatinstruktur10, viser en vellykket nuklear ekstraktion (figur 3A, bane 2, andet panel) med en vis minimal detektion i den cytoplasmatiske fraktion og ingen krydskontaminering i mitokondrie- eller membranfraktionerne.

Sondering for VDAC i alle fraktioner viser tilstedeværelsen af dette protein i den rene mitokondriefraktion (figur 3A, bane 3, tredje panel), og at der ikke findes krydskontaminering i de andre fraktioner (figur 3A; Bane 1, 2 og 4; tredje panel). Undersøgelser for Na/K-ATPase α1-underenheden viser ligeledes, at dette protein kun er placeret i den rene membranfraktion (figur 3A, bane 4, fjerde panel). Disse fraktioner blev analyseret ved densitometri for at bekræfte reproducerbarhed og statistisk signifikans (figur 3B-E). I modsætning til resultaterne fra den vellykkede fraktionering (figur 3) kan forkert udførelse af denne metode (eller manglende overholdelse af alle anbefalede trin) resultere i krydskontaminering af cellulære komponenter (figur 4). En høj koncentration af histon H3 i den cytosoliske fraktion (figur 4, bane 1, andet panel) kan skyldes, at cytosolfraktionen ikke afklares korrekt (refereret i trin 2.6). Dette kan forekomme, hvis der ikke udføres nok afklaringscentrifugespins, eller hvis den cytosoliske fraktion ikke afklares hurtigt. Hvis den cytosoliske fraktion ikke afklares hurtigt nok, kan det resultere i lysis af cellefragmenter, hvilket fører til forurening af den cytosoliske fraktion.

Manglende udførelse af det isopycnic densitetsrensningstrin vil resultere i forurening af membranfraktionen (figur 4, bane 4, alle paneler), afhængigt af hvor heterogen prøven er før densitetsrensning. Korrekt overholdelse af alle trin i protokollen er afgørende for at opnå den ønskede adskillelse af de subcellulære fraktioner. Når det kvantificeres ved hjælp af et Bradford-assay, kan proteinudbyttet for hver fraktion bestemmes. Forventet proteinudbytte pr. fraktion er rapporteret i tabel 1. Det er nyttigt at udføre et proteinkvantificeringsassay inden udførelse af western blots af flere grunde. For det første bekræfter det, at fraktioner faktisk indeholder protein; for det andet tillader det indlæsning af SDS-PAGE geler baseret på proteinmængde; og endelig, forudsat at proteinudbyttet svarer til det forventede (tabel 1), bekræfter det korrekt udførelse af proceduren.

Figure 1
Figur 1: Diagram over cellefraktioneringsproceduren. En oversigt over cellefraktioneringsprotokollen repræsenteret som et rutediagram. Forkortelser: PBS = fosfatbufferet saltvand; CS = celleopløsning; NL = nuklear lyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Isopyknisk densitetsrensning af rå mitokondrie- og membranfraktioner . (A) Repræsentativ western blot af alle fraktioner indsamlet efter densitetsgradientrensning af den rå mitokondriefraktion. (B) Repræsentativ western blot af alle fraktioner indsamlet efter densitetsgradientrensning af råmembranfraktionen. Begge densitetsgradifikationer viser migration af mitokondriemarkøren, VDAC, for 25% og 30% iodixanol (v / v) fraktioner og migration af membranmarkøren, Na, K + ATPase, for 10% og 15% iodixanol (v / v) fraktioner. Forkortelse: VDAC = spændingsafhængig anionkanal. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Vellykket isolering af U937 cytosoliske, nukleare, mitokondrielle og membranfraktioner. (A) Repræsentative vestlige blots af cellefraktioner isoleret fra en U937-cellekultur med denne teknik og undersøgt for markører for cytoplasma (GAPDH, første panel), kerne (Histone H3, andet panel), mitokondrier (VDAC, tredje panel) og membran (Na, K + ATPase α1, fjerde panel). (B-E) Densitometri af vestlige blots af cellefraktioner isoleret fra U937 cellekulturer med denne teknik. Resultaterne er fra 3 uafhængige eksperimenter. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelse. Envejs ANOVA. s<0,001. Forkortelser: GAPDH = glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase; VDAC = spændingsafhængig anionkanal; cyto = cytosolisk; nuc = nuklear; mito = mitokondrie; mem = membran. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Ufuldstændig fraktionering af U937-cellekomponenter. Repræsentative vestlige blots af cellefraktioner isoleret fra en U937-cellekultur, der viser forurening af den cytosoliske fraktion med histon H3 (bane 1, andet panel) på grund af forkert afklaring af denne fraktion og en rå membranfraktion, der ikke blev udsat for isopycnic densitetsgradientrensning (bane 4, alle paneler). Forkortelser: cyto = cytosolisk; nuc = nuklear; mito = mitokondrie; mem = membran. Klik her for at se en større version af denne figur.

Brøk Udbytte (μg/ml) Standardafvigelse Omtrentlig volumen
Cytoplasma 1500 146 5 ml
Nucleus 1200 172 500 μL
Mitokondrier 400 66 500 μL
Membran 200 23 500 μL

Tabel 1: Proteinudbytte for hver subcellulær fraktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne metode er en modificeret version af en tidligere offentliggjort tilgang til subcellulær fraktionering uden brug af højhastighedscentrifugering11. Denne modificerede metode kræver mere specialiseret udstyr for at opnå de bedste resultater, men er mere omfattende og konsekvent reproducerbar.

