Adaptaciones específicas de miosina de ensayos de motilidad basados en microscopía de fluorescencia in vitro

Summary

Aquí se presenta un procedimiento para expresar y purificar la miosina 5a seguido de una discusión de su caracterización, utilizando ensayos basados en microscopía de fluorescencia in vitro de conjunto y molécula única, y cómo estos métodos pueden modificarse para la caracterización de la miosina 2b no muscular.

Abstract

Las proteínas de miosina se unen e interactúan con la actina filamentosa (F-actina) y se encuentran en los organismos a través del árbol filogenético. Su estructura y propiedades enzimáticas se adaptan a la función particular que ejecutan en las células. La miosina 5a camina procesivamente sobre la F-actina para transportar melanosomas y vesículas en las células. Por el contrario, la miosina 2b no muscular funciona como un filamento bipolar que contiene aproximadamente 30 moléculas. Mueve la F-actina de polaridad opuesta hacia el centro del filamento, donde las moléculas de miosina trabajan de forma asíncrona para unir la actina, impartir un golpe de potencia y disociarse antes de repetir el ciclo. La miosina 2b no muscular, junto con sus otras isoformas no musculares de miosina 2, tiene funciones que incluyen la adhesión celular, la citocinesis y el mantenimiento de la tensión. La mecanoquímica de las miosinas se puede estudiar mediante la realización de ensayos de motilidad in vitro utilizando proteínas purificadas. En el ensayo de filamento de actina deslizante, las miosinas se unen a una superficie de cubierta de microscopio y translocan F-actina etiquetada fluorescentemente, que se puede rastrear. Sin embargo, en el ensayo de motilidad de molécula / conjunto único, la F-actina se une a un codaño y se observa el movimiento de moléculas de miosina etiquetadas fluorescentemente en la F-actina. En este informe, se describe la purificación de la miosina 5a recombinante de células Sf9 mediante cromatografía de afinidad. Después de esto, describimos dos ensayos basados en microscopía de fluorescencia: el ensayo de filamento de actina deslizante y el ensayo de motilidad invertida. A partir de estos ensayos, se pueden extraer parámetros como las velocidades de translocación de actina y las longitudes y velocidades de ejecución de una sola molécula utilizando el software de análisis de imágenes. Estas técnicas también se pueden aplicar para estudiar el movimiento de filamentos individuales de las isoformas de miosina 2 no muscular, discutidas aquí en el contexto de la miosina 2b no muscular. Este flujo de trabajo representa un protocolo y un conjunto de herramientas cuantitativas que se pueden utilizar para estudiar la dinámica de molécula única y conjunto de miosinas no musculares.

Introduction

Las miosinas son proteínas motoras que ejercen fuerza sobre los filamentos de actina utilizando la energía derivada de la hidrólisis de trifosfato de adenosina (ATP)¹. Las miosinas contienen un dominio de cabeza, cuello y cola. El dominio de la cabeza contiene la región de unión a la actina, así como el sitio de unión al ATP y la hidrólisis. Los dominios del cuello están compuestos de motivos de CI, que se unen a cadenas ligeras, calmodulina o proteínas similares a la calmodulina^2,3. La región de la cola tiene varias funciones específicas para cada clase de miosinas, que incluyen, entre....

Protocol

1. Purificación de proteínas

1. Lisis celular y extracción de proteínas
   1. Prepare un búfer de extracción 1.5x basado en la Tabla 1. Filtrar y conservar a 4 °C.
   2. Comience a descongelar los gránulos celulares en hielo. Mientras los gránulos se descongelan, complemente 100 ml de tampón de extracción con 1,2 mM de ditiotereitol (TDT), 5 μg/ml de leupeptina, 0,5 μM de fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) y dos comprimidos inhibidores de la proteasa. Manténgase en hielo.
   3. Una vez que el pellet se haya descongelado, agregue 1 ml del tampón de extracción suplementado por 10 ml de cultivo celular. Por ejemplo, si los gránulos cel....

