La cuantificación de la fuerza máxima extensora de la rodilla es imprescindible para comprender las adaptaciones funcionales al envejecimiento, la enfermedad, las lesiones y la rehabilitación. Presentamos un método novedoso para medir repetidamente el par tetánico máximo isométrico de extensión de rodilla in vivo.
Artículo de método
Medición in vivo de la función muscular extensora de la rodilla en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
La plasticidad del músculo esquelético en respuesta a innumerables condiciones y estímulos media la adaptación funcional concurrente, tanto negativa como positiva. En la clínica y el laboratorio de investigación, la fuerza muscular máxima se mide ampliamente longitudinalmente en humanos, luego de la musculatura extensora de rodilla como el resultado funcional más reportado. La patología del complejo muscular extensor de la rodilla está bien documentada en el envejecimiento, la lesión ortopédica, la enfermedad y el desuso; La fuerza extensora de la rodilla está estrechamente relacionada con la capacidad funcional y el riesgo de lesiones, lo que subraya la importancia de una medición confiable de la fuerza extensora de la rodilla. La evaluación repetible e in vivo de la fuerza extensora de la rodilla en estudios preclínicos con roedores ofrece valiosos criterios de valoración funcionales para los estudios que exploran la osteoartritis o la lesión de rodilla. Informamos un protocolo in vivo y no invasivo para medir repetidamente el par tetánico máximo isométrico de los extensores de rodilla en ratones a lo largo del tiempo. Demostramos consistencia utilizando este nuevo método para medir la fuerza del extensor de rodilla con una evaluación repetida en múltiples ratones que producen resultados similares.
Introducción
El músculo esquelético es un tejido altamente adaptable con alteraciones compensatorias de la masa y la estructura en respuesta a una miríada de estímulos, como el ejercicio, la nutrición, las lesiones, las enfermedades, el envejecimiento y el desuso. Muchos estudios que investigan la adaptación del músculo esquelético en humanos emplean métodos para medir tanto el tamaño del músculo esquelético como el impacto en la función, ya que las evaluaciones de fuerza estándar de oro son fácilmente repetibles en sujetos humanos.
Específicamente, el extensor de rodilla y la fuerza flexora se evalúan más en la investigación clínica. Las alteraciones en la fuerza extensora de la rodilla se han reportado ampliamente en estudios en humanos de envejecimiento, ejercicio, lesión ortopédica, osteoartritis de rodilla, enfermedad crónica y desuso1,2,3,4,5,6,7. Sin embargo, los métodos para analizar repetidamente y de forma no invasiva la fuerza del músculo extensor de la rodilla (cuádriceps) en estudios mecanicistas con roedores han sido relativamente limitados. Previamente se desarrolló un método para determinar in vivo la contractilidad muscular del cuádriceps enratas 8; sin embargo, se requiere una construcción extensa de equipos no disponibles comercialmente. Dada la amplitud de los modelos de roedores desarrollados para estudiar los resultados musculoesqueléticos después de una lesión de rodilla / osteoartritis9,10,11,12,13 existe la necesidad de una evaluación no invasiva de la fuerza del cuádriceps.
Además, los estudios con roedores que investigan los mecanismos moleculares que sustentan la adaptación del músculo esquelético a menudo utilizan modelos de ratón debido a la simplicidad de la modificación genética, al igual que muchos estudios de intervención farmacológica debido a la disminución del gasto financiero asociado con una menor dosificación basada en el peso de un medicamento en ratones en comparación con las ratas. Informamos un método no invasivo para medir repetidamente la función extensora de rodilla in vivo en el mismo ratón a lo largo del tiempo utilizando equipos disponibles comercialmente con modificaciones menores, facilitando la reproducibilidad entre diferentes laboratorios y proporcionando una comparación más directa con los resultados de la fuerza humana.
Protocolo
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kentucky.