Udviklingen af den oprindelige protokol var nødvendig på grund af manglende evne til at adskille mitokondrie- og membranprøver til analyse af proteinlokalisering under nekroptose12. Forsøg på at anvende de udelukkende vaskemiddelbaserede metoder, der findes i de fleste kommercielt tilgængelige kits, resulterede i en homogen blanding indeholdende plasmamembranen og alle membranlukkede organeller i cellen. Andre begrænsninger i disse sæt inkluderer manglende evne til at foretage ændringer i proceduren, omkostninger pr. prøve, volumenbegrænsninger og antal prøver, der kan behandles. Den procedure, der præsenteres her, kan ændres til enhver skala, ændres for at isolere færre fraktioner og kan udføres uden brug af dyre reagenser. Brøkudbytter kan øges ved at udnytte flere celler; trin kan skræddersys til den forskning, der udføres; og udførelsen af metoden er fleksibel. For eksempel, hvis forskere ikke undersøger en bestemt subcellulær fraktion, behøver de ikke at isolere prøven i løbet af proceduren. Ligeledes kan tilsætningen af bestemte hæmmere eller reagenser udelades, hvis forskeren ikke planlægger at studere phosphoryleringstilstanden af proteiner (natriumortovanadat) eller ikke er bekymret for denaturerende proteiner (hexylenglycol).

Anvendelsen af iodixanol som densitetsgradientopløsning er valgfri; Dette reagens forstyrrer imidlertid ikke efterfølgende undersøgelse af prøver via Western blotting. Det er også muligt at fjerne iodaxanol fra prøver ved fortynding og centrifugering for at genvinde mitokondrierne eller membranen, selvom dette vil påvirke det endelige udbytte. Andre alternative densitetsgradientopløsninger kan anvendes, herunder saccharose. For at opnå optimale resultater og rene fraktioner er der flere faktorer at overveje og særlige kritiske trin i protokollen, der kræver omhyggelig opmærksomhed. Denne protokol er optimeret til fraktionering af U937-celler, og koncentrationen af celler, der anbefales på bestemte punkter i protokollen, er specifik for denne cellelinje. Disse værdier blev bestemt empirisk og skal sandsynligvis justeres for forskellige typer celler, især hvis der opnås suboptimale resultater ved udførelse af protokollen.

Afklaring af den cytoplasmatiske prøve bør ske så hurtigt som muligt for at fjerne ubrudte celler og snavs, der kan resultere i krydskontaminering af proteiner fra andre subcellulære fraktioner (figur 4, bane 1, andet panel). Homogenisering kan opnås med enhver form for mekanisk lyse, selvom resultaterne præsenteret her blev opnået ved hjælp af en perlebaseret metode og blenderanordning. Alternative manuelle former for homogenisering (en Dounce homogenisator eller passage gennem en lille gauge nål) kan også anvendes, men kan resultere i reproducerbarhedsproblemer på grund af variation i teknikken hos den person, der udfører proceduren. Denne gruppes interesse er primært i cirkulerende leukocytter, hvorfor U937-celler anvendes i denne procedure. Denne procedure kan dog anvendes på andre suspensionscellelinjer med sandsynligvis ringe behov for ændring. Dele, der muligvis skal justeres for at rumme en anden suspensionscellelinje, omfatter cellekoncentrationer, der anvendes under hele proceduren, samt koncentrationen af digitonin, der anvendes til at ekstrahere den cytosoliske fraktion.

Selvom den ikke er optimeret til klæbende cellelinjer, kan denne procedure tjene som udgangspunkt, som der kan foretages justeringer for at imødekomme klæbende celler. Disse justeringer omfatter cellekoncentration, koncentration af digitonin og homogeniseringstid. Derudover er klæbende celler begrænset af overfladeareal, mens suspensionsceller er begrænset af volumen; Dette gør opskalering af suspensionsceller enklere. For at opskalere klæbende celler skal vævskulturplader med et stort overfladeareal (>500 cm2) anvendes. Denne procedure er en omkostningseffektiv, reproducerbar subcellulær fraktionering med evnen til at adskille cytosoliske, nukleare, mitokondrie og membranfraktioner med stor renhed. En af de største fordele ved denne procedure er adskillelsen af mitokondrie fra membranfraktionen. Dette er ikke muligt i udelukkende vaskemiddelbaserede procedurer. Selvom vaskemidler anvendes i denne procedure, bruges de til at gennemtrænge, men ikke forstyrre plasmamembranen (digitonin) og til at opnå den nukleare fraktion efter isolering af mitokondrie- og membranfraktionerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH R15-HL135675-01 og NIH 2 R15-HL135675-02 til T.J.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance 61-BB50-DX
digitonin Sigma D141
end-over-end rotator ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E3889
GAPDH (14C10)  Cell Signalling Technologies 2118
HEPES VWR 97064-360
Hexylene glycol Sigma 68340
Igepal Sigma I7771 Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl Sigma P9333
Mannitol Sigma M9647
MgCl2 Sigma M8266
NaCl Sigma S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm Seton Scientific 7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium Sigma D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML
refrigerated centrifuge ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma 436143
Sodium deoxycholate Sigma D6750
sodium orthovanadate (SOV) Sigma 567540
sonicator ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm Next Advance SSB32
Sucrose Sigma S0389
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 97062-370
Tween 20 non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
  2. Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
  4. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  5. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  6. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  7. Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
  8. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  9. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  10. Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
  11. McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
  12. McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).

Tags

Biokemi udgave 174 cellulær fraktionering nuklear mitokondrier membran cytoplasma organeller ultracentrifugering densitetsgradient U937

Erratum

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 05/31/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 07/22/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Cellefraktionering af U937-celler ved isopycnic densitetsgradientrensning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCaig, W. D., Deragon, M. A.,… More

McCaig, W. D., Deragon, M. A., Truong, P. V., Knapp, A. R., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. J. Vis. Exp. (174), e62119, doi:10.3791/62119 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter