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Behavior

Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Published: April 4, 2021 doi: 10.3791/62244
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics, The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Este estudo apresenta protocolos para duas abordagens semi-automatizadas de análise de atividade locomotor em C. elegans complexo I disease gas-1(fc21) worms, ou seja, ZebraLab (um ensaio de rendimento médio) e WormScan (um ensaio de alto rendimento) e fornecem análise comparativa entre uma ampla gama de métodos de pesquisa para quantificar o comportamento nematoides e função neuromuscular integrada.

Abstract

Caenorhabditis elegans é amplamente reconhecido por sua utilidade central como um modelo animal translacional para interrogar eficientemente mecanismos e terapias de diversas doenças humanas. Os vermes são particularmente adequados para telas genéticas e medicamentosas de alto rendimento para obter uma visão mais profunda sobre alvos e terapias terapêuticas, explorando seu ciclo de desenvolvimento rápido, grande tamanho de ninhada, vida útil curta, transparência microscópica, baixos custos de manutenção, conjunto robusto de ferramentas genômicas, repositórios mutantes e metodologias experimentais para interrogar tanto na si vivo quanto na fisiologia ex. A atividade locomotor de vermes representa um fenótipo particularmente relevante que é frequentemente prejudicado na doença mitocondrial, que é altamente heterogênea em causas e manifestações, mas compartilha coletivamente uma capacidade prejudicada de produzir energia celular. Embora um conjunto de diferentes metodologias possam ser usadas para interrogar o comportamento dos vermes, estes variam muito em custos experimentais, complexidade e utilidade para telas genômicas ou de alto rendimento. Aqui, foram comparadas as relativas rendimentos, vantagens e limitações de 16 metodologias diferentes de análise de atividade que quantificam a locomoção de nematoides, a surra, o bombeamento farínngeal e/ou a quimiotaxis em vermes únicos ou populações de vermes de C. elegans em diferentes estágios, idades e durações experimentais. Protocolos detalhados foram demonstrados para dois métodos semi-automatizados para quantificar a atividade locomotor nematode que representam novas aplicações de ferramentas de software disponíveis, ou seja, ZebraLab (uma abordagem de throughput médio) e WormScan (uma abordagem de alto rendimento). Os dados da aplicação desses métodos demonstraram graus semelhantes de redução da atividade animal ocorrida na fase larval L4, e progrediram no primeiro dia de adultos, no complexo mitocondrial I doença(gás-1(fc21)vermes mutantes relativos ao tipo selvagem (N2 Bristol) C. elegans. Esses dados validam a utilidade para essas novas aplicações de uso das ferramentas de software ZebraLab ou WormScan para quantificar a atividade locomotor de worm de forma eficiente e objetiva, com capacidade variável para suportar o rastreamento de drogas de alto rendimento no comportamento dos vermes em modelos animais pré-clínicos da doença mitocondrial.

Introduction

Caenorhabiditis elegans é amplamente reconhecido como um modelo excepcional na neurociência com base em ter 302 neurônios que coordenam todos os comportamentos de vermes, incluindo acasalamento, alimentação, colocação de ovos, defecação, natação e locomoção em mídia sólida1. Estes nematoides hermafroditas também são amplamente utilizados para entender uma ampla gama de mecanismos de doença humana, possibilitados por seu genoma bem caracterizado e alta homologia de ~80% de genes entre C. elegans e humanos2,3,4. C. elegans têm sido usados há muito tempo para interrogar a doença mitocondrial humana5,6,7,8,9,10, que é um grupo altamente geneticamente e fenotipicamente heterogêneo de distúrbios metabólicos herdados que compartilham capacidade prejudicada para gerar energia celular e muitas vezes clinicamente presente com função neuromuscular substancialmente prejudicada, intolerância ao exercício e fadiga11 ,12,13,14. Para isso, o uso de modelos C. elegans permite modelagem pré-clínica de aspectos quantitativos da atividade animal e função neuromuscular em diferentes subtipos genéticos da doença mitocondrial, bem como sua resposta a terapias candidatas que podem melhorar sua função neuromuscular e atividade geral.

