Method Article

Adaptaciones específicas de miosina de ensayos de motilidad basados en microscopía de fluorescencia in vitro

DOI:

10.3791/62180

⸱

February 4th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presenta un procedimiento para expresar y purificar la miosina 5a seguido de una discusión de su caracterización, utilizando ensayos basados en microscopía de fluorescencia in vitro de conjunto y molécula única, y cómo estos métodos pueden modificarse para la caracterización de la miosina 2b no muscular.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las proteínas de miosina se unen e interactúan con la actina filamentosa (F-actina) y se encuentran en los organismos a través del árbol filogenético. Su estructura y propiedades enzimáticas se adaptan a la función particular que ejecutan en las células. La miosina 5a camina procesivamente sobre la F-actina para transportar melanosomas y vesículas en las células. Por el contrario, la miosina 2b no muscular funciona como un filamento bipolar que contiene aproximadamente 30 moléculas. Mueve la F-actina de polaridad opuesta hacia el centro del filamento, donde las moléculas de miosina trabajan de forma asíncrona para unir la actina, impartir un golpe de potencia y disociarse antes de repetir el ciclo. La miosina 2b no muscular, junto con sus otras isoformas no musculares de miosina 2, tiene funciones que incluyen la adhesión celular, la citocinesis y el mantenimiento de la tensión. La mecanoquímica de las miosinas se puede estudiar mediante la realización de ensayos de motilidad in vitro utilizando proteínas purificadas. En el ensayo de filamento de actina deslizante, las miosinas se unen a una superficie de cubierta de microscopio y translocan F-actina etiquetada fluorescentemente, que se puede rastrear. Sin embargo, en el ensayo de motilidad de molécula / conjunto único, la F-actina se une a un codaño y se observa el movimiento de moléculas de miosina etiquetadas fluorescentemente en la F-actina. En este informe, se describe la purificación de la miosina 5a recombinante de células Sf9 mediante cromatografía de afinidad. Después de esto, describimos dos ensayos basados en microscopía de fluorescencia: el ensayo de filamento de actina deslizante y el ensayo de motilidad invertida. A partir de estos ensayos, se pueden extraer parámetros como las velocidades de translocación de actina y las longitudes y velocidades de ejecución de una sola molécula utilizando el software de análisis de imágenes. Estas técnicas también se pueden aplicar para estudiar el movimiento de filamentos individuales de las isoformas de miosina 2 no muscular, discutidas aquí en el contexto de la miosina 2b no muscular. Este flujo de trabajo representa un protocolo y un conjunto de herramientas cuantitativas que se pueden utilizar para estudiar la dinámica de molécula única y conjunto de miosinas no musculares.

Introduction

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Las miosinas son proteínas motoras que ejercen fuerza sobre los filamentos de actina utilizando la energía derivada de la hidrólisis de trifosfato de adenosina (ATP)1. Las miosinas contienen un dominio de cabeza, cuello y cola. El dominio de la cabeza contiene la región de unión a la actina, así como el sitio de unión al ATP y la hidrólisis. Los dominios del cuello están compuestos de motivos de CI, que se unen a cadenas ligeras, calmodulina o proteínas similares a la calmodulina2,3. La región de la cola tiene varias funciones específicas para cada clase de miosinas, que incluyen, entre otras, la dimerización de dos cadenas pesadas, la unión de moléculas de carga y la regulación de la miosina a través de interacciones autoinhibitorias con los dominios de la cabeza1.

Las propiedades móviles de la miosina varían mucho entre las clases. Algunas de estas propiedades incluyen la relación de trabajo (la fracción del ciclo mecánico de la miosina en la que la miosina se une a la actina) y la procesividad (la capacidad de un motor para hacer múltiples pasos en su pista antes del desprendimiento)4. Las más de 40 clases de miosinas se determinaron en base a análisis de secuencia5,6,7,8. Las miosinas de clase 2 se clasifican como "convencionales" ya que fueron las primeras en ser estudiadas; todas las demás clases de miosinas se clasifican, por lo tanto, como "no convencionales".

La miosina 5a (M5a) es una miosina de clase 5 y es un motor procesivo, lo que significa que puede tomar múltiples pasos a lo largo de la actina antes de disociarse. Tiene una alta relación de trabajo, lo que indica que pasa gran parte de su ciclo mecánico unido a la actina9,10,11,12,13,14. Al igual que otras miosinas, la cadena pesada contiene un dominio motor N-terminal que incluye tanto una unión a la actina como un sitio de hidrólisis de ATP seguido de una región del cuello que sirve como brazo de palanca, con seis motivos de CI que se unen a las cadenas ligeras esenciales (ELC) y la calmodulina (CaM)15. La región de la cola contiene α bobinas enrolladas semilicoidales, que dimerizan la molécula, seguidas de una región de cola globular para unir la carga. Su cinética refleja su implicación en el transporte de melanosomas en los melanocitos y del retículo endoplásmico en las neuronas de Purkinje16,17. M5a se considera el motor de transporte de carga prototípico18.

Las miosinas de clase 2, o las miosinas convencionales, incluyen las miosinas que potencian la contracción del músculo esquelético, cardíaco y liso, además de las isoformas no musculares de miosina 2 (NM2), NM2a, 2b y 2c19. Las isoformas NM2 se encuentran en el citoplasma de todas las células y tienen funciones compartidas en citocinesis, adhesión, morfogénesis tisular y migración celular19,20,21,22. Este artículo discute los protocolos convencionales de miosina en el contexto de la miosina no muscular 2b (NM2b)23. NM2b, en comparación con M5a, tiene una relación de servicio baja y es enzimáticamente más lento con unV máximo de 0.2 s-123 en comparación con el Vmax de M5a de ≈18 s-124. En particular, las construcciones NM2b truncadas con dos cabezales no se mueven fácilmente procesivamente sobre la actina; más bien, cada encuentro con la actina resulta en un golpe de potencia seguido de la disociación de la molécula25.

NM2b contiene dos cadenas pesadas de miosina, cada una con un dominio de cabeza globular, un brazo de palanca (con un ELC y una cadena ligera reguladora (RLC)), y un dominio de varilla / cola de bobina enrollada α-helicoidal, de aproximadamente 1.100 aminoácidos de largo, que dimeriza estas dos cadenas pesadas. La actividad enzimática y el estado estructural de NM2b están regulados por la fosforilación del RLC23. NM2b no fosfoesforilado, en presencia de ATP y fuerzas iónicas fisiológicas (aproximadamente 150 mM de sal), adopta una conformación compacta en la que las dos cabezas hacen participar en una interacción asimétrica y la cola se pliega hacia atrás sobre las cabezas en dos lugares23. En este estado, la miosina no interactúa fuertemente con la actina y tiene una actividad enzimática muy baja. Tras la fosforilación de RLC por la miosina quinasa de cadena ligera dependiente de calmodulina (MLCK) o la proteína quinasa asociada a Rho, la molécula se extiende y se asocia con otras miosinas a través de la región de la cola para formar filamentos bipolares de aproximadamente 30 moléculas de miosina23. La fosforilación antes mencionada del RLC también conduce a un aumento de la actividad atPasa activada por actina de NM2b en aproximadamente cuatro veces26,27,28. Esta disposición de filamento bipolar, con muchos motores de miosina en cada extremo, está optimizada para funciones en la contracción y el mantenimiento de la tensión, donde los filamentos de actina con polaridades opuestas se pueden mover entre sí23,29. En consecuencia, se ha demostrado que NM2b actúa como un conjunto de motores cuando interactúa con la actina. El gran número de motores dentro de este filamento permite que los filamentos NM2b se muevan procesivamente sobre filamentos de actina, haciendo posible caracterizar la procesividad del filamento in vitro29.