Results

La purificación de la miosina se puede evaluar mediante la realización de una electroforesis en gel reductora de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) como se muestra en la Figura 2. Si bien esta cifra representa la miosina final post-dializada, SDS-PAGE se puede realizar en alícuotas de las diversas etapas del procedimiento de purificación para identificar cualquier producto perdido por el sobrenadante. Myosin 5a HMM tiene una banda en el rango de 120-130 kDa y la miosina no mu.......

Discussion

Aquí se presenta un flujo de trabajo para la purificación y caracterización in vitro de la miosina 5a y la miosina no muscular 2b. Este conjunto de experimentos es útil para cuantificar las propiedades mecanoquímicas de las construcciones de miosina purificada de una manera rápida y reproducible. Aunque las dos miosinas que se muestran aquí son solo dos ejemplos específicos de las muchas posibilidades, las condiciones y técnicas se pueden aplicar, con cierta sastrería, a la mayoría de las miosinas y a muchas otras proteí.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Jeringa	BD	309628
2 M CaCl2 Solution	VWR	10128-558
2 M MgCl2 Solución	VWR	10128-298
27 Aguja	Becton Dickinson	309623
5 M NaCl Solution	KD Medical	RGE-3270
<Ácido acético fuerte>	ThermoFisher Scientific	984303
Acetato de amilo	Ladd Research Industries	10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel	Millipore Sigma	A2220
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdfATP	Millipore Sigma	A7699
Biotinilado G-Actina	Citoesqueleto, Inc.	AB07
Albúmina sérica bovina	Millipore Sigma	5470
bPEG-silano	Laysan Bio, Inc	Biotina-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reactivo Concentrado	Bio-Rad	5000006
Calmodulina		PMID: 2985564
catalasa< fuerte/>	Millipore Sigma	C4
(Sf9) en SF-900 II SFM	ThermoFisher Scientific 11496015		http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Paper - Gliding Assay	Millipore Sigma	WHA1001125
Circular Filter Paper - Ensayo invertido	Millipore Sigma	WHA1001090
cOmplete, Tabletas Inhibidoras de la Proteasa sin EDTA	Millipore Sigma	5056489001	Esto debe almacenarse a 4 & C. Los comprimidos se pueden utilizar directamente o se pueden reconstituir como una solución madre 25x disolviendo 1 comprimido en 2 mL de agua destilada. La solución resultante se puede almacenar a 4 & grados; C durante 1-2 semanas o al menos 12 semanas a -20 °C.
(100.000 MWCO)	EMD Millipore Corporation	UFC910024	El MWCO del tubo no es necesariamente "talla única", siempre y cuando el MWCO sea menor que el peso molecular total de la proteína que se está purificando. El NM2b se concentró con un tubo de 100.000 MWCO y el M5a se concentró con un tubo de 30.000 MWCO.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye	ThermoFisher Scientific	20278
Coverslip Rack	Millipore Sigma	Z688568-1EA
strong>Coverslips: Ensayo de filamento de acción deslizante	VWR International	48366-227
Coverslips: Ensayo de motilidad invertida	Azer Scientific	ES0107052
Tubo de diálisis (3500 Dalton MCWO)	Fischer Scientific	08-670-5A	El diámetro del tubo de diálisis puede variar, pero el MWCO debe ser el mismo. El NM2b utilizado en este trabajo se dializó en un tubo de diálisis de 18 mm. Los tubos se pueden almacenar en una solución de alcohol al 20% a 4 & C.
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	D0632
Double-Sided Tape	Office Depot	909955
DYKDDDDK Peptide	GenScript	RP10586	Se puede disolver en un tampón que contiene 0,1 M de NaCl, 0,1 mM de EGTA, 3 mM de NaN3 y 10 mM de MOPS (pH 7,2) hasta una concentración final de 50 mg/mL. Esto se puede almacenar a -20 ° C como 300 y micro; L alícuotas.
EGTA	Millipore Sigma	E4378