A atividade neuromuscular em C. elegans é objetivamente mensurável por uma série de metodologias experimentais, incluindo abordagens manuais e semi-automatizadas que permitem análises funcionais em mídia sólida ou líquida(Tabela 1)1,15. A quantitação precisa da atividade de C. elegans tem se mostrado importante para permitir descobertas relacionadas à função e desenvolvimento do sistema muscular e nervoso16,17,18. Este estudo resume e compara requisitos experimentais, vantagens e limitações de 17 ensaios diferentes que podem ser realizados em laboratórios de pesquisa para avaliar a função neuromuscular e a atividade em quatro desfechos fundamentais em modelos de doenças C. elegans, tanto na linha de base em uma gama de estágios e idades do desenvolvimento, bem como em resposta às terapias dos candidatos (Tabela 1 ). De fato, o estudo fornece uma visão geral detalhada da gama de abordagens experimentais disponíveis para caracterizar taxas de C. elegans thrashing (dobras corporais por minuto), atividade locomotor, bombeamento farínngeal e quimiotaxis - em cada caso especificando a metodologia experimental e analítica utilizada, as vantagens e limitações de cada método, o equipamento e software necessários para executar e analisar cada ensaio, e a capacidade de rendimento de cada método para apoiar seu uso para fins de triagem genética ou medicamentosa de alto rendimento. A capacidade de rendimento de cada ensaio é descrita como baixa, média ou alta com base na complexidade experimental do protocolo, incluindo manutenção de vermes, tempo de processamento, uso de placas únicas ou multi-poços e/ou tempo de experimentador necessário para completar a configuração experimental e análises de dados.

As análises manuais de thrashing19, atividade locomotor20,bombeamento faríndico17,21, equimiotaxis 22,23 são metodologias bem estabelecidas para avaliar a atividade do verme que requerem um estereomicroscope24. Embora medir a atividade de desbaste de vermes requer análise em mídia líquida para determinar a frequência de dobras corporais por minuto, a atividade locomotor de vermes pode ser medida tanto em mídia sólida quanto em mídia líquida. No entanto, as análises manuais da atividade individual do worm são inerentemente demoradas e envolvem viés inevitável gerado pelo usuário. A automação das análises de atividade de worm minimiza o viés gerado pelo usuário e pode aumentar consideravelmente o throughput experimental25. Gravações de vídeo de atividade de espancamento de worms em mídia líquida podem ser analisadas usando wrMTrck, um plugin ImageJ26. No entanto, as configurações experimentais originais que foram desenvolvidas para o wrMTrck limitaram sua utilidade, uma vez que muitos worms em uma única gota líquida levaram à sobreposição de worms que dificultavam o rastreamento preciso. Embora essa limitação experimental tenha sido resolvida27,o método wrMTrck não é capaz de suportar a triagem de alto rendimento.

Existem uma série de métodos para quantificar a atividade locomotor de vermes na linha de base e em resposta às terapias candidatas em modelos de doença mitocondrial C. elegans. Estes incluem ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28, ampla plataforma de rastreamento de nematoides de campo de visão (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30,WormLab31, Infinity Chip32e WMicrotracker One33 (Tabela 1). Esses métodos permitem a análise simultânea da locomoção em múltiplas cepas ou condições de vermes, tipicamente em placas de vários poços, suportando assim aplicações de triagem de medicamentos de maior rendimento. Alguns desses métodos têm considerações únicas que podem limitar ou melhorar sua utilidade geral, como a necessidade de equipamentos caros versus software de acesso aberto e a facilidade variada de executar protocolos experimentais. No geral, nenhum sistema ou protocolo experimental único é ideal para todos os experimentos de atividade locomotor de C. elegans. Em vez disso, é importante escolher cuidadosamente qual método é mais adequado para as metas e requisitos experimentais do investigador específico.

O bombeamento faringeal representa outro resultado importante para avaliar a atividade neuromuscular em C. elegans. A faringe C. elegans é composta por 20 células musculares, 20 neurônios e 20 outras células que permitem a ingestão de Escherichia coli (E. coli)na extremidade anterior do trato alimentar do verme34,35,36. Vários métodos manuais foram estabelecidos para determinar as taxas de bombeamento faringeal17,21,37,38. A maioria dos métodos baseia-se no uso de um estereómico e câmera para visualizar e registrar a frequência de bombeamento faringeal com contagem direta pelo observador experimental21. A análise automatizada da taxa de bombeamento faringeal é possível realizando um registro extracelular denominado eletrofarngeoograma (EPG), que fornece informações adicionais sobre a duração de cada bomba39. A análise da taxa de bombeamento faringeal também é possível em um sistema microfluido, WormSpa, onde vermes individuais estão confinados nas câmaras40,41. Um método comercial disponível para facilitar a análise da taxa de bomba faríneal é o ScreenChip System (InVivo Biosystems), que mede, visualiza e analisa os aspectos neuromusculares do comportamento alimentar em um único verme que é imobilizado em um chip personalizado. Essa abordagem de quantitação de bombeamento faringeal pode ser usada para avaliar tanto as respostas neuronais quanto fisiológicas às drogas, ao envelhecimento e a outros fatores42,43,44,45.

A quimiotaxis descreve o movimento de C. elegans em resposta a um odorlante colocado longe dos vermes em uma área definida da placa de mídia de crescimento nematoide (NGM). Avaliar a resposta da quimiotaxis fornece uma medida integrada de atividade neuronal e neuromuscular de vermes que é quantificável observando e medindo a distância física percorrida por vermes em direção ao odorno em um período de tempo definido46. O Multi-Worm Tracker é um método automático que pode ser usado para melhorar a eficiência experimental de quantificar a distância percorrida por worms em direção a um atrativo ou de um repelente47.

Aqui, o protocolo detalhado para dois novos métodos semi-automatizados estabelecidos para quantificar a atividade do worm é descrito. A primeira abordagem utiliza o ZebraLab, um software comercial que foi originalmente desenvolvido para estudar a atividade de natação de Danio rerio (zebrafish), para um novo aplicativo de médio-rendimento para quantificar a atividade locomotor global em mídia líquida de C. elegans com base em mudanças de pixels durante o movimento(Tabela 1, Figura 1). A saída de dados é rapidamente obtida a partir de um grande número de condições simultâneas e amostras analisadas em um slide de vidro, embora este método não seja adequado para um formato de placa multi-poço. A segunda abordagem é uma nova adaptação da metodologia WormScan48,49 ( Figura2), que usa um scanner de plataforma para criar uma imagem diferencial de dois scans sequenciais que podem ser variadamente utilizados com software de código aberto para permitir a análise quantitativa semi-automatizada de desfechos fisiológicos integrados, como fecundidade e sobrevivência. Aqui, foi desenvolvida uma nova adaptação de alto rendimento da metodologia WormScan para quantificar a atividade locomotor de vermes em mídia líquida em populações de quinze vermes larval estágio 4 (L4) por poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. Esta metodologia wormScan semi-automatizada e de baixo custo pode ser prontamente adaptada a telas de drogas de alto rendimento, bem como a análises de vários estágios animais e idadesde 48,49anos .

Aqui, o protocolo e a eficácia da análise da atividade locomotor C. elegans utilizando métodos semi-automatizados ZebraLab e WormScan são demonstrados em um modelo C. elegans bem estabelecido para doença do complexo mitocondrial I, gas-1(fc21). gas-1 (gene K09A9.5) é uma ortopedia do NDUFS2 humano (NADH: ubiquinone oxidoreductase core (proteína ferro-enxofre) subunita 2)(Figura 3). A cepa mutante C. elegans gas-1(fc21) carrega uma mutação homozigosa p.R290K missense no topiche humano de NDUFS250,causando significativamente diminuição da fecundidade e da vida útil, capacidade de fosforilação oxidativa da cadeia respiratória prejudicada (OXPHOS) capacidade51, bem como diminuição da massa mitocondrial e potencial de membrana com aumento do estresse oxidativo5,8 . Apesar de seu uso bem estabelecido nas últimas duas décadas para estudar doença mitocondrial, a atividade locomotor de mutantes gas-1(fc21)não foi relatada anteriormente. Aqui, os métodos ZebraLab e WormScan foram aplicados para quantificar independentemente a atividade locomotor do gás-1(fc21) em comparação com vermes do tipo selvagem (WT, N2 Bristol), tanto como uma forma de validar os métodos quanto de demonstrar sua utilidade comparativa e eficiência dos protocolos experimentais e análises de informática. O software ZebraLab permitiu a rápida quantitação de várias condições simultâneas de atividade locomotor de vermes em modelos de doença mitocondrial C. elegans, com potencial aplicação para estudos de triagem ou validação de medicamentos direcionados. A análise do WormScan, em particular, é adequada para permitir prontamente telas de medicamentos de alto rendimento de bibliotecas compostas e priorizar leads que melhorem a função neuromuscular animal e a atividade locomotor em modelos pré-clínicos de C. elegans da doença mitocondrial primária.