Si bien se ha avanzado en la comprensión del papel de las miosinas en la célula, existe la necesidad de comprender sus características individuales a nivel de proteínas. Para comprender las interacciones actomiosinas a un nivel simple de interacción proteína-proteína, en lugar de dentro de una célula, podemos expresar y purificar miosinas recombinantes para su uso en estudios in vitro. Los resultados de tales estudios informan a los mecanobiólogos sobre las propiedades biofísicas de las miosinas específicas que en última instancia impulsan procesos celulares complejos12,13,14,25,29. Por lo general, esto se logra agregando una etiqueta de afinidad a una construcción de miosina truncada o de longitud completa y purificando a través de cromatografía de afinidad29,30,31. Además, la construcción puede ser diseñada para incluir un fluoróforo genéticamente encodable o una etiqueta para el etiquetado de proteínas con un fluoróforo sintético. Al agregar una etiqueta fluorescente de este tipo, se pueden realizar estudios de imágenes de moléculas individuales para observar la mecánica y la cinética de la miosina.

Después de la purificación, la miosina se puede caracterizar de varias maneras. La actividad de la ATPasa se puede medir mediante métodos colorimétricos, lo que proporciona información sobre el consumo total de energía y la afinidad de actina del motor en diferentes condiciones32. Para aprender sobre la mecanoquímica de su motilidad, se requieren más experimentos. Este documento detalla dos métodos basados en microscopía de fluorescencia in vitro que se pueden utilizar para caracterizar las propiedades móviles de una proteína de miosina purificada.

El primero de estos métodos es el ensayo de filamento de actina deslizante, que se puede utilizar para estudiar cuantitativamente las propiedades del conjunto de motores de miosina, así como para estudiar cualitativamente la calidad de un lote de proteína purificada33. Aunque este artículo discute el uso de la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para este ensayo, estos experimentos se pueden realizar de manera efectiva utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con una cámara digital, que se encuentra comúnmente en muchos laboratorios34. En este ensayo, una capa saturada de motores de miosina se une a una cubierta. Esto se puede lograr utilizando nitrocelulosa, anticuerpos, membranas, superficies derivadas de SiO2(como trimetilorolosilano), entre otros29,33,35,36,37,38. Los filamentos de actina etiquetados fluorescentemente se pasan a través de la cámara de la cubierta, sobre la cual la actina se une a la miosina unida a la superficie. Tras la adición de ATP (y quinasas en el estudio de NM2), la cámara se toma una imagen para observar la translocación de filamentos de actina por las miosinas unidas a la superficie. El software de seguimiento se puede utilizar para correlacionar la velocidad y la longitud de cada filamento de actina deslizante. El software de análisis también puede proporcionar una medida del número de filamentos de actina móviles y estacionarios, lo que puede ser útil para determinar la calidad de una preparación de miosina dada. La proporción de filamentos estancados también puede ser modulada intencionalmente por la unión superficial de la actina a otras proteínas y medida para determinar la dependencia de la carga de la miosina39. Debido a que cada filamento de actina puede ser propulsado por un gran número de motores disponibles, este ensayo es muy reproducible, y la velocidad final medida es robusta a perturbaciones como alteraciones en la concentración de miosina inicial o la presencia de factores adicionales en la solución. Esto significa que se puede modificar fácilmente para estudiar la actividad de la miosina en diferentes condiciones, como la fosforilación alterada, la temperatura, la fuerza iónica, la viscosidad de la solución y los efectos de la carga inducida por las ataduras superficiales. Aunque factores como las "cabezas muertas" de miosina de unión fuerte incapaces de hidrólisis de ATP pueden causar filamentos de actina estancados, existen múltiples métodos para mitigar tales problemas y permitir mediciones precisas. Las propiedades cinéticas de la miosina varían mucho entre las clases y, dependiendo de la miosina específica utilizada, la velocidad del deslizamiento del filamento de actina en este ensayo puede variar desde menos de 20 nm / s (miosina9) 40,41y hasta 60,000 nm / s (miosinacharaceana 11)42.

El segundo ensayo invierte la geometría del ensayo de filamento de actina deslizante12. Aquí, los filamentos de actina se unen a la superficie de la cubierta y se visualiza el movimiento de moléculas individuales de M5a o de filamentos bipolares individuales de NM2b. Este ensayo se puede utilizar para cuantificar las longitudes y velocidades de ejecución de moléculas individuales de miosina o filamentos en la actina. Un coverslip está recubierto con un compuesto químico que bloquea la unión no específica y simultáneamente funcionaliza la superficie, como la biotina-polietilenglicol (biotina-PEG). La adición de derivados de avidina modificados luego prepara la superficie y la actina biotinilada pasa a través de la cámara, lo que resulta en una capa de F-actina unida de manera estable al fondo de la cámara. Finalmente, la miosina activada y etiquetada fluorescentemente (típicamente 1-100 nM) fluye a través de la cámara, que luego se toma una imagen para observar el movimiento de la miosina sobre los filamentos de actina estacionarios.

Estas modalidades representan métodos rápidos y reproducibles que se pueden emplear para examinar la dinámica de las miosinas no musculares y musculares. Este informe describe los procedimientos para purificar y caracterizar tanto M5a como NM2b, que representan miosinas no convencionales y convencionales, respectivamente. Esto es seguido por una discusión de algunas de las adaptaciones específicas de la miosina, que se pueden realizar para lograr una captura exitosa del movimiento en los dos tipos del ensayo.

Expresión y biología molecular
El ADNc para la miosina de interés debe clonarse en un vector pFastBac1 modificado que codifica para una etiqueta FLAG-terminal C (DYKDDDDK) si expresa M5a-HMM, o una etiqueta FLAG-terminal N si expresa la molécula de longitud completa de NM2b23,43,44,45,46. Las etiquetas FLAG-terminales C en NM2b producen una afinidad debilitada de la proteína por la columna flag-afinidad. Por el contrario, la proteína marcada con FLAG N-terminal generalmente se une bien a la columna de afinidad FLAG23. La proteína marcada N-terminalmente conserva la actividad enzimática, la actividad mecánica y la regulación dependiente de la fosforilación23.

En este artículo, se utilizó una construcción truncada similar a la meromiosina pesada (HMM) del ratón M5a con un GFP entre la etiqueta FLAG y el extremo C de la cadena pesada de miosina. Tenga en cuenta que, a diferencia de NM2b, M5a-HMM se puede etiquetar y purificar con éxito con etiquetas FLAG de terminal N o C y, en ambos casos, la construcción resultante estará activa. La cadena pesada M5a se truncó en el aminoácido 1090 y contiene un enlazador de tres aminoácidos (GCG) entre el GFP y la región de bobina enrollada del M5a47. No se agregó ningún vinculador adicional entre la GFP y la etiqueta FLAG. M5a-HMM se co-expresó con calmodulina. El constructo NM2b humano de longitud completa se co-expresó con ELC y RLC. El N-termini del RLC se fusionó con un GFP a través de un enlazador de cinco aminoácidos (SGLRS). Directamente adjunto a la etiqueta FLAG había un HaloTag. Entre el HaloTag y el N-terminal de la cadena pesada de miosina había un eslabón hecho de dos aminoácidos (AS).

Ambas preparaciones de miosina se purificaron a partir de un litro de cultivo celular Sf9 infectado con baculovirus a una densidad de aproximadamente 2 x 106 células / ml. Los volúmenes del baculovirus para cada subunidad dependían de la multiplicidad de infección del virus según lo determinado por las instrucciones del fabricante. En el caso de M5a, las células fueron coinfectadas con dos baculovirus diferentes: uno para la calmodulina y otro para la cadena pesada M5a. En el caso del NM2b, las células fueron coinfectadas con tres virus diferentes: uno para ELC, uno para RLC y otro para la cadena pesada NM2b. Para los laboratorios que trabajan con una diversidad de miosinas (u otras proteínas multi complejas), este enfoque es eficiente ya que permite muchas combinaciones de cadenas pesadas y ligeras y las cadenas ligeras de uso común, como la calmodulina, pueden ser co-transfectadas con muchas cadenas pesadas de miosina diferentes. Todo el trabajo celular se completó en un gabinete de bioseguridad con la técnica estéril adecuada para evitar la contaminación.