1. Configuración del equipo
- Confirme que las máquinas están conectadas según las especificaciones del fabricante.
- Si aún no está en su lugar, conecte el motor 300D-305C-FP con aparato de extensión de rodilla a la plataforma animal 809C.
- Encienda la bomba de agua a 37 °C para comenzar a calentar la plataforma.
- Si la computadora aún no está encendida, encienda la computadora, seguida del estimulador bifásico de alta potencia y el sistema de palanca de modo dual de 2 canales.
- Vierta el isoflurano en el vaporizador hasta obtener la máxima línea de llenado.
2. Configuración del software
- Abra el software (detalles proporcionados en la Tabla de materiales).
- Para utilizar la función de estimulación instantánea junto con Live Data Monitor para optimizar la colocación de la sonda (paso 4), seleccione Preparar experimento seguido de Configurar instant Stim (Figura 1). Establezca la frecuencia de pulso (Hz) como 125, el ancho de pulso (ms) como 0,2, el número de pulsos como 1, la frecuencia del tren (Hz) como 0,5 y el tiempo de ejecución (s) como 120.
- Seleccione Archivo y abra Live Data Monitor.
- Para realizar experimentos de contracción (paso 5) y de frecuencia de par (paso 6), seleccione un estudio previamente programado que incluya experimentos apropiados de contracción y extensión de rodilla de frecuencia de par (que se detallan a continuación en los pasos 5 y 6).
- Seleccione el ratón experimental apropiado o Agregar nuevo animal e introduzca la información correspondiente del ratón que se almacenará con los datos de par.
- Seleccione Siguiente experimento o Experimento anterior para pasar del protocolo de contracción a la secuencia de frecuencia de par.
3. Configuración del ratón
- Coloque el ratón individual en la cámara anestésica.
- Libere la válvula del tanque de oxígeno y establezca el caudal de oxígeno en 1 L / min con 2.5% de isoflurano.
- Asegúrese de que el ratón permanezca en la cámara con la tapa bien cerrada hasta que quede completamente inconsciente. Confirme la pérdida completa del conocimiento por ausencia de reflejo pie con pellizco en el dedo del pie.
- Coloque el ratón anestesiado en posición supina con la cabeza en la nosecone en la plataforma calentada con un caudal de oxígeno a 1 L/min con 2,5% de isoflurano.
- Afeitarse el cabello de la extremidad posterior derecha usando cortapelos eléctricos. Retire el vello de la zona afeitada con una toallita con alcohol y una pequeña aspiradora. Limpie el vello eliminado de la extremidad posterior y la plataforma.
- Sujete de forma segura la extremidad superior posterior, posterior a la rodilla (Figura 2).
NOTA: Asegúrese de que el rango de movimiento de la rodilla no se vea obstaculizado. - Coloque la extremidad posterior inferior en el aparato de extensión de la rodilla con la tibia anterior tocando ligeramente la pieza de plástico ajustable (la lectura del canal Force In debe leer entre 0 y -1.0 mN * m). Dependiendo del tamaño de la extremidad posterior inferior del ratón, la cinta quirúrgica se puede envolver alrededor de la parte inferior de la pieza de plástico ajustable para permitir que la pierna descanse de manera segura.
NOTA: Las imágenes detalladas y las dimensiones de la pieza de plástico fabricada a medida se muestran en la Figura suplementaria 1. - Ajuste las perillas en la plataforma para asegurarse de que la rodilla esté doblada a 60 °.
- Coloque ligeramente un trozo de cinta adhesiva sobre el torso del ratón en la plataforma para evitar el movimiento compensatorio con la máxima extensión de la rodilla.
4. Colocación del electrodo
- Coloque electrodos por vía subcutánea de 2-4 mm proximal a la rodilla directamente por encima de los músculos extensores cuádriceps/rodilla (Figura 2). Los electrodos deben estar separados aproximadamente por 1-2 mm.