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Protocol

1. Análise de atividade locomotor worm em mídia líquida em lâminas de vidro usando software ZebraLab

  1. Crescimento e manuseio de nematoides
    1. Cresça C. elegans em placas de Petri contendo mídia de crescimento de nematode (NGM) e espalhe-se com Escherichia coli OP50 como fonte de alimento. Mantenha a cultura dos vermes a 20 °C, como descrito anteriormente8.
    2. Sincronizar vermes realizando um ovo cronometrado coloca52 e estuda vermes no estágio desejado. Neste protocolo, foram analisados vermes de estágio L4.
    3. Aumentar o controle e as cepas de vermes mutantes em placas de NGM com e sem tratamentos medicamentosos a serem testados ou controle tampão. Para avaliar os efeitos do tratamento medicamentoso, prepare a concentração de estoque de medicamentos desejado na solução s. basal; espalhar o volume específico calculado sobre as placas de NGM e permitir que ele seque. Transfira os vermes em um estágio larval ou adulto específico e mantenha na placa de tratamento medicamentoso para a duração desejada antes da análise.
  2. Configuração experimental de worms para gravação de vídeo de atividade locomotor e análise do ZebraLab
    1. Escolha 5 worms L4 sincronizados por cepa e condição usando uma picareta de worm. Pipeta uma única gota de 20 μL de solução basal S. em um slide de vidro localizado sob um estereomicroscope conectado a uma câmera e transferir 5 worms para ela(Figura 1A, B). Transfira os 5 vermes da placa de Petri contendo NGM e E. coli OP50 para a queda líquida somente no momento anterior à gravação.
      NOTA: Continue mantendo os outros vermes na placa de Petri até que o vídeo anterior seja gravado. Isso evitará os danos causados nos outros vermes devido à secagem das gotas de 20 μl durante o procedimento (tempo seco ~15-20 min).
    2. Pipeta várias gotas em um slide para obter múltiplas réplicas técnicas(Figura 1A). Selecione worms de diferentes placas de NGM (replicação biológica). Não use deslizamento de cobertura.
    3. Ajuste a distância de trabalho do microscópio para visualizar a área completa de uma única gota. Defina e mantenha uma baixa resolução de vídeo (<1024 x 768) para carregar os arquivos no software.
    4. Deixe que os vermes se aclimatem no slide à temperatura ambiente por 1 minuto antes de gravar.
    5. Registo da atividade de natação de vermes em 1 queda por 1 min a 15 quadros por segundo (fps). Repita a imagem para cada gota adicional na placa.
  3. C. elegans locomotor análise de registro de atividades em software ZebraLab
    1. Use a opção ZEBRALAB AVI para enviar vídeos para o software. Clique na opção Quantização com Arquivos AVI (Figura 1C).
    2. Para criar um novo protocolo, selecione Arquivo > Gerar Protocoloe, em seguida, adicione o número de áreas selecionadas para a análise. Escolha contagem de locais: 1.
    3. Abra parâmetros de protocolo e selecione 1 min na janela Duração do experimento. Selecione uma duração experimental diferente para diferentes durações experimentais. Selecione ou desmarque a janela Sem Caixa de Tempo e escolha o Período de Integração,dependendo da saída de dados desejada. Neste estudo foi selecionado No Time Bin (Figura 1D).
      NOTA: A caixa de tempo é o tempo sobre o qual a atividade será mediada.
    4. Se um protocolo já foi criado, selecione Protocolo Aberto e selecione o protocolo salvo (em formato .vte).
    5. Selecione Arquivo e Abra um filme para carregar cada arquivo de vídeo individual que foi gravado anteriormente.
    6. Selecione o ícone De área indicado na Figura 1E (seta preta) para construir uma única área de detecção e crie uma área em torno de toda a gota de líquido onde os worms estão localizados. Clique em Selecionar, em seguida, o ícone do círculo verde (seta cinza) sob as > Build > Marcas Claras.
      NOTA: A atividade de todos os vermes na queda definida será detectada na área selecionada (Figura 1E,F).
    7. Vá para Calibração > Escala de desenho(Figura 1E) e desenhe uma linha horizontal da esquerda para a direita da área de vídeo. Indique a distância real para calibrar. Em seguida, selecione Solicitar ao Grupo.
    8. Desmarque o ícone selecionado para construir a área (seta na Figura 1E) e selecione ou desmarque Transparente.
      NOTA: Neste estudo, o Transparent foi selecionado e deu melhores resultados.
    9. Ajuste a sensibilidade de detecção e o limiar de atividade para permitir a detecção de todas as diferentes cepas de vermes C. elegans analisadas.
      NOTA: Neste experimento, a Sensibilidade de Detecção foi definida em 8 com valores de Estouro e Congelamento de 15 e 2, respectivamente(Figura 1F).
    10. Defina a escala de exibição em 70 para visualizar a faixa feita pelo animal enquanto a análise da atividade está em andamento. Em seguida, selecione Aplicar ao Grupo ( Figura1F).
    11. Clique em Experiment > Execute > Salvar como, e depois em Iniciar. Uma janela se abre. Escolha Você deseja processar a mídia de vídeo na velocidade máxima do computador? para analisar o vídeo rapidamente (por exemplo, uma gravação de vídeo de 1 min é analisada pelo software zebralab em 5 s).
    12. Outra janela se abre: Experiência de execução; clique em Começar a prosseguir com o experimento.
    13. Depois que a gravação do vídeo estiver concluída, a análise pára. Clique em Experiment > Stop. Isso salva a atividade analisada a partir de uma única queda em uma planilha.
    14. Repita a análise para cada vídeo de queda individual. Cada gota é uma réplica técnica.
  4. Saída e análise de dados do ZebraLab
    NOTA: Após o experimento, os dados de cada vídeo são salvos individualmente como planilhas separadas na pasta escolhida. No arquivo de saída de dados, o nível de atividade integrada de todos os worms que se movem em uma queda individual é registrado à medida que o pixel muda sob actinteg.
    1. Abra cada planilha obtida a partir da análise de cada vídeo. Compile-os manualmente em um único arquivo.
      Normalize os dados mutantes e selvagens para um por cento do controle. Aqui, foram realizadas análises estatísticas para comparação dos níveis médios de atividade entre os grupos.