Para la expresión de M5a y NM2b, las células Sf9 que producen las miosinas recombinantes se recolectaron 2-3 días después de la infección, mediante centrifugación, y se almacenaron a -80 ° C. Los gránulos celulares se obtuvieron centrifugando las células Sf9 coinfectadas a 4 °C durante 30 min a 2.800 x g. El proceso de purificación de proteínas se detalla a continuación.

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Protocol

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1. Purificación de proteínas

  1. Lisis celular y extracción de proteínas
    1. Prepare un búfer de extracción 1.5x basado en la Tabla 1. Filtrar y conservar a 4 °C.
    2. Comience a descongelar los gránulos celulares en hielo. Mientras los gránulos se descongelan, complemente 100 ml de tampón de extracción con 1,2 mM de ditiotereitol (TDT), 5 μg/ml de leupeptina, 0,5 μM de fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) y dos comprimidos inhibidores de la proteasa. Manténgase en hielo.
    3. Una vez que el pellet se haya descongelado, agregue 1 ml del tampón de extracción suplementado por 10 ml de cultivo celular. Por ejemplo, si los gránulos celulares se formaron a partir de 500 ml de cultivo celular, agregue 50 ml de tampón de extracción suplementado al pellet.
    4. Sonicar los gránulos celulares mientras los mantiene en hielo. Para cada pellet, use las siguientes condiciones: 5 s ON, 5 s OFF, duración de 5 min, potencia 4-5.
    5. Recoger todo el lisato homogeneizado en un beaker y añadir ATP (solución de stock de 0,1 M; pH 7,0) de tal manera que la concentración final de ATP sea de 1 mM. Revuelva durante 15 minutos en una cámara frigorífica. El ATP disocia la miosina activa de la actina, lo que permite separarla en el siguiente paso de centrifugación. Por lo tanto, es esencial proceder al siguiente paso de inmediato para minimizar la posibilidad de agotamiento del ATP y volver a unirse a la actina.
    6. Centrifugar los lisados a 48.000 x g durante 1 h a 4 °C. Mientras esto ocurre, comience a lavar 1-5 ml de una suspensión al 50% de resina de afinidad Anti-FLAG (para un pellet formado a partir de 1 L de células) con solución salina tamponada con fosfato (PBS) de 100 ml, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, para 5 ml de resina, lave 10 ml de una suspensión al 50%. En el paso final de lavado, vuelva a gastar la resina con 1-5 ml de PBS con suficiente volumen para crear una suspensión del 50%.
    7. Después de la centrifugación con lisato, combine el sobrenadante con la suspensión de resina lavada y la roca suavemente en la cámara frigorífica durante 1-4 h. Mientras espera, haga los amortiguadores descritos en la Tabla 1 y manténgalos en hielo.
  2. Preparación de purificación por afinidad FLAG
    1. Centrifugar la solución en el paso 1.7 a 500 x g durante 5 min a 4 °C. La resina se empaquetará en la parte inferior del tubo. Sin molestar la resina, retire el sobrenadante.
    2. Resuspend la resina en 50 ml de tampón A como se detalla en la Tabla 1 y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Sin molestar la resina, retire el sobrenadante.
    3. Resuspend la resina en 50 mL de Buffer B como se detalla en la Tabla 1 y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Repita este paso una vez más y vuelva a sususpend la resina en 20 ml de Buffer B. Luego, mezcle bien la resina y el tampón invirtiendo suavemente el tubo a mano aproximadamente 10 veces.
  3. Elución y concentración de proteínas
    1. Haga 30 ml de tampón de elución como se describe en la Tabla 1 y deje que se enfríe sobre hielo.
    2. Configure la columna de elución en una cámara frigorífica. Vierta suavemente la suspensión de resina en la columna. Lave la columna con 1-2 volúmenes de columna de Buffer B a medida que la resina se empaqueta en la parte inferior, asegurándose de que la resina no se seque.
    3. Fluya 1 mL del tampón de elución a través de la resina y recoja el flujo en un tubo de 1,5 ml. Repita de tal manera que se recolecten fracciones de 12, 1 ml.
    4. En este punto, realice una prueba de Bradford cruda en las fracciones para determinar cualitativamente qué fracciones son las más concentradas48. En una fila de una placa de 96 pozos, pipete 60 μL 1x reactivo Bradford. A medida que se recogen las fracciones, mezcle 20 μL de cada fracción por pozo. Una coloración azul más oscura indica las fracciones más concentradas.
    5. En un tubo de 50 ml, recoja la proteína restante canalizando suavemente el tampón de elución restante a través de la columna, para liberar cualquier miosina restante unida a la resina en el flujo de la columna. Este flujo se concentrará en el siguiente paso. Asegúrese de que la resina se regenera para su reutilización y se almacena de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    6. Acondicióne las tres fracciones más concentradas y concentre aún más el flujo a través en el tubo de 50 ml, así como las fracciones restantes de 1 ml utilizando un tubo de concentración de 100,000 MWCO. Cargue la muestra agrupada en el tubo concentrador y la centrífuga a 750 x g durante 15 min a 4 °C y repita hasta que toda la proteína eluida se haya concentrado en un volumen final de aproximadamente 0,5-1 ml.
      NOTA: Este tamaño de poro permite la retención de las moléculas de miosina, que tienen masas varias veces el límite de peso molecular. Las cadenas ligeras permanecen estrechamente unidas a los dominios motores durante este curso de concentración, como se verifica mediante la realización de la electroforesis en gel SDS-PAGE en el producto final.
  4. Diálisis y congelación por flash
    1. Haga 2 L de tampón de diálisis, como se describe en la Tabla 1. Cargue la muestra en una bolsa o cámara de diálisis y dialícelo durante la noche en la cámara frigorífica. Tenga en cuenta que la composición de los tampones de diálisis difiere para NM2b y M5a.
      NOTA: En el caso de NM2b, el propósito de este paso de diálisis es formar filamentos de miosina en el tampón de baja resistencia iónica. La sedimentación de estos filamentos proporciona un paso de purificación adicional y permite la concentración de la muestra. Por lo tanto, habrá un precipitado blanco visible en la cámara de diálisis al día siguiente. Estos filamentos se recogerán por centrifugación y se despolimerizarán en el paso 5.1. En el caso de M5a-HMM, después de la diálisis nocturna, la proteína será lo suficientemente pura para su uso en ensayos posteriores. Se pueden realizar pasos de purificación adicionales, como la filtración en gel o la cromatografía de intercambio iónico, si es necesario. Para la recuperación de M5a después de la diálisis, vaya al paso 5.2.
  5. Recuperación de la miosina después de la diálisis
    1. Para NM2b, descargue cuidadosamente toda la muestra de la bolsa o cámara de diálisis y centrífuga a 4 °C durante 15 min a 49,000 x g para recolectar los filamentos de miosina. Deseche el sobrenadante y agregue incrementalmente el tampón de almacenamiento al pellet como se describe en la Tabla 1 hasta que se haya disuelto. El pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo ayuda a solubilizar el pellet. Normalmente, esto no requiere más de 500 μL por tubo. Después de asegurarse de que el pellet esté completamente disuelto en el tampón de almacenamiento de alta resistencia iónica, se puede realizar un paso de centrifugación adicional (15 min a 49,000 x g)para eliminar los agregados no deseados si es necesario, ya que la miosina ahora no se utilizará y permanecerá en el sobrenadante.
    2. Para M5a-HMM, recoja cuidadosamente toda la muestra de la cámara de diálisis y la centrífuga a 4 °C durante 15 min a 49,000 x g en caso de que haya agregados no deseados. Toma el sobrenadante.
  6. Determinación de la concentración y congelación por flash
    1. Para determinar la concentración del producto, mida la absorbancia utilizando un espectrofotómetro en longitudes de onda de 260, 280, 290 y 320 nm. Calcule la concentración en mg/mL (cmg/mL) con la Ecuación 1, donde A280 representa la absorción a 280 nm y A320 representa la absorción a 320 nm. La concentración resultante en mg/mL se puede convertir en μM de moléculas de miosina con la Ecuación 2,donde M es el peso molecular de toda la proteína (incluidas las cadenas pesadas, las cadenas ligeras, los fluoróforos y todas las etiquetas).
      cmg/mL = (A280 - A320) / ε (1)
      Moléculas μM = 1000cmg/mL/M(2)
      NOTA: Si es necesaria una dilución, entonces debe hacerse en un tampón de alta resistencia iónica. El coeficiente de extinción (ε) se puede determinar importando la secuencia de aminoácidos de la proteína en un programa como ExPASy. El rendimiento típico para el M5a-HMM es de aproximadamente 0.5-1 mL de proteína 1-5 mg /mL y para el NM2b de longitud completa es de 0.5-1 mL de 0.5-2 mg/mL. El coeficiente de extinción para el M5a-HMM utilizado en este trabajo fue de 0,671. El coeficiente de extinción para el NM2b utilizado en este trabajo fue de 0,611.
    2. Almacene la miosina purificada de una de las dos maneras. Alícuota entre 10-20 μL en un tubo de pared delgada, como un tubo de reacción en cadena de polimerización, y deje caer el tubo en un recipiente de nitrógeno líquido para congelarlo por flash. Alternativamente, pipetee directamente entre 20-25 μL de miosina en nitrógeno líquido y almacene las perlas congeladas de proteína en tubos criogénicos estériles. En cualquier caso, los tubos resultantes se pueden almacenar en -80 °C o nitrógeno líquido para su uso futuro.
      NOTA: Dado que ambos ensayos de motilidad descritos a continuación requieren cantidades muy pequeñas de proteína, el almacenamiento en pequeñas alícuotas, como se describe, es económico.