- Para determinar la colocación óptima de los electrodos, utilice la función de estimulación instantánea con Live Data Monitor. Establezca el amperaje/corriente en 50 mA para contracciones repetidas para confirmar la extensión de la rodilla (los extensores de rodilla producirán una curva de contracción negativa). Ajuste las sondas durante la estimulación instantánea para lograr el máximo par de contracción de la extensión de la rodilla medido en la ventana Live Data Monitor.
NOTA: La Figura 3 muestra una salida representativa de estimulación instantánea, confirmando la extensión de la rodilla. El video complementario 1 y el video suplementario 2 muestran contracciones extensores de rodilla en tiempo real y en cámara lenta sin el brazo motor en su lugar, lo que permite la confirmación visual de la extensión de la rodilla. - Durante las contracciones repetidas con estimulación instantánea,palpe los músculos flexores de la rodilla con el dedo índice para confirmar que no hay activación de los músculos antagonistas. Para estimular al máximo los extensores de rodilla, el reposicionamiento de la sonda puede ser necesario dependiendo de la composición corporal del ratón y ligeras diferencias anatómicas en la ubicación exacta del punto motor del nervio femoral y los músculos extensores de la rodilla.
NOTA: Un punto motor muscular es el lugar donde la rama motora de un nervio entra en el vientre muscular y es el punto con menor resistencia a la conductividad eléctrica y posteriormente la mayor capacidad de respuesta a la estimulación eléctrica14,15. En aplicaciones clínicas que utilizan estimulación eléctrica, este punto se identifica escaneando con un electrodo de pluma para encontrar la ubicación por encima del músculo en la que se produce una contracción muscular con la corriente inyectada más baja14,15. La identificación del punto motor muscular es fundamental para facilitar una óptima estimulación eléctrica neuromuscular15. En ensayos clínicos en humanos, se han identificado puntos motores musculares para los músculos del cuádriceps en la mitad distal del músculo14. Para lograr una estimulación óptima del extensor de rodilla en ratones, esta técnica se recapituló mediante la colocación de electrodos con estimulación instantánea para aproximarse más a las ubicaciones de los puntos motores musculares más cercanos que se encuentran típicamente en la mitad distal de los extensores de rodilla. Existe cierta variabilidad en la colocación del electrodo (de relativamente superficial a profunda) que resulta en un par máximo, y la función de estimulación instantánea facilita la colocación óptima del electrodo.
5. Determinación de la corriente óptima
- Una vez que se determine la ubicación óptima de la sonda, realice una serie de contracciones progresivas para determinar el amperaje / corriente óptimo que se utilizará para el experimento de frecuencia de par, con el objetivo de determinar la corriente más baja para lograr la salida de par de contracción máxima. Comience con el conjunto de corriente a 50 mA y seleccione Ejecutar experimento para producir una sola contracción. Seleccione Analizar resultados para mostrar la salida de par. Registre el par de contracción que se muestra en Fuerza máxima con la línea de base restada.
NOTA: Seleccione la opción para invertir el canal de fuerza para convertir las mediciones de par negativo a positivo. - Aumente la corriente a 60-70 mA y repita el experimento de contracción. Registre el par de contracción que se muestra en Fuerza máxima con la línea de base restada.
- Continúe con una serie de experimentos de contracción de esta manera (aumentando aproximadamente 10-20 mA con cada progresión) hasta que el par de contracción ya no aumente (ya sea se estanca o comience a disminuir). El ejemplo de serie de contracción se muestra en la Tabla 1.
- Registre la corriente más baja a la que se logró el par de contracción más alto. Esta corriente se utilizará y se mantendrá constante durante el próximo experimento de fuerza-frecuencia. La Figura 4 muestra una contracción máxima representativa.