2. Análise de atividade locomotor worm em mídia líquida em formato de placa de 96 poços pela análise de software WormScan

  1. Crescimento e manuseio de nematoides
    1. Cresça C. elegans como descrito na seção 1.1.1.
    2. Sincronizar worms conforme descrito na seção 1.1.2.
    3. Cresça vermes em mídia específica, conforme descrito na seção 1.1.3 até o estágio L4 ou dia 1 adulto.
  2. Configuração experimental de worms em placa de 96 poços para análise de atividade wormScan
    1. Adicione 50 μL de peso de 2% por volume de E. coli OP50 em suspensão líquida em S. médio basal para cada poço de um 96-well, claro, fundo plano, microplaca, como descrito anteriormente49,53.
    2. Sob um estereótipo, escolha manualmente 15 worms sincronizados no estágio L4 ou no 1º dia de suas placas NGM em mídia líquida dentro de cada poço experimental da microplaca de 96 poços. Deixe que os worms se aclimatem à mídia líquida por 20 minutos antes de digitalizar.
      NOTA: Outras etapas e idades dos animais podem ser prontamente substituídas pelo estudo.
  3. Análise de atividade wormScan em placa de 96 poços e exportação de dados para planilha.
    1. Escaneie cada 96-bem, claro, fundo plano, microplaque duas vezes sequencialmente usando um scanner padrão, com menos de 10 s entre as varreduras.
      NOTA: Aqui, o scanner fotográfico com resolução de 1.200 pontos/in e escala de cinza de 16 bits foi usado para produzir imagens jpeg. O tempo necessário para digitalizar quatro placas de 96 poços usando o scanner fotográfico é inferior a 10 minutos.
    2. Alinhe as duas varreduras sequenciais(Figura 2A) utilizando o software de código aberto49.
      NOTA: O software gera uma imagem de diferença para avaliar as alterações de pixel entre as duas imagens sequenciais para uma região de interesse (Figura 2B) e um wormscan scorerelativo . Este WormScan Score equivale a alterações na resposta locomotor com base na intensidade de luz produzida pelo scanner quando definido como um limiar de pixel de 5 (Figura 2C).
    3. Exporte os dados do WormScan como uma planilha. Salve a planilha contendo os dados para o computador local. Normalize os dados como porcentagem de controle (POC) e compare entre experimentos de replicação biológica para diversas condições mutantes ou de tratamento. Realizar análises estatísticas para comparar mutantes e controle significa usar o teste testudantil.

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Representative Results

A análise da atividade locomotor de C. elegans na mídia líquida poderia facilmente capturar um fenótipo integrado de modelos de vermes de doença mitocondrial que podem não ser facilmente quantificáveis em mídia sólida. O ZebraLab foi usado para quantificar a atividade locomotor do complexo mitocondrial bem estabelecido I doença gas-1(fc21) cepa relativa aos WTworms em mídia líquida no estágio larval L4. A atividade de 5 vermes em uma única gota líquida foi registrada ao longo de 1 min, com um total de 19 vídeos (réplicas técnicas) registrados para cada cepa, resultando na análise total de 95 vermes por cepa. Quatro experimentos de replicação biológica foram obtidos por cepa. A atividade do worm é exibida como mudança de pixel(Figura 3A),e como porcentagem de controle (POC) quando normalizada para o controle WT de N2 Bristol(Figura 3B). Os worms gas-1(fc21)(62% ± variação de 16% de pixels, média ± SD, n = 19) apresentaram uma redução significativa de 38% (p < 0,001, t-teste) em sua atividade locomotor em estágio L4 em comparação com vermes WT (100% ± 11,35%, média ± SD, n = 95 worms por condição em 19 réplicas técnicas sobre 4 réplicas biológicas).