2. Ensayo de filamento de actina deslizante

  1. Preparación de la cubierta
    1. Haga una solución de nitrocelulosa al 1% en acetato de amilo.
    2. Obtenga una placa de cultivo de tejidos (150 x 25 mm) y agregue un papel de filtro circular (125 mm de diámetro) al fondo del plato.
    3. Cargue ocho fundas cuadradas No. 1.5 de espesor 22 mm en una rejilla y lávese con aproximadamente 2-5 ml de etanol a prueba de 200 seguido de 2-5 ml de agua destilada (dH2O). Repita este paso de lavado, terminando con agua. Luego, seque los cubrecos completamente usando una línea de aire filtrada o una líneaN 2.
    4. Tome una funda y pipetee lentamente 10 μL de la solución de nitrocelulosa al 1% a lo largo de un borde del deslizamiento. Luego, en un movimiento suave, unte el resto de la cubierta usando el lado de una punta de pipeta de 200 μL de lado liso. Coloque este cubrecubres en la placa de cultivo de tejidos con el lado de nitrocelulosa hacia arriba. Repita para los cubrecos restantes y deje que se sequen mientras prepara los reactivos restantes y use los cubrehojes dentro de las 24 horas posteriores al recubrimiento.
  2. Preparación de la cámara
    1. Limpie un portaobjetos de microscopio con un papel de lente óptica para limpiar los escombros grandes. Cortar dos trozos de cinta de doble cara, de aproximadamente 2 cm de longitud.
    2. Coloque una pieza a lo largo del centro del borde largo del portaobjetos del microscopio. Asegúrese de que el borde de la cinta se alinea con el borde de la diapositiva. Coloque la segunda pieza de cinta aproximadamente 2 mm por debajo de la primera pieza de cinta de modo que las dos estén paralelas y alineadas. Esto crea una cámara de flujo que puede contener aproximadamente 10 μL de solución (ver Figura 1).
    3. Tome uno de los cobiertos recubiertos de nitrocelulosa de la Parte 1. Pegue cuidadosamente la cubierta en la cinta de modo que el lado recubierto con nitrocelulosa esté haciendo contacto directo con la cinta (ver Figura 1). Con una punta de pipeta, presione suavemente hacia abajo en la interfaz de cinta deslizante para asegurarse de que la cubierta se haya adherido correctamente a la diapositiva. Corte el exceso de cinta que cuelga sobre el borde de la corredera con una cuchilla de afeitar.
  3. Preparación de actina
    1. Hacer 20 μM de F-actina polimerizando actina globular (G-actina) en tampón de polimerización (50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM TDT, 25 mM MOPS (pH 7.0)) a 4 °C durante la noche.
    2. Diluir F-actina a 5 μM en tampón motilidad (20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 1 mM TDT (pH 7,4)). Etiqueta con al menos 1,2 veces de exceso molar de rodamina-faloidina. Dejar (cubierto de papel de aluminio) durante al menos 2 h sobre hielo. Esto se puede usar hasta por 1-2 meses, almacenado en hielo.
  4. Realización del ensayo de filamento de actina deslizante myosin 5a
    NOTA: En esta sección, se proporcionan los detalles del ensayo de deslizamiento de miosina 5a (HMM).
    1. Prepare las soluciones para la miosina 5a descritas en la Tabla 2 y manténgalas en hielo.
    2. Flujo en 10 μL de la miosina 5a (50-100 nM) a través de la cámara de flujo y esperar 1 min.
    3. Flujo en 10 μL de la BSA de 1 mg/mL en 50 mM MB con 1 mM de TDT (tampón "bajo en sal"). Repita este lavado dos veces más y espere 1 minuto después del tercer lavado. Use la esquina de un papel de seda o papel de filtro para absorber la solución a través del canal colocando suavemente la esquina del papel en la salida de la cámara de flujo.
    4. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    5. Flujo en 10 μL de la solución de actina negra (5 μM F-actina, 1 μM calmodulina y 1 mM ATP en 50 mM MB con 1 mM TDT) para eliminar "cabezas muertas", como se discutió en la sección Discusión.
      1. Pipetear la solución con una jeringa de 1 ml y una aguja de 27 G para esquilar los filamentos de actina antes de introducir la solución en la cámara. Repita este paso dos veces más y espere 1 minuto después de la tercera vez. Aproximadamente 20 eventos de pipeteo son suficientes.
      2. Para realizar el giro de "cabeza muerta", agregue una cantidad estequiométrica de F-actina a la miosina en presencia de 1 mM de ATP y 1 mM de MgCl2 a una concentración de sal de 500 mM. A continuación, ultracentrífuga a 480.000 x g durante 15 min a 4 °C. La miosina muerta estará en el perdigón.
    6. Flujo en 50 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT y 1 mM ATP para agotar la cámara de filamentos de actina libre.
    7. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más para agotar la cámara de cualquier ATP.
    8. Flujo en 10 μL de 20 nM de solución de rodina de rodamina (Rh-Actina) que contiene 1 mM de TDT en 50 mM MB y espere 1 min para permitir la unión rigor de los filamentos de actina a la miosina 5a unida a la superficie de la cubierta.
    9. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM de TDT para eliminar los filamentos de Rh-Actina no unidos a la superficie. Repita este lavado dos veces más.
    10. Flujo en 30 μL de buffer final.
    11. Grabe imágenes en un microscopio de fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación de 561 nm para visualizar la Rh-Actina. Un tiempo de exposición apropiado es de 200 ms a una potencia láser de 1,4 mW para una duración total de adquisición de 0,5-1 min.