6. Experimento de frecuencia de par para determinar el par tetánico isométrico máximo
- En el software (consulte la Tabla de materiales),seleccione el experimento de frecuencia de par preprogramado para la extensión de la rodilla asegurando el ajuste posterior. Duración del estímulo: 0.35 s, Secuencia de frecuencia: 10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz, Período de reposo entre pulsos/contracciones: 120 s
NOTA: La frecuencia de muestreo es de 10.000 Hz (configuración predeterminada). - Ejecute el experimento, analice los resultadosy registre manualmente el par que se muestra en Fuerza máxima con la línea de base restada (asegúrese de que el canal de fuerza esté invertido, ya que la contracción del extensor de la rodilla producirá un par negativo) en cada frecuencia. Tenga en cuenta el valor de fuerza máxima más alto como el par tetánico isométrico máximo. Ejemplo de datos de frecuencia de par se muestra en la Tabla 2 y la Figura 5 muestra una curva de tétanos representativa para la salida de par tetánico isométrico máximo alcanzado a 120 Hz.
7. Finalización del experimento
- Al finalizar el experimento de frecuencia de par, realice una contracción de seguimiento y compare con la contracción máxima inicial a la misma corriente para evaluar el daño / fatiga.
NOTA: En algunos modelos de lesión y enfermedad, se espera un aumento de la fatigabilidad del músculo esquelético y no constituye un problema con la configuración experimental o el ratón. - Cuando se completen todas las mediciones de par, retire suavemente las sondas de los electrodos y desenfunde la rodilla.
- Apague el isoflurano y retire el ratón del cono de la nariz.
- Coloque el ratón de nuevo en una jaula apropiada colocada encima de una almohadilla de calentamiento. Monitoree mientras el ratón se recupera y recupera la conciencia.
NOTA: El ratón debe estar consciente y en movimiento en 2-3 min.
8. Análisis de datos
- Extraiga los datos después del experimento del software de análisis (consulte la Tabla de materiales).
- Software de análisis abierto.
- Seleccione Obtener datos del software.
- Seleccione Fecha en la que se realizó el experimento y el código de ratón apropiado.
- Seleccione la frecuencia de interés (se enumerarán todos los experimentos de contracción y cada frecuencia del experimento de frecuencia de par).
- Seleccione Análisis muscular.
- Confirme que la casilla Usar corrección de línea base está marcada.
NOTA: El software calcula el par de referencia como el promedio de los primeros 100 puntos muestreados y restados del valor de par máximo absoluto. - Registre el valor de par que aparece en Máximo.
NOTA: Los datos presentados aquí no están filtrados; sin embargo, se puede seleccionar un filtro en el software, si se desea.
- Alternativamente, como se describió anteriormente en el paso 6.2, registre manualmente la salida de par que se muestra en Fuerza máxima en tiempo real en cada punto / contracción de frecuencia de par a través de la ventana Analizar resultados.
- Confirme que la línea base está restada y que el canal de fuerza está invertido.
- Ingrese datos en una hoja de cálculo para cálculos de normalización del peso corporal (torque / peso corporal en gramos) y análisis gráficos y estadísticos de interés. Se utilizó un software estadístico con el propósito de graficar curvas de torque-frecuencia y calcular el área debajo de la curva.
NOTA: Los datos de par se miden en mN.m (milliNewton.meters).
- Para generar curvas de tétanos, exporte datos completos de cada frecuencia desde el software de análisis.
- Repita los pasos 8.1.1-8.1.4 anteriores.
- Seleccione Exportar datos.
- Seleccione Datos filtrados sin procesar y guárdelos en la ubicación de su elección. MATLAB se puede utilizar para generar curvas de tétanos a partir del archivo de texto exportado y/o para un análisis posterior.
NOTA: El código de MATLAB para generar la curva de tétanos a partir de un archivo de texto está disponible bajo petición.
9. Calibración del sistema de palanca de modo dual
- Calibre el sistema antes del uso inicial para garantizar datos precisos y confiables, y repita la calibración periódicamente utilizando el software de recopilación de datos y los pesos conocidos.