A análise wormScan também foi realizada para quantificar a atividade locomotor de maçarica l4 estágio gas-1(fc21) e worms WT em mídia líquida. Os dados foram coletados para três experimentos de replicação biológica, onde cada placa de replicação biológica foi avaliada por duas imagens sequenciais digitalizadas por meio de um scanner padrão. A atividade do worm das imagens diferenciais foi comparada com a mudança de pixel e normalizada ao controle simultâneo N2 Bristol WT. Da mesma forma, como foi visto pelo método de triagem de comportamento zebrafish, a análise baseada em WormScan demonstrou que os vermes gas-1(fc21) (65,9 ± 6.1, média ± SD, n = 13 poços) apresentaram redução significativa na atividade locomotor em 34% (p < 0,001, t-teste) em comparação com n2 Bristol wild-type worms (100% ± 4,8%, média ± SEM, n = 12 poços) (Figura 3C). Análise usando WormScan no dia 1 vermes adultos gas-1(fc21) worms (50,1% ± 10,7%, média ± SD, n = 7 poços) demonstrou queda na atividade locomotor em 49% (p < 0,001, t-teste) em comparação com vermes WT (100% ± 16,2%, média ± SD, n = 6 poços) (Figura 3D).

Tabela 1: Visão geral comparativa dos ensaios experimentais disponíveis para avaliar a atividade neuromuscular de C. elegans. Uma visão geral detalhada é fornecida de uma ampla gama de 16 técnicas experimentais diferentes que podem ser usadas para quantificar a atividade neuromuscular de vermes nos resultados fenotípicos de espancamento, locomoção, bombeamento faríndico e/ou quimiutáxi em C. elegans. O formato de leitura, a metodologia, a capacidade experimental de throughput, os requisitos de software e/ou equipamentos, bem como as vantagens e limitações de cada ensaio são detalhadas. Também são fornecidas referências e sites relevantes para cada ferramenta de ensaio e software. A capacidade de rendimento de cada ensaio é descrita como baixa, média ou alta, com base na complexidade experimental, no uso de placas únicas ou multi-bem e/ou tempo experimentador necessário para completar a configuração experimental e análises de dados. * Indica que as metodologias também podem ser utilizadas para avaliação da locomoção. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Figure 1
Figura 1: C. elegans locomotor análise de atividade usando o software ZebraLab. (A,B) Protocolo experimental para gravações de vídeo de vermes. Cinco worms foram introduzidos por gota (20 μL) de solução basal S., com quatro gotas colocadas em um único slide de vidro sob um estereoscópio. Cada gota de 5 worms representou um experimento de replicação técnica e foi gravada por 1 min em um filme separado usando uma câmera de dispositivo acoplado a carregada (CCD). (C-F) Configurações experimentais no ZebraLab adaptadas à avaliação da atividade locomotor em C. elegans. (C) Seleção de Quantização com arquivos AVI para quantificar a atividade locomotor de worm de cada vídeo gravado. (D) Configurações do parâmetro do protocolo, com 1 min selecionados como duração do experimento. (E) Construir área para selecionar a área de interesse. A área foi selecionada e construída em torno de 1 gota de solução na qual foram colocados 5 vermes. (F) A detecção foi determinada com base no limiar em escala cinza para detectar todo o corpo de cada verme (vermelho). Na seção limiar, foram selecionados valores de estouro e congelamento para analisar a atividade do worm à medida que os pixels mudam. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: C. elegans locomotor análise de atividade usando a metodologia WormScan. (A) Utilizando um scanner de cama epson v800, duas varreduras imediatamente sequenciais de uma placa de 96 poços foram capturadas com uma resolução de 1.200 pontos/in e 16 bits de escala de cinza para produzir imagens jpeg. (B) Estas duas imagens sequenciais de uma placa de 96 poços foram então alinhadas a uma região de referência de interesse (ROI), de vermes WT. (C) A análise da imagem baseia-se em um escore de imagem de diferença calculado para cada ROI com 15 worms/well para N2 Bristol. A imagem de diferença foi normalizada e relatada como percentual de controle (POC). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura3 : Análise comparativa da atividade locomotor por zebralab e software WormScan ensaios em gas-1(fc21) mitocondrial disease worms relativos a N2 Bristol wild-type worms. (A,B) WT e gas-1(fc21) atividade de vermes em gotas líquidas (5 worms/drop) foi gravado por 1 min e quantificado como(A)pixels mudam ou ( B ) pixels mudam ou (B ) ) porcentagem de controle de tipo selvagem usando o software ZebraLab. No geral, a análise de atividade de vermes baseada em ZebraLab demonstrou uma redução significativa de 38% nos worms de estágio L4 a gás -1(fc21) em comparação com controles do tipo selvagem (*** p < 0,001). O gráfico exibe ± SD de todos os dados, onde cada ponto transmite a atividade global de cinco worms por gota basal S.. Cada gota representa uma replicação técnica, com um total de quatro réplicas biológicas estudadas por condição. Um total de 19 vídeos foram gravados (um vídeo para cada gota de 5 vermes), em um total de 95 vermes individuais estudados por condição. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste tdo aluno no Prisma -GraphPad v6. (C) Os worms WT e gas-1(fc21)na fase L4 foram analisados por escaneamento plano para produzir duas imagens sequenciais que foram analisadas no software WormScan para produzir uma imagem de diferença. Três experimentos de replicação biológica foram realizados com 15 vermes por poço em uma placa de 96 poços. A atividade dos worms WT foi utilizada como linha de base para normalizar a porcentagem de controle (POC). a atividade gas-1(fc21) diminuiu 34% em relação ao controle do tipo selvagem (*** p < 0,001). Os gráficos de barras transmitem desvios médios e padrão em três experimentos de replicação biológica. (D) N2 e gas-1(fc21)worms no estágio do dia adulto 1 foram analisados de forma semelhante como detalhado para a atividade do painel C. gas-1(fc21) no dia 1 adultos foi reduzido em 49,1% em relação aos vermes de controle do tipo selvagem (*** p < 0,001). Os gráficos de barras transmitem mudanças médias e padrão de pixels em uma réplica biológica comparando N2 (n = 6 poços de 15 worms/well) e gas-1(fc21) (n = 7 poços de 15 vermes/bem). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui, o estudo resumiu informações detalhadas e razões para o estudo da atividade neuromuscular C. elegans ao nível de desfechos diversos, incluindo espancamento de vermes, locomoção, bombeamento faríndico e quimitaxis. A comparação de 16 diferentes metodologias de análise de atividade foi realizada em termos de rendimento relativo, vantagens e limitações de atividades de nematoide quantificadas em populações de vermes ou vermes em diferentes idades e durações experimentais. Entre elas, duas novas adaptações e aplicações de análises semiautomá-automatizadas foram destacadas para demonstrar redução significativa da atividade locomotor em vermes em estágio larval no estágio de desenvolvimento larval L4 e no primeiro dia jovens adultos de um complexo mitocondrial bem estabelecido I doença C. elegans cepa, gás-1(fc21) em relação aos controles WT.

