Se presenta un método para la inflación del aire con fijación de perfusión vascular de los pulmones que preserva la ubicación de las células dentro de las vías respiratorias, los alvéolos y el intersticio para los análisis de estructura-función. La presión constante de las vías respiratorias se mantiene con una cámara de inflado de aire, mientras que el fijador se perfunde a través del ventrículo derecho. Los pulmones se procesan para estudios histológicos.
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Artículo de método
Inflado al aire de los pulmones murinos con fijación de perfusión vascular
En este artículo
Resumen
Resumen
La histología pulmonar se utiliza a menudo para investigar las contribuciones proporcionadas por las células del espacio aéreo durante la homeostasis pulmonar y la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, los métodos de fijación basados en la instilación comúnmente utilizados pueden desplazar las células del espacio aéreo y el moco en las vías respiratorias terminales y pueden alterar la morfología del tejido. En comparación, las técnicas de fijación de perfusión vascular son superiores para preservar la ubicación y la morfología de las células dentro de los espacios aéreos y el revestimiento de la mucosa. Sin embargo, si la presión positiva en las vías respiratorias no se aplica simultáneamente, las regiones de los pulmones pueden colapsar y los capilares pueden abultarse en los espacios alveolares, lo que lleva a la distorsión de la anatomía pulmonar. Aquí, describimos un método económico para la inflación del aire durante la fijación de perfusión vascular para preservar la morfología y la ubicación de las células de las vías respiratorias y alveolares y el intersticio en los pulmones murinos para estudios histológicos aguas abajo. La presión de aire constante se entrega a los pulmones a través de la tráquea desde una cámara sellada y llena de aire que mantiene la presión a través de una columna de líquido ajustable mientras que el fijador se perfunde a través del ventrículo derecho.
Introducción
La histología pulmonar representa el estándar de oro para evaluar la arquitectura pulmonar durante la salud y la enfermedad y es una de las herramientas más utilizadas por los investigadores pulmonares1. Uno de los aspectos más críticos de esta técnica es el adecuado aislamiento y preservación del tejido pulmonar, ya que la variabilidad en este paso puede conducir a una mala calidad del tejido y resultados erróneos1,2,3. En animales vivos, el volumen pulmonar está determinado por el equilibrio entre el retroceso elástico hacia adentro del pulmón y las ....
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Protocolo
Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de National Jewish Health.
NOTA: El protocolo está organizado en tres componentes. El primer componente detalla la construcción del inflado de aire con equipos de perfusión/fijación. Una segunda sección describe cómo configurar el equipo para un experimento. La sección final describe cómo preparar al animal y realizar el experimento.
1. Construcción del aparato de columna de agua (Figura 1B)
- Retire el émbolo de una jeringa de punta deslizante de ....
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Resultados
En un tórax intacto, los pulmones se mantienen abiertos por fuerzas externas aplicadas por la pared torácica a través del espacio pleural6,14. Cuando se ingresa el diafragma durante la disección, la integridad del espacio pleural se abole y los pulmones deben colapsar(Figura 2A,2B). Para volver a expandir los pulmones, se realiza el inflado del aire. Como primer paso, se aplican 25 cm de presión de agua para garantiz.......
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Discusión
Aunque se usan comúnmente, los métodos de fijación intratraqueales desplazan a los leucocitos de las vías respiratorias y pueden alterar la arquitectura pulmonar normal. El método de inflado de aire con fijación de perfusión vascular que se proporciona en este protocolo supera estos escollos y preserva con mayor precisión la anatomía pulmonar. Las claves para obtener tejido de alta calidad del método de fijación de perfusión vascular incluyen un monitoreo cuidadoso de las presiones de inflado de aire, evitar fugas de air.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por las subvenciones HL140039 y HL130938 del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI). Los autores desean agradecer a Shannon Hott y Jazalle McClendon por su experiencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 00117XF-Llave de paso 1 vía 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Articulo # EW-00117-XF | Llave de paso |
| BD 60 mL jeringa, punta deslizante | BD | 309654 | Jeringa utilizada para construir la columna |
| de agua BD Aguja PrecisionGlide 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 Aguja para perfusión/fijación vascular | |
| Hembra Luer Estilo de rosca Luer Montaje en panel 1/4-28 UNF a Macho Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Luer Hembra |
| Heparina sal sódica de la mucosa intestinal porcina | Sigma-Aldrich | H3393 | Solución de heparina. |
| Adaptador Luer-Stub BD Intramedic Calibre 20 | BD Biosciences | 427564 | Adaptador Luer-Stub |
| Macho Luer (2) a Hembra Camiseta estilo rosca Luer | Nordson Medical | LT787-9 | Macho Luer |
| Nalgene 180 Tubo de PVC de plástico transparente | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | |
| Tubo Solución acuosa de paraformaldehído - 32% | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 15714-S | Solución fijadora. Diluido al 4% con solución salina tamponada con fosfato |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Fabricante de juntas | Permatex | 81724 | Fabricante de juntas de silicona para el sellado hermético de cámaras |
| Solución salina tamponada con fosfato, 1x sin calcio y magnesio | Corning | 21-040-CV | Frasco utilizado para construir la cámara de inflado de aire y tampón utilizado para heparina y soluciones |
| fijadorasSterilite Ultra Seal 16.0 taza contenedor rectangular de almacenamiento de alimentos | Sterilite | 0342 | Contenedor de procesamiento animal |
Referencias
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bach....
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Reimpresiones y permisos