Elution Column	Bio-Rad	761-1550	Estos se pueden reutilizar. Para limpiar, enjuague la columna con 2-3 volúmenes de columna de PBS y agua destilada. Enfríe la columna a 4 grados; C antes de usar.
	Fischer Scientific	A4094
G-actina		PMID: 4254541	stock de G-actina se puede almacenar a 200 μ M en líquido N2.
Glucosa	Millipore Sigma	G8270
Glucosa oxidasa	Millipore Sigma	G2133
Solución tampón de glicina, 100 mM, pH 2-2,5, 1 L	Santa Cruz Biotechnology	sc-295018
HaloTag	Promega	G100A
HCl	Millipore Sigma	320331
KCl	Fischer Scientific	P217-500
Puntas de pipeta de orificio grande	Fischer Scientific	02-707-134
Inhibidor de la proteasa de leupeptina	ThermoFisher Scientific	78435
Mark12 Escalera estándar sin teñir	ThermoFisher Scientific	LC5677
Metanol	Millipore Sigma	MX0482
Metilcelulosa	Millipore Sigma	M0512
Microscope Slides	Fischer Scientific	12-553-10
MOPS	Fischer Scientific	BP308-100
mPEG-silane	Laysan Bio, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase		PMID: 23148220	MLCK marcado con FLAG se puede purificar de la misma manera que se purificó la miosina marcada con FLAG en este documento.
NaN3	Millipore Sigma	S8032
NeutrAvidin	ThermoFisher Scientific	31050
Nitrocelulosa	Ladd Research Industries	10800
NuPAGE 4 a 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15 pocillos	ThermoFisher Scientific	NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	ThermoFisher Scientific	NP0007
fuerte, pH 7,4	ThermoFisher Scientific	10010023
PMSF	Millipore Sigma	78830	El PMSF se puede hacer como una solución madre de 0,1 M en isopropanol y almacenarse en 4 °C. La adición de isopropanol da como resultado la precipitación de cristales, que se pueden disolver agitando a temperatura ambiente. Inmediatamente antes de su uso, PMSF se puede añadir gota a gota a una solución de agitación rápida hasta una concentración final de 0,1 mM.
cuchillas de afeitar	Office Depot	397492
Rhodamina-Faloidina	ThermoFisher Scientific	R415	Stock se puede diluir en metanol al 100% hasta una concentración final de 200 μM.
Sf9 Media	ThermoFisher Scientific	12658-027	Esto debe almacenarse a 4&°C. Su vida útil es de 18 meses a partir de la fecha de fabricación.
cultivo de tejidos fuerte - Ensayo deslizante	Corning		fuerte Cada placa cultivo de tejidos puede contener aproximadamente nueve cubreobjetos.
cultivo de tejidos fuerte - Ensayo invertido	Corning		fuerte Cada placa cultivo de tejidos puede contener aproximadamente cuatro cubreobjetos.
Lados lisos 200 y micro; L Puntas de pipeta	Thomas Scientific	1158U38
EQUIPMENT
Centrífuga	ThermoFisher Scientific	75006590
Microscopio	Nikon	Modelo: Eclipse Ti con sistema H-TIRF con objetivo TIRF 100x (N.A. 1.49)
microscopio fuerte	Andor	: cámara EMCCD iXon DU888 (formato de sensor de 1024 x 1024)
microscopio fuerte<	>Tokai HIT	Unidad
< > fuerte< / unidad de		cuatro láseres > estado sólido para 405 nm, 488 nm, 561 nm y 640 nm
Mid Bench Centrifugage	ThermoFisher Scientific	Model: CR3i
Misonix Sonicator	Misonix	XL2020
Optima Max-Xp Ultracentrífuga de sobremesa	Beckman Coulter	393315
Plasma-Cleaner	Diener electronic GmbH + Co. KG	System Tipo: Zepto
Sonda de sonicador (3,2 mm)	Qsonica	4418
Standard Incubator	Binder	Modelo: 56
Waverly Tube Mixer	Waverly	TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01)	http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements	FAST está disponible para sistemas basados en Mac OSX y Linux.
Image Stabilizer Plugin	https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate	https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software	NIS Elements (paquete AR)
	http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
	https://github.com/turalaksel/FASTrack
	https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md