Em particular, a função neuromuscular C. elegans e a atividade locomotor tem sido extensivamente estudada em mídia sólida, uma vez que o movimento do verme WT é muito regular em padrões de ondas sinusoidais. Anormalidades de seu caminho de movimento regular e da velocidade podem ser detectadas microscopicamente e pontuadas manualmente pelo observador experimental, em ensaios que muitas vezes são de baixa produtividade e tediosos. Para aumentar o throughput experimental, devem ser selecionados métodos automatizados e de alto rendimento. A atividade prejudicada de worms pode ser quantificável em mídia líquida, onde a atividade locomotor global de worms em gotículas em lâminas de vidro ou em placas multi-poços pode ser gravada em vídeo e quantificada de forma semi-automatizada ou automatizada com diferentes ferramentas de software. De fato, nossos dados destacam a utilidade de medir objetiva e eficientemente a atividade locomotor de nematode tanto por uma nova aplicação do software ZebraLab para quantificar a atividade locomotor em vídeos de worms em gotas líquidas em lâminas de vidro (uma abordagem de capacidade de triagem de throughput médio), bem como utilizando o software WormScan para quantificar a atividade locomotor de worms em imagens de digitalização diferencial de worms em umaabordagemde mídia líquida de placa de 96 bem 55,56 (abordagem de capacidade de triagem de alto rendimento). A abordagem do software ZebraLab é considerada como um ensaio de rendimento médio, uma vez que exige que placas únicas sejam usadas para cada condição estudada, sem protocolo desenvolvido a corrente para formatos de placas multi-poço. Embora o uso da abordagem do software ZebraLab exija um tempo mínimo ao analisar a atividade de C. elegans em poucas condições, o tempo experimental aumenta quando aplicado a múltiplas condições. Aqui, o tempo experimental foi de aproximadamente 2h para transferir vermes em gotículas líquidas e gravar vídeos de sua atividade, considerando 18 réplicas técnicas para cada condição. O tempo gasto para a análise desses vídeos usando o software ZebraLab foi de aproximadamente 1 h. Em comparação, o método WormScan é de alto rendimento porque incorpora um formato de placa multi-poço que permite a análise simultânea de quatro placas de 96 poços em menos de 10 min e a configuração de uma placa de 96 poços com um BISoter COPAS também é inferior a 10 min.

Ambas as metodologias mostraram uma atividade igualmente reduzida no estágio larval L4 gas-1(fc21) vermes mutantes da doença mitocondrial em relação aos vermes WT, validando assim ambas as abordagens distintas para quantificar diferenças no comportamento dos vermes. Além disso, a análise do WormScan foi utilizada para demonstrar prontamente que a redução progressiva da atividade locomotor animal ocorreu com a idade nos vermes gas-1(fc21),como ficou evidente no estágio adulto do primeiro dia.