- Software abierto de recopilación de datos.
- Haga clic en la ficha Configuración y seleccione Configuración de canal.
- Seleccione 305C-FP en la lista mis instrumentos.
- Haga clic en Calibrar seleccionado para abrir la ventana Editor de calibración.
- Para calibrar la longitud, ingrese una serie de voltajes de prueba que incluyan voltajes negativos y positivos (por ejemplo, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3 V).
- Haga clic en Establecer para la primera línea.
- Haga clic en Leer.
- Mida la longitud exacta del brazo de palanca en milímetros e ingrese en la caja correspondiente.
- Repita para el siguiente voltaje.
- Al registrar todos los voltajes, haga clic en Calcular factores de cal (registrados en mm/voltio).
- Para calibrar la fuerza, utilice un conjunto de pesos conocidos que aumentan en una progresión lineal.
- Ajuste el motor para que descanse en el borde del banco o mesa con el brazo de palanca paralelo a la mesa de trabajo y colgando sobre el borde para permitir que el peso cuelgue.
- Cuelgue el primer peso del brazo de la palanca con una banda elástica. En Fuerza aplicada,ingrese el peso conocido en gramos que representa la masa de la banda elástica.
- Seleccione Leer.
- Repita durante al menos 3 pesos conocidos.
- Seleccione Calcular factor de cal.
- Para verificar el cálculo, trace los datos de calibración y el ajuste de la curva seleccionando Trazar cal.
- Para calibrar la salida de fuerza, introduzca voltajes de calibración (hasta 10 voltios)
- Haga clic en Establecer directamente junto al voltaje de calibración.
- Repita para cada línea de voltaje.
- Aplique presión suavemente al brazo de la palanca con un dedo hasta que la salida de fuerza deje de cambiar y el brazo motor comience a moverse.
- Mantener esta posición. Seleccione Leer.
- Repita para cada línea de voltaje.
- Seleccione Calcular factor de cal.
Resultados
La curva torque-frecuencia utiliza frecuencias más bajas para producir múltiples contracciones isométricas aisladas de torque relativamente bajo y progresa a través de frecuencias cada vez más altas, lo que resulta en la fusión de contracciones para una contracción isométrica del tétanos en la que se obtiene el par tetánico máximo. El protocolo presentado para el par tetánico máximo de extensión de rodilla inicia la curva fuerza-frecuencia a 10 Hz que provoca 3 contracciones aisladas. La fusión parcial de contracciones ocurre a 40 Hz, y el par tetánico máximo se alcanza entre 120-180 Hz (Figura 5).
La Figura 6 ilustra las curvas representativas de frecuencia de par de extensión de rodilla de ratones hembra C57BL/6. Se probaron tres ratones separados al inicio del estudio, y el experimento se repitió en cada ratón 2 semanas después para su comparación para evaluar la reproducibilidad. Las curvas de torque-frecuencia se muestran con valores de torque bruto(Figura 6A),así como valores de torque bruto normalizados al peso corporal del mouse(Figura 6B). Las observaciones repetidas demuestran resultados comparables en los 3 ratones con un período de descanso de 2 semanas entre experimentos. Los datos de torque normalizado del peso corporal deben considerarse además del torque bruto, ya que una fluctuación menor en el peso puede afectar la salida funcional y no se considera solo con el torque bruto. Además, los datos de torque normalizado del peso corporal facilitan la comparación de ratones de diferentes tamaños. El par también se puede normalizar al peso húmedo muscular o al área de sección transversal de miofibra, como hemos demostrado anteriormente16.