      NOTA: Asegúrese de que la tasa de adquisición se escale adecuadamente a la velocidad de los filamentos en movimiento. Una consideración importante antes de recopilar datos para su uso con programas de seguimiento es la velocidad de fotogramas de adquisición. Los movimientos de subpíxeles entre fotogramas darán como resultado una sobreestimación de la velocidad, y se requieren movimientos de varios cientos de nanómetros para obtener valores precisos. Una tasa de adquisición óptima presenta deslizamiento de actina durante al menos una distancia de píxeles entre fotogramas. En el caso del microscopio TIRF utilizado para la obtención de imágenes aquí, este umbral se traduce en 130 nm; por lo tanto, una miosina que se espera que viaje 1 μm/s debe ser fotografiada a una velocidad de 5 fotogramas/s (intervalo de 0,2 s) para lograr 200 nm de movimiento, mientras que una miosina que se espera que viaje a 10 nm/s requiere 0,05 fotogramas/s (intervalos de 20 s). Por lo tanto, los datos se pueden reducir en esta etapa si es necesario (consulte Discusión para obtener más detalles).
  5. Realización del ensayo de filamento de actina deslizante de miosina 2b no muscular
    NOTA: En esta sección, se proporcionan los detalles del ensayo de deslizamiento de miosina no muscular 2b de longitud completa. El protocolo de ensayo de filamento de actina deslizante de miosina 2b no muscular es diferente del protocolo de miosina 5a en ciertos pasos. Asegúrese de que se utilizan los búferes correctos para cada uno de estos pasos. Por ejemplo, el ensayo NM2b requiere la unión de miosina al coverslip en el tampón de sal alta, mientras que el M5a se puede unir al coverslip en tampones de sal alta o baja. Además, el ensayo de filamento de actina deslizante M5a utiliza una concentración más baja de miosina para mitigar la frecuencia de los filamentos de actina que se rompen durante la adquisición.
    1. Prepare las soluciones para NM2b como se describe en la Tabla 2 y manténgalas en hielo.
    2. Flujo en 10 μL de la miosina no muscular 2b (0,2 μM) en 500 mM Motility Buffer (MB) (tampón "alto en sal") y 1 mM de ditiotreitol (TDT) a través de la cámara de flujo y esperar 1 min.
      NOTA: Los tampones de alta sal disocian los filamentos de miosina y permiten la unión de moléculas individuales de miosina a la superficie, ya que la miosina 2b no muscular puede polimerizarse en filamentos a concentración iónica <150 mM.
    3. Flujo en 10 μL de la albúmina sérica bovina (BSA) de 1 mg/ml en 500 mM MB con 1 mM de TDT (tampón "alto en sal") como se describe en la Tabla 2. Repita este lavado dos veces más y espere 1 minuto después del tercer lavado. Use la esquina de un papel de seda o papel de filtro para absorber la solución a través del canal.
    4. Lavar con 10 μL de 500 mM MB con 1 mM TDT como se describe en la Tabla 2. Repita este lavado dos veces más.
    5. Flujo en 10 μL de la solución de actina negra como se describe en la Tabla 2 para eliminar "cabezas muertas", como se discute más adelante en la sección Discusión. La solución de actina negra contiene 5 μM de F-actina sin etiquetar, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mM CaCl2,1 μM CaM y 1 mM TDT en un tampón de motilidad de NaCl de 50 mM para fosforilar la miosina 2b no muscular en la superficie de la cámara.
      1. Pipetear la solución con una jeringa de 1 ml y una aguja de 27 G para esquilar los filamentos de actina antes de introducir la solución en la cámara. Repita este paso dos veces más y espere 1 minuto después de la tercera vez. Aproximadamente, 20 eventos de pipeteo son suficientes.
    6. Flujo en 50 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT y 1 mM ATP para agotar la cámara de filamentos de actina libre.
    7. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más para agotar la cámara de cualquier ATP.
    8. Flujo en 10 μL de solución de Rh-Actina de 20 nM que contiene 1 mM de TDT en 50 mM MB y espere 1 min para permitir la unión rigor de los filamentos de actina a la miosina 2b no muscular unida a la superficie de la cubierta.
    9. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM de TDT para eliminar los filamentos de Rh-Actina no unidos a la superficie. Repita este lavado dos veces más.
    10. Flujo en 30 μL de buffer final. Para el ensayo de filamento de actina deslizante de miosina 2b no muscular, el tampón final también incluye calmodulina, CaCl2y miosina quinasa de cadena ligera para proporcionar una fosforilación completa de la miosina 2b no muscular durante las imágenes de video. La metilcelulosa al 0,7% también se puede incluir en el tampón final si los filamentos de actina solo están unidos libremente o no están unidos a la superficie. Esto se discute más a fondo en la sección Discusión.
    11. Grabe imágenes en un microscopio de fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación de 561 nm. Un tiempo de exposición apropiado es de 200 ms a 1,4 mW de potencia láser para una duración total de adquisición de 0,5 a3 min.
      NOTA: Asegúrese de que la tasa de adquisición se escale adecuadamente a la velocidad de los filamentos en movimiento. Una consideración importante antes de recopilar datos para su uso con programas de seguimiento es la velocidad de fotogramas de adquisición. Los movimientos de subpíxeles entre fotogramas darán como resultado una sobreestimación de la velocidad, y se requieren movimientos de varios cientos de nanómetros para obtener valores precisos. Una tasa de adquisición óptima presenta deslizamiento de actina durante al menos una distancia de píxeles entre fotogramas. En el caso del microscopio TIRF utilizado para la obtención de imágenes aquí, este umbral se traduce en 130 nm; por lo tanto, una miosina que se espera que viaje 1 μm/s debe ser fotografiada a una velocidad de 5 fotogramas/s (intervalo de 0,2 s) para lograr 200 nm de movimiento, mientras que una miosina que se espera que viaje a 10 nm/s requiere 0,05 fotogramas/s (intervalos de 20 s). Por lo tanto, los datos se pueden muestrear en esta etapa, si es necesario (consulte Discusión para obtener más detalles).