As principais vantagens de adaptar o software ZebraLab que foi desenvolvido para análise de natação de zebrafish para análise de atividade de C. elegans é que é experimentalmente simples e barato capturar objetivamente o movimento de worms em vídeos, com análise quantitativa semi-automatizada em arquivos de filmes carregados para o software ZebraLab exigindo apenas segundos por replicação técnica e remove viés baseado em investigadores que está presente em metodologias manuais de quantitação. Além disso, ter esta ferramenta de software no laboratório de pesquisa é útil para quantificar a atividade locomotor em duas espécies modelo animal, ou seja, zebrafish e C. elegans. A desvantagem é que este é um software comercial que requer compra e vídeos de worm precisam ser carregados manualmente no software, embora o processo de upload seja simples e o tempo de análise do software seja relativamente rápido. No geral, o novo aplicativo descrito aqui do uso do software ZebraLab para quantificar a atividade locomotor C. elegans tem potencial direto para avaliar os efeitos de drogas no comportamento dos vermes, embora seu rendimento permaneça de baixa a média, dado que seus requisitos de alta resolução exigem que filmes sejam capturados de worms movendo-se em gotas de mídia colocadas em slides de vidro.

Também adaptamos o software WormScan para quantificar eficientemente a capacidade locomotor de worms em mídia líquida em uma placa de 96 poços. Esta abordagem oferece um método experimental de alto rendimento e baixo custo que usa um scanner padrão para quantificar objetivamente a fecundidade e a sobrevivência animal e já foi usado para telas de alto rendimento em C. elegans49. As principais vantagens dessa técnica são que ela é muito favorável à triagem de alto rendimento, permitindo comparações paralelas de um grande número de condições em qualquer estágio ou idade, com facilidade de uso, baixo custo de configuração e análise rápida de forma objetiva pelo software WormScan que é gratuito e disponível publicamente49. A desvantagem do WormScan é que ele só pode interrogar a mudança que ocorre entre os exames sequenciais, que em algumas mutações ou condições podem não ser suficientemente sensíveis para detectar pequenos graus de mudança fenotípica. Além disso, como tanto os métodos zebralab quanto wormscan dependem exclusivamente de alterações de pixel de imagem para avaliar a atividade animal, diferenças substanciais no tamanho do verme que podem ocorrer entre cepas ou em resposta a uma terapia específica ao longo do tempo podem precisar ser consideradas e/ou usadas como fator de normalização para ambos os métodos, para permitir mais especificamente a avaliação e comparação de efeitos de mutação e/ou tratamento sobre a atividade locomotor animal.

No geral, uma ampla gama de métodos experimentais pode ser usado para avaliar a atividade neuromuscular nematoide em desfechos fenotípicos integrados de espancamento, locomoção, bombeamento farínngeal e/ou quimitaxis. Comparamos 16 desses métodos (Tabela 1),destacando seus requisitos experimentais e analíticos específicos, vantagens, limitações e capacidade de throughput. Entre estes, fornecemos protocolos experimentais detalhados para duas novas aplicações de ferramentas de software existentes, ZebraLab (uma abordagem de meio-rendimento) e WormScan (uma abordagem de alto rendimento), que são particularmente úteis para quantificar a atividade de locomoção de vermes semiautomática, objetiva e rapidamente em mídia líquida. Ambas as abordagens experimentais revelaram um grau de locomoção igualmente reduzido ocorrido na doença mitocondrial (gas-1(fc21)) em relação às cepas WT C. elegans na fase L4, com declínio progressivo na atividade locomotor pelo estágio adulto jovem em vermes gas-1(fc21). Esses dados demonstram a validade dessas abordagens experimentais que produzem dados internamente consistentes. Além disso, este conjunto de métodos é altamente versátil, permitindo uma ampla gama de métricas de atividade locomotor de vermes em diversas etiologias de doenças, estágios e idades animais, e em resposta à modelagem terapêutica ou telas de medicamentos de alto rendimento que são úteis para avaliação pré-clínica de alvos principais para doenças humanas.

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Disclosures

M.L., N.D.M., N.S., e E.N.-O. não têm divulgações financeiras relevantes. M.J.F. é co-fundador da MitoCUREia, Inc., membro do conselho consultivo científico com participação acionária na RiboNova, Inc., e membro do conselho científico como consultora paga da Khondrion, e larimar Therapeutics. M.J.F. já foi ou está atualmente envolvido com várias empresas envolvidas no desenvolvimento terapêutico de doenças mitocondriais pré-clínicas e/ou estágio clínico como consultor pago (Astellas [ex-Mitobridge] Pharma Inc., