Adaptaciones específicas de miosina de ensayos de motilidad basados en microscopía de fluorescencia in vitro

Ananya Tripathi; Charles Bond; James R. Sellers; Neil Billington; Yasuharu Takagi

doi:10.3791/62180

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Artículo de método

Adaptaciones específicas de miosina de ensayos de motilidad basados en microscopía de fluorescencia in vitro

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DOI:

10.3791/62180

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4 de febrero de 2021

Ananya Tripathi¹ , Charles Bond¹^,² , James R. Sellers¹ , Neil Billington¹ , Yasuharu Takagi¹

¹Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, ²Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un procedimiento para expresar y purificar la miosina 5a seguido de una discusión de su caracterización, utilizando ensayos basados en microscopía de fluorescencia in vitro de conjunto y molécula única, y cómo estos métodos pueden modificarse para la caracterización de la miosina 2b no muscular.

Resumen

Las proteínas de miosina se unen e interactúan con la actina filamentosa (F-actina) y se encuentran en los organismos a través del árbol filogenético. Su estructura y propiedades enzimáticas se adaptan a la función particular que ejecutan en las células. La miosina 5a camina procesivamente sobre la F-actina para transportar melanosomas y vesículas en las células. Por el contrario, la miosina 2b no muscular funciona como un filamento bipolar que contiene aproximadamente 30 moléculas. Mueve la F-actina de polaridad opuesta hacia el centro del filamento, donde las moléculas de miosina trabajan de forma asíncrona para unir la actina, impartir un golpe de potencia y disociarse antes de repetir el ciclo. La miosina 2b no muscular, junto con sus otras isoformas no musculares de miosina 2, tiene funciones que incluyen la adhesión celular, la citocinesis y el mantenimiento de la tensión. La mecanoquímica de las miosinas se puede estudiar mediante la realización de ensayos de motilidad in vitro utilizando proteínas purificadas. En el ensayo de filamento de actina deslizante, las miosinas se unen a una superficie de cubierta de microscopio y translocan F-actina etiquetada fluorescentemente, que se puede rastrear. Sin embargo, en el ensayo de motilidad de molécula / conjunto único, la F-actina se une a un codaño y se observa el movimiento de moléculas de miosina etiquetadas fluorescentemente en la F-actina. En este informe, se describe la purificación de la miosina 5a recombinante de células Sf9 mediante cromatografía de afinidad. Después de esto, describimos dos ensayos basados en microscopía de fluorescencia: el ensayo de filamento de actina deslizante y el ensayo de motilidad invertida. A partir de estos ensayos, se pueden extraer parámetros como las velocidades de translocación de actina y las longitudes y velocidades de ejecución de una sola molécula utilizando el software de análisis de imágenes. Estas técnicas también se pueden aplicar para estudiar el movimiento de filamentos individuales de las isoformas de miosina 2 no muscular, discutidas aquí en el contexto de la miosina 2b no muscular. Este flujo de trabajo representa un protocolo y un conjunto de herramientas cuantitativas que se pueden utilizar para estudiar la dinámica de molécula única y conjunto de miosinas no musculares.

Introducción

Las miosinas son proteínas motoras que ejercen fuerza sobre los filamentos de actina utilizando la energía derivada de la hidrólisis de trifosfato de adenosina (ATP)¹. Las miosinas contienen un dominio de cabeza, cuello y cola. El dominio de la cabeza contiene la región de unión a la actina, así como el sitio de unión al ATP y la hidrólisis. Los dominios del cuello están compuestos de motivos de CI, que se unen a cadenas ligeras, calmodulina o proteínas similares a la calmodulina²^,³. La región de la cola tiene varias funciones específicas para cada clase de miosinas, que incluyen, entre....