3. Ensayo TIRF de molécula única

  1. Preparación de la cubierta
    1. Divida el polvo caldo en 10 mg de alícuotas (en tubos de 1,5 ml) de metoxi-Peg-silano (mPEG) y 10 mg de alícuotas de biotina-Peg-silano (bPEG). Conservar a -20 °C en un recipiente sellado y libre de humedad y utilizarlo en un plazo de 6 meses.
    2. Cargue ocho fundas cuadradas No. 1.5H (alta precisión) de espesor de 22 mm en una rejilla y lávese con 2-5 ml de etanol a prueba de 200 seguido de 2-5 ml de agua destilada. Repita este paso de lavado, terminando con agua. Luego, seque las cubiertas completamente usando una línea de aire o N2 y limpie con plasma con argón durante 3 minutos.
    3. Coloque las fundas limpias sobre papel de filtro (90 mm) en una placa de cultivo de tejidos (100 x 20 mm) e incube en un horno de 70 °C mientras realiza los siguientes pasos.
      NOTA: La limpieza por plasma puede ser reemplazada por otros métodos de limpieza química49.
    4. Prepare una solución de etanol al 80% con dH2O y ajuste el pH a 2.0 usando HCl. Agregue 1 ml de esto a una alícuota de 10 mg de mPEG y 1 ml a una alícuota de 10 mg de bPEG. Vórtice para disolver, que no debe tomar más de 30 s.
    5. Tomar 100 μL de la solución de bPEG y añadir 900 μL de etanol al 80% (pH 2.0). Esta solución es de 1 mg/ml de bPEG. Luego, haga una solución de ambos PEG de la siguiente manera, mezclando a fondo.
      1. 200 μL de 10 mg/ml mPEG (concentración final: 2 mg/ml).
      2. 10 μL del 1 mg/ml de bPEG (concentración final: 10 μg/ml).
      3. 790 μL de la solución de etanol al 80% (pH 2.0).
    6. Saca las fundas del horno. Dispense cuidadosamente 100 μL de la solución de PEG en el centro de cada cubierta, asegurándose de que solo la superficie superior esté húmeda. Luego, coloque los resbalones de nuevo en el horno e incube durante 20 a 30 minutos.
    7. Cuando los cubrecuestas comiencen a tomar una apariencia agujereada, con pequeños círculos aparentes a través de la superficie, retírelos del horno.
    8. Lave cada funda con etanol al 100%, séquela con una línea de aire y vuelva a colocarla en el horno. Incubar solo durante el tiempo requerido para crear cámaras en el paso 2.
  2. Preparación de la cámara
    1. Limpie un portaobjetos de microscopio para usarlo en la fabricación de la cámara. Cortar dos trozos de cinta de doble cara, de aproximadamente 2 cm de longitud.
    2. Coloque una pieza a lo largo del centro del borde largo del portaobjetos del microscopio. Asegúrese de que el borde de la cinta se alinea con el borde de la diapositiva. Coloque la segunda pieza de cinta aproximadamente 2 mm por debajo de la primera pieza de cinta de modo que las dos estén paralelas y alineadas.
    3. Tome uno de los cosidos funcionalizados del horno (creado en 3.1). Pegue cuidadosamente la cubierta en la cinta de modo que el lado recubierto con PEG esté boca abajo y haga contacto directo con la cinta, como se muestra en la Figura 1. Con una punta de pipeta, presione suavemente hacia abajo en la interfaz de cinta deslizante para asegurarse de que la cubierta se haya adherido correctamente a la diapositiva.
    4. Corte el exceso de cinta que cuelga sobre la diapositiva con una cuchilla de afeitar. Estas cámaras se pueden usar inmediatamente o colocarse por pares en un tubo de 50 ml y almacenarse en un congelador de -80 ° C para su uso futuro. Es importante almacenar inmediatamente o la superficie se degradará.
  3. Realización del ensayo de microscopía TIRF de miosina 5a
    1. Prepare las soluciones para el ensayo de motilidad invertida de miosina 5a descritas en la Tabla 3 y manténgalas en hielo.
    2. Lavar la cámara con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM de TDT.
    3. Flujo en 10 μL de la BSA de 1 mg/mL en 50 mM MB con TDT de 1 mM. Repita este lavado dos veces más y espere 1 minuto después del tercer lavado. Use la esquina de un papel de seda o papel de filtro para absorber la solución a través del canal.
    4. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    5. Flujo en 10 μL de la solución NeutrAvidin en 50 mM MB con 1 mM TDT y esperar 1 min.
    6. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    7. Flujo en 10 μL de actina rodamina biotinilada (bRh-Actina) que contiene 1 mM TDT en 50 mM MB y esperar 1 min. Para este paso, use una punta de pipeta de gran perforación y evite pipetear hacia arriba y hacia abajo para minimizar el cizallamiento de los filamentos de actina fluorescentes para garantizar que los filamentos de actina largos se puedan unir a la superficie (20-30 μm o más). Una alternativa efectiva es cortar el cono de una punta de pipeta estándar (con una abertura de ≈1-1.5 mm).
    8. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    9. Flujo en 30 μL de Tampón Final con 10 nM de miosina 5a agregada, luego cargar inmediatamente en el microscopio TIRF y registrar después de encontrar el enfoque óptimo para la modalidad de imágenes TIRF. Los tiempos de exposición entre 100-200 ms son apropiados a una potencia láser de 1,4 mW para la actina y la miosina etiquetada con GFP. Un tiempo de adquisición apropiado para el análisis de velocidad es de 3 min.
  4. Realización del ensayo de microscopía TIRF de miosina 2b no muscular
    NOTA: En esta sección, se proporcionan los detalles del ensayo TIRF de miosina 2b no muscular que utiliza filamentos polimerizados y fosforilados. Se incluye un protocolo detallado (secciones 4.1-4.3) para fosforilación y polimerización de la miosina-2b no muscular en un tubo.
    1. Para fosforilar el NM2b purificado, haga una mezcla de quinasa 10x con las siguientes condiciones: 2 mM CaCl2, 1 μM CaM, 1-10 nM MLCK y 0.1 mM ATP. Esto se puede llevar al volumen con 500 mM MB con 10 mM TDT. Agregue la mezcla de quinasa 10x a la miosina en una proporción volumétrica de 1:10 y deje que esto se incube durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. Típicamente, la concentración de miosina para este paso es de 1 μM.
    2. Para polimerizar la miosina fosforilada en filamentos, reduzca la concentración de sal del NM2b a 150 mM NaCl. Para hacerlo, haga un tampón de motilidad 1x (1x MB) sin sal diluyendo el 4x MB cuatro veces en dH2O. Este 1x MB se puede utilizar para reducir la concentración de sal porque el NM2b se congeló en un tampón de sal de 500 mM.
    3. Por cada 3 μL de stock NM2b, agregue 7 μL de 1x MB para reducir la concentración de sal a 150 mM NaCl e incube en hielo durante 20-30 min para formar filamentos NM2b.
      NOTA: El orden en las secciones 4.1-4.3 no es crucial siempre que el NM2b esté fosforilado y la concentración final de sal sea de 150 mM. La incubación del orden de 30 min-1 h permite un tiempo suficiente para la fosforilación completa y la polimerización.
    4. Preparar las soluciones para el ensayo de motilidad invertida de miosina 2b no muscular descritas en la Tabla 3 y mantenerlas en hielo.
    5. Lavar la cámara con 10 μL de 150 mM MB con 1 mM TDT.
    6. Flujo en 10 μL de la BSA de 1 mg/mL en 150 mM MB con TDT de 1 mM Repita este lavado dos veces más y espere 1 min después del tercer lavado. Use la esquina de un papel de seda o papel de filtro para absorber la solución a través del canal.
    7. Lavar con 10 μL de 150 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    8. Flujo en 10 μL de la solución NeutrAvidin en 150 mM MB con 1 mM TDT y esperar 1 min.
    9. Lavar con 10 μL de 150 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    10. Flujo en 10 μL de bRh-Actina y esperar 1 min. Para este paso, use una punta de pipeta de gran perforación y evite pipetear hacia arriba y hacia abajo para minimizar el cizallamiento de los filamentos de actina fluorescentes, para asegurarse de que se puedan unir filamentos de actina largos a la superficie (20-30 μm o más). Una alternativa efectiva es cortar el cono de una punta de pipeta estándar.
    11. Lavar con 10 μL de 150 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    12. Flujo en 10 μL de la solución no muscular de miosina 2b (aproximadamente 30 nM) y esperar 1 min.
    13. Lavar con 10 μL de 150 MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    14. Flujo en 30 μL de búfer final, luego cargue inmediatamente en el microscopio TIRF y registre después de encontrar el enfoque óptimo para la modalidad de imagen TIRF. Los tiempos de exposición entre 100-200 ms son apropiados a una potencia láser de 1,4 mW para la actina y la miosina etiquetada con GFP. Un tiempo de adquisición apropiado para el análisis de velocidad es de 3 min.