La Figura 7A muestra el área bajo la curva utilizando datos de torque isométrico normalizado de peso corporal de experimentos completos de frecuencia de torque (10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz) para 4 ratones C57BL / 6 separados, destacando una salida de par total similar y coeficientes de variación entre 5.6% a 8.8% con experimentos repetidos dentro de los mismos ratones. Los datos se informan más simplemente como par tetánico máximo(Figura 7B),que es el valor máximo de par de las contracciones isométricas repetidas del tétanos de 120-200 Hz. La salida de par tetánico máximo es comparable en ratones C57BL/6 hembra de 6-8 meses de edad(Figura 7B)con coeficientes de variación entre 4.8% y 8.7% con evaluación longitudinal dentro de los mismos ratones. El par tetánico máximo es más comparable a la evaluación de resistencia estándar de oro en estudios en humanos: toque isométrico máximo.
Además, el protocolo de par tetánico máximo extensor de rodilla es una herramienta útil para detectar diferencias de fuerza en múltiples modelos de ratón. La Figura 8 demuestra el marcado contraste entre la fuerza extensora de la rodilla en un ratón hembra C57BL/6 de 6 meses de edad no lesionado y sano (línea negra) y un modelo de ratón transgénico de hipertrofia suprafisiológica en el que se elimina la miostatina/GDF8 (línea azul). También mostramos una curva de tetánico pico de un ratón C57BL / 6 7 días después de la transección quirúrgica del ligamento cruzado anterior (ACL-T) (línea roja), lo que demuestra una disminución de casi el 50% en el par máximo después de la lesión, que está muy fuera de los coeficientes de variación observados con pruebas repetidas de ratones ilesos. Simultáneamente con los datoshumanos17,18, la fuerza disminuye notablemente con ACL-T. Todos los ratones son hembras y de edad similar (6-8 meses).
| Experimento twitch | Amperaje/Corriente (mA) | Par (mN•m) |
| 1 | 50 | 1.279 |
| 2 | 70 | 1.341 |
| 3 | 90 | 1.36 |
| 4 | 110 | 1.362 |
| 5 | *130 | 1.449 |
| 6 | 150 | 1.436 |
| 7 | 140 | 1.333 |
Tabla 1: Ejemplo de serie de contracción. * denota amperaje/corriente óptimo.
| Frecuencia (Hz) | Par (mN•m) |
| 10 | 1.385 |
| 40 | 1.869 |
| 120 | *18.765 |
| 150 | 18.375 |
| 180 | 17.97 |
| 200 | 17.548 |
Tabla 2: Ejemplo de datos de curvas de par-frecuencia. * denota el par tetánico máximo.
Figura 1: Configuración del software de recopilación de datos. Ilustración de la configuración del software de recopilación de datos con Live Data Monitor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración del ratón y colocación del electrodo. (A-B) Posición supina del ratón que recibe anestesia a través de un cono nasal en la plataforma calentada. La extremidad posterior superior se sujeta de forma segura, posterior a la rodilla para permitir el movimiento sin restricciones en la articulación de la rodilla. El brazo motor se ajusta de modo que la rodilla se dobla a aproximadamente 60 °. El punto motor del nervio femoral es estimulado por electrodos de aguja para activar la contracción de los extensores de la rodilla. La configuración del ratón se muestra desde una vista lateral (A) y una vista cenital (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Determinación de la colocación óptima del electrodo para lograr la extensión isométrica de la rodilla. Representación de contracciones negativas repetidas estimuladas con 50 mA utilizando la función de Estimulación Instantánea y vistas en el Monitor de Datos en Vivo. Las flechas rojas indican las tres primeras contracciones de extensión de rodilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Contracción representativa para determinar el amperaje óptimo. El amperaje más bajo para obtener el par isométrico de contracción más alto debe determinarse para el experimento fuerza-frecuencia mediante experimentos de contracción repetidos con un amperaje progresivamente mayor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Curvas de par tetánicas representativas a lo largo de un experimento de frecuencia de par para el mismo ratón. (A) Par tetánico isométrico submáximo producido a 10 Hz. (B) Par tetánico isométrico submáximo a 40 Hz. (C) Salida máxima de par tetánico isométrico a 120 Hz. (D) Par tetánico isométrico a 150 Hz. (E) Par tetánico isométrico a 180 Hz. (F) Par tetánico isométrico a 200 Hz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Datos representativos de la curva de frecuencia de par. (A-B). Curva de torque-frecuencia en 2 puntos de tiempo diferentes (semana 1 y 3) en 3 ratones separados, presentada como par máximo bruto(A)y par máximo bruto normalizado al peso corporal(B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Área representativa bajo la curva (AUC) y datos de par tetánico máximo. (A) AUC para 4 ratones separados, presentado como par bruto normalizado al peso corporal. (B) Par tetánico máximo para los mismos 4 ratones, presentado como par tetánico máximo bruto normalizado al peso corporal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Par tetánico máximo de los extensores de rodilla en múltiples modelos de ratón. Curvas de tetánico de par máximo representativas para un modelo de ratón transgénico con hipertrofia declarada (GDF8 KO), un ratón C57BL/6 sano no ileso (ratón 2) y un ratón C57BL/6 7 días después de la transección del ligamento cruzado anterior (ACL-T). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1:Dimensiones del plástico fabricado a medida. El recuadro en rojo muestra la dimensión de la profundidad. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Video complementario 1: Contracción extensora de rodilla en tiempo real sin brazo motor. Haga clic aquí para descargar este video.
Video complementario 2: Contracción extensora de rodilla en cámara lenta sin brazo motor. Haga clic aquí para descargar este video.
Discusión
La medición y el análisis de la función muscular en modelos de roedores es imperativo para hacer inferencias traslacionales y significativas con respecto a las adaptaciones histológicas y moleculares del músculo esquelético observadas con el ejercicio, la lesión, la enfermedad y el tratamiento terapéutico. Demostramos un método para evaluar la fuerza máxima del extensor de rodilla de manera confiable y repetida en ratones utilizando equipos disponibles comercialmente, con la pieza de plástico ajustable para sostener la extremidad posterior inferior en la tibia anterior siendo la única parte fabricada a medida que puede ser replicada.
Las herramientas comunes de evaluación funcional se han utilizado ampliamente para evaluar repetidamente el rendimiento físico dentro del mismo ratón, como la carrera en cinta de correr a la fatiga volitiva, la prueba de rendimiento de la rotavara, la prueba de adherencia invertida y la prueba de fuerza de agarre. Sin embargo, aunque informativas, estas evaluaciones involucran componentes cardiopulmonares y conductuales, que pueden ofuscar el interrogatorio de la función neuromuscular asociada con estas medidas de rendimiento físico. Además, los elementos de resistencia, coordinación y equilibrio están presentes en muchas de estas evaluaciones funcionales a diferentes niveles, lo que limita la interpretación clara en relación con la fuerza muscular. La capacidad de producción de fuerza de los músculos de roedores se puede medir in vitro, in situ o in vivo. Cada enfoque tiene ventajas y limitaciones relativas. En concreto, con la valoración in vitro, el músculo queda completamente aislado y retirado del cuerpo del animal para que no haya influencia de la perfusión o la inervación19. Esto produce un ambiente bien controlado para determinar la capacidad contráctil, pero limita el tamaño del músculo que se está estudiando a través de la dependencia de la difusión pasiva de oxígeno y nutrientes durante las pruebas. Las pruebas in situ mantienen la inervación y el suministro de sangre del músculo, pero se limitan a una evaluación terminal singular, como con las pruebas in vitro20. Finalmente, las pruebas in vivo son las menos invasivas con el músculo permaneciendo en su entorno nativo con electrodos percutáneos insertados cerca del nervio motor para estimular eléctricamente el músculo. Una fortaleza del enfoque in vivo es el potencial de pruebas longitudinales a través del tiempo21,22,23.