4. Análisis de imágenes

  1. Análisis de imágenes para el ensayo de filamento de actina deslizante
    NOTA: Las imágenes se pueden analizar utilizando el software y los manuales vinculados en la Lista de Materiales. Es importante tener en cuenta que el programa descrito aquí requiere pilas TIFF para el análisis. El proceso para analizar el ensayo de filamento de actina deslizante es el siguiente50.
    1. Cargue pilas de películas sin procesar en una estructura de carpetas especificada e ingrese el directorio superior de las carpetas de películas en el programa.
      NOTA: El programa analiza los archivos a través de este directorio y subdirectorios, tratando los directorios de nivel más bajo como réplicas. Se producirán estadísticas promedio para cada grupo de réplicas. En este caso, se utilizó una sola película para cada miosina. Al caracterizar una nueva miosina o investigar una nueva condición experimental, se recomienda analizar películas de tres campos de visión (FOV) por cámara para un total de tres cámaras y repetir este flujo de trabajo para tres preparaciones de la miosina que se está investigando.
    2. Utilice el script "stack2tifs" junto con la velocidad de fotogramas ingresada por el usuario para convertir cada pila TIFF en una carpeta que contenga una serie de archivos TIFF individuales y un archivo de metadatos.txt correspondiente que contenga la hora de inicio de cada fotograma. Para los datos que no están en el formato de pila TIFF, primero se debe aplicar una conversión utilizando software como los enumerados en la Tabla de materiales.
      NOTA: Este script es la parte del paquete de software. La información del script se puede encontrar aquí: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. Utilice el parámetro -px, que es el tamaño de píxel (en nm) durante la adquisición. En este caso, el tamaño de píxel es de 130 nm. Utilice los parámetros -xmax y -ymax para escalar los ejes de las salidas del gráfico de dispersión. Estos corresponden a la longitud de filamento trazado más largo y la velocidad máxima trazada (en nm/s).
      NOTA: Estos son valores estimados y se pueden establecer en valores superiores a los esperados para garantizar que los datos estén contenidos en la gráfica. Después del análisis, los datos sin procesar también se pueden exportar para su uso en otro software estadístico o gráfico para su visualización y análisis.
    4. Utilice el parámetro -minv, que es un parámetro de corte de velocidad mínima, para definir los filamentos que no se mueven y, por lo tanto, pueden excluirse del análisis. Para una miosina lenta como NM2b, este parámetro debe ser bajo (en este ejemplo, 5 nm / s) para evitar cortar los verdaderos movimientos de deslizamiento. Para una miosina rápida como M5a, este parámetro puede ser mayor (en este ejemplo, 100 nm / s) para aplicar un filtro más estricto, al tiempo que conserva la verdadera distribución de velocidad de deslizamiento.
    5. Utilice el parámetro de corte -pt para identificar el movimiento suave. Para cada ventana de muestreo, se calcula un valor equivalente a 100 x Velocidad Desviación estándar/Velocidad media. Las pistas con valores más altos que el punto de corte, tienen velocidades más variables y se excluyen de un análisis posterior. En este ejemplo, se utilizó un valor de corte de 33. Las pistas con valores más altos tienen velocidades más variables y se excluyen de un análisis posterior.
    6. Utilice -maxd para establecer una distancia de enlace máxima permitida entre fotogramas. Esta es una distancia calculada de fotograma a fotograma movida por el centroide del filamento en unidades de nm. Puede ser útil para excluir movimientos esporádicos o enlaces incorrectos entre filamentos. En los ejemplos siguientes, el parámetro se dejó en el valor predeterminado de 2.000 nm.
  2. Análisis de imágenes para el ensayo de microscopía TIRF
    NOTA: El proceso para analizar el ensayo TIRF de molécula única en el software de imágenes específicamente enumerado en el Tabla de Materiales es el siguiente29.
    1. Haga clic y arrastre el video de microscopía grabado al espacio de trabajo del software para abrirlo51. Luego, divida los canales de adquisición. Haga clic en Imagen > Color > Dividir canales.
      NOTA: En caso de deriva de etapa apreciable durante la adquisición, las imágenes deben estabilizarse para corregir la deriva instrumental en el plano de imagen. En este caso, no se utilizó ninguna compensación por la deriva del eje Z, ya que el microscopio utilizado para obtener estos datos estabiliza bien el enfoque Z. Para estabilizar la imagen en el programa de análisis de imágenes, instale el complemento estabilizador adecuado que esté vinculado en la Lista de materiales. El estabilizador de imagen asume posiciones fijas para los objetos de la imagen y utiliza como referencia un promedio móvil de los fotogramas anteriores. Por lo tanto, el procedimiento recomendado es comenzar con el canal que contiene imágenes de actina etiquetada, ya que esta se encuentra en una posición fija.
    2. Haga clic en Plugins, luego busque Estabilizador de imagen; asegúrese de que traducción está seleccionada y mantenga la configuración predeterminada. Marque la casilla situada junto a Coeficientes de transformación de registro. La aplicación de este paso de registro permite que los parámetros de desplazamiento calculados se apliquen al otro canal en el siguiente paso. Permita que se complete el proceso.
    3. Luego, abra el canal con miosina etiquetada y aplique la estabilización haciendo clic en Complementos > Image Stabilizer Log Applier. Si las imágenes de actina no se pueden adquirir durante la misma adquisición debido a un requisito de imágenes de mayor velocidad en un solo canal, la deriva estabiliza la pila de imágenes seleccionando una región que contiene objetos estáticos como un marcador fiduciario biotinilado o fluoróforos unidos no específicamente a la superficie de biotina-PEG. Esta región se puede recortar de la pila original y estabilizar, seguida de la aplicación de los valores de desplazamiento resultantes a la pila original.
      NOTA: En la práctica, la deriva observada en los experimentos de motilidad será insignificante en relación con el movimiento de las miosinas que se mueven a varios cientos de nm / s, pero para las miosinas más lentas esto se convierte en una consideración importante.
    4. Luego, abra TrackMate, haga clic en Plugins; luego, en su menú desplegable haga clic en Seguimiento y finalmente en TrackMate. En este punto, el análisis de imágenes está sujeto a una optimización basada en los parámetros del fluoróforo y las condiciones del ensayo. Sin embargo, los parámetros de partida ideales son los siguientes.
      1. Ajustes de calibración: mantenga todos los valores predeterminados.
      2. Detector: Detector LoG.
      3. Diámetro estimado de la mancha: 0.5-1.0 micras.
      4. Umbral: 25-200. (Esto se puede determinar haciendo clic en Vista previa después de elegir un número para ver si los puntos detectados coinciden con la película y ajustarlos adecuadamente).
      5. Umbral inicial: no establecido.
      6. Vista: HyperStack Displayer.
      7. Establecer filtros en puntos: no establecido.
      8. Rastreador: Rastreador LAP simple.
        NOTA: Estos dependen de la velocidad de fotogramas y la velocidad de miosina y deben ser lo suficientemente grandes como para conectar posiciones posteriores, excluyendo las conexiones no deseadas entre diferentes partículas.
      9. Distancia máxima de enlace: 1,0 micras.
      10. Distancia máxima de cierre de huecos: 1,0 micras.
      11. Brecha máxima del marco de cierre de brecha: 1.
      12. Establecer filtros en las pistas: Desplazamiento de pista (>0.39 para incluir solo los puntos que se mueven más de 3 píxeles), Puntos en las pistas (>3 para incluir solo pistas con al menos 3 puntos). Se pueden introducir otros filtros como velocidad mínima para excluir puntos que se detienen durante largos períodos. Los resultados del filtrado deben verificarse mediante una inspección visual de las pistas para garantizar que las pistas espurias (es decir, el movimiento de la miosina en el fondo que no está a lo largo de una pista de actina) se eliminen mientras se conservan las pistas asociadas con la actina.