La evaluación in vivo de la contractilidad muscular máxima mide de manera óptima la fuerza máxima, ya que la anatomía y fisiología normales del ratón permanecen intactas y el método puede repetirse en el mismo ratón antes y después de una intervención o durante toda la vida útil. Específicamente, la medición in vivo de la fuerza extensora de la rodilla en ratones es la evaluación de la fuerza murina con la mayor relevancia traslacional para los estudios en humanos, ya que el par máximo de extensión de la rodilla se mide comúnmente y se considera la prueba de fuerza estándar de oro en humanos con correlación con varios resultados funcionales y de salud24,25,26,27 . Además, la patología extensora de rodilla se observa con el envejecimiento, así como una miríada de lesiones y enfermedades1,2,4,5,6,pero la evaluación del impacto de estas condiciones en la fuerza del extensor de la rodilla longitudinalmente en ratones no ha sido fácilmente alcanzable.
Aunque este método ofrece utilidad para determinar el par máximo extensor de rodilla de manera longitudinal, se deben considerar ciertas limitaciones del protocolo. Las frecuencias más bajas entre 40 Hz y 120 Hz se omitieron del protocolo de frecuencia de par, lo que puede limitar la capacidad de detectar desplazamientos hacia la izquierda o hacia la derecha en la curva de frecuencia de par con lesiones o enfermedades. Sin embargo, utilizando este protocolo de torque-frecuencia, hemos podido detectar alteraciones en el par tetánico máximo en un modelo de lesión del LCA y entre ratones de tipo salvaje C56BL/6 y un modelo de ratón transgénico de masa muscular suprafisiológica(Figura 8). Observamos que puede ser beneficioso asegurar los electrodos con manos de ayuda o aparatos similares, ya que las contracciones musculares pueden mover los electrodos ligeramente. No observamos ningún desplazamiento evidente de electrodos con contracciones progresivas; sin embargo, no se puede descartar la posibilidad de un ligero movimiento de los electrodos, lo que puede afectar la estimulación muscular. Además, la electromiografía intramuscular (EMG) no se realizó junto con el protocolo de estímulo; sin embargo, la inclusión de medidas de EMG puede ser factible, si se desea y es apropiada para el modelo experimental de interés.
La evaluación de la fuerza extensora de la rodilla en modelos murinos de lesión y enfermedad ortopédica facilitará la investigación preclínica con una relevancia traslacional significativa para las medidas de fuerza clínica. Nuestro protocolo permite una evaluación precisa y repetida de la fuerza máxima del extensor de rodilla en ratones con equipos disponibles comercialmente accesibles para cualquier laboratorio.
Divulgaciones
Matthew Borkowski es empleado de Aurora Scientific Inc., una compañía que potencialmente puede beneficiarse de los resultados de la investigación y también es un ejecutivo de la compañía.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Rosario Maroto por su asistencia técnica. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio R01 AR072061 (CSF). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1300A: Sistema animal completo 3 en 1 - Ratón | Aurora Scientific Incorporated | 300D-305C-FP: motor de modo dual con aparato de extensión de rodilla personalizado, 605A: Sistema dinámico de adquisición y análisis de datos musculares, 701C: estimulador eléctrico, 809C: in-situ Aparato | |
| 6100 Control Muscular Dinámico LabBook software | Aurora Scientific Incorporated | DMC v6.000 | |
| 611A Dinámico Análisis muscular | Aurora Scientific Incorporated | DMA v5.501 | |
| Cortapelos BravMini | Wahl Clipper Corporation | ASIN: B00IN24ILE | |
| Eye Lube | Optixcare | Nº Ref.: 142422 | |
| Isoflurano | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | |
| V-1 Sistema de anestesia para animales de laboratorio de sobremesa | Sistemas de anestesia inhalatoria VetEquip | Número de artículo: 901806 | |
| Prism 8 | GraphPad Software, LLC | versión 8.3.0 (328) |
Referencias
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