    5. Una vez que aparece la pantalla Opciones de visualización, haga clic en Análisis para obtener los resultados relevantes. Guarde las tres tablas producidas (Estadísticas de seguimiento, Enlaces en Estadísticas de seguimiento y Puntos en Estadísticas de seguimiento). La tabla Estadísticas de seguimiento contendrá los datos de velocidad y desplazamiento que luego se pueden analizar para caracterizar una nueva proteína o los efectos de una determinada condición experimental, por ejemplo.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La purificación de la miosina se puede evaluar mediante la realización de una electroforesis en gel reductora de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) como se muestra en la Figura 2. Si bien esta cifra representa la miosina final post-dializada, SDS-PAGE se puede realizar en alícuotas de las diversas etapas del procedimiento de purificación para identificar cualquier producto perdido por el sobrenadante. Myosin 5a HMM tiene una banda en el rango de 120-130 kDa y la miosina no mu...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presenta un flujo de trabajo para la purificación y caracterización in vitro de la miosina 5a y la miosina no muscular 2b. Este conjunto de experimentos es útil para cuantificar las propiedades mecanoquímicas de las construcciones de miosina purificada de una manera rápida y reproducible. Aunque las dos miosinas que se muestran aquí son solo dos ejemplos específicos de las muchas posibilidades, las condiciones y técnicas se pueden aplicar, con cierta sastrería, a la mayoría de las miosinas y a muchas otras proteí...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al Dr. Fang Zhang por la asistencia técnica con la preparación de los reactivos utilizados para recopilar estos datos. Este trabajo fue apoyado por los fondos del Programa de Investigación Intramuros NHLBI / NIH HL001786 a J.R.S.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL JeringaBD309628
2 M CaCl2 SolutionVWR10128-558
2 M MgCl2 SoluciónVWR10128-298
27 AgujaBecton Dickinson309623
5 M NaCl SolutionKD MedicalRGE-3270
<Ácido acético fuerte>ThermoFisher Scientific984303
Acetato de amiloLadd Research Industries10825
Anti-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdfATPMillipore SigmaA7699
Biotinilado G-ActinaCitoesqueleto, Inc.AB07
Albúmina sérica bovinaMillipore Sigma5470
bPEG-silanoLaysan Bio, IncBiotina-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reactivo ConcentradoBio-Rad5000006
CalmodulinaPMID: 2985564
catalasa< fuerte/>Millipore SigmaC4
(Sf9) en SF-900 II SFMThermoFisher Scientific 11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Paper - Gliding AssayMillipore SigmaWHA1001125
Circular Filter Paper - Ensayo invertidoMillipore SigmaWHA1001090
cOmplete, Tabletas Inhibidoras de la Proteasa sin EDTAMillipore Sigma5056489001Esto debe almacenarse a 4 & C. Los comprimidos se pueden utilizar directamente o se pueden reconstituir como una solución madre 25x disolviendo 1 comprimido en 2 mL de agua destilada. La solución resultante se puede almacenar a 4 & grados; C durante 1-2 semanas o al menos 12 semanas a -20 °C. 
(100.000 MWCO)EMD Millipore CorporationUFC910024El MWCO del tubo no es necesariamente "talla única", siempre y cuando el MWCO sea menor que el peso molecular total de la proteína que se está purificando. El NM2b se concentró con un tubo de 100.000 MWCO y el M5a se concentró con un tubo de 30.000 MWCO.
Coomassie Brilliant Blue R-250 DyeThermoFisher Scientific20278
Coverslip RackMillipore SigmaZ688568-1EA
strong>Coverslips: Ensayo de filamento de acción deslizanteVWR International48366-227
Coverslips: Ensayo de motilidad invertida Azer ScientificES0107052
Tubo de diálisis (3500 Dalton MCWO)Fischer Scientific08-670-5AEl diámetro del tubo de diálisis puede variar, pero el MWCO debe ser el mismo. El NM2b utilizado en este trabajo se dializó en un tubo de diálisis de 18 mm. Los tubos se pueden almacenar en una solución de alcohol al 20% a 4 & C.
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD0632
Double-Sided TapeOffice Depot909955
DYKDDDDK PeptideGenScriptRP10586Se puede disolver en un tampón que contiene 0,1 M de NaCl, 0,1 mM de EGTA, 3 mM de NaN3 y 10 mM de MOPS (pH 7,2) hasta una concentración final de 50 mg/mL. Esto se puede almacenar a -20 ° C como 300 y micro; L alícuotas. 
EGTAMillipore SigmaE4378
Elution ColumnBio-Rad761-1550Estos se pueden reutilizar. Para limpiar, enjuague la columna con 2-3 volúmenes de columna de PBS y agua destilada. Enfríe la columna a 4 grados; C antes de usar.
Fischer ScientificA4094
G-actinaPMID: 4254541stock de G-actina se puede almacenar a 200 μ M en líquido N2.
GlucosaMillipore SigmaG8270
Glucosa oxidasaMillipore SigmaG2133
Solución tampón de glicina, 100 mM, pH 2-2,5, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-295018
HaloTagPromegaG100A
HClMillipore Sigma320331
KClFischer ScientificP217-500
Puntas de pipeta de orificio grandeFischer Scientific02-707-134
Inhibidor de la proteasa de leupeptinaThermoFisher Scientific78435
Mark12 Escalera estándar sin teñirThermoFisher ScientificLC5677
MetanolMillipore SigmaMX0482
MetilcelulosaMillipore SigmaM0512
Microscope SlidesFischer Scientific12-553-10
MOPSFischer ScientificBP308-100
mPEG-silaneLaysan Bio, IncMPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain KinasePMID: 23148220MLCK marcado con FLAG se puede purificar de la misma manera que se purificó la miosina marcada con FLAG en este documento. 
NaN3Millipore SigmaS8032
NeutrAvidinThermoFisher Scientific31050
NitrocelulosaLadd Research Industries10800
NuPAGE 4 a 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15 pocillosThermoFisher ScientificNP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)ThermoFisher ScientificNP0007
fuerte, pH 7,4ThermoFisher Scientific10010023
PMSFMillipore Sigma78830El PMSF se puede hacer como una solución madre de 0,1 M en isopropanol y almacenarse en 4 °C. La adición de isopropanol da como resultado la precipitación de cristales, que se pueden disolver agitando a temperatura ambiente. Inmediatamente antes de su uso, PMSF se puede añadir gota a gota a una solución de agitación rápida hasta una concentración final de 0,1 mM.
cuchillas de afeitarOffice Depot397492
Rhodamina-FaloidinaThermoFisher ScientificR415Stock se puede diluir en metanol al 100% hasta una concentración final de 200 μM.
Sf9 MediaThermoFisher Scientific12658-027Esto debe almacenarse a 4&°C. Su vida útil es de 18 meses a partir de la fecha de fabricación.
cultivo de tejidos fuerte - Ensayo deslizanteCorningfuerte Cada placa cultivo de tejidos puede contener aproximadamente nueve cubreobjetos.
cultivo de tejidos fuerte - Ensayo invertidoCorningfuerte Cada placa cultivo de tejidos puede contener aproximadamente cuatro cubreobjetos.
Lados lisos 200 y micro; L Puntas de pipetaThomas Scientific1158U38
EQUIPMENT
CentrífugaThermoFisher Scientific75006590
MicroscopioNikonModelo: Eclipse Ti con sistema H-TIRF con objetivo TIRF 100x (N.A. 1.49)
microscopio fuerteAndor: cámara EMCCD iXon DU888 (formato de sensor de 1024 x 1024)
microscopio fuerte<>Tokai HITUnidad
< > fuerte< / unidad decuatro láseres > estado sólido para 405 nm, 488 nm, 561 nm y 640 nm
Mid Bench CentrifugageThermoFisher ScientificModel: CR3i
Misonix SonicatorMisonixXL2020
Optima Max-Xp Ultracentrífuga de sobremesaBeckman Coulter393315
Plasma-CleanerDiener electronic GmbH + Co. KGSystem Tipo: Zepto
Sonda de sonicador (3,2 mm)Qsonica4418
Standard IncubatorBinderModelo: 56
Waverly Tube MixerWaverlyTR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01)http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurementsFAST está disponible para sistemas basados en Mac OSX y Linux.
Image Stabilizer Pluginhttps://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMatehttps://imagej.net/TrackMate
Imaging SoftwareNIS Elements (paquete AR)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md
><0 < / láser de microscopio personalizada File:TrackMate-manual.pdf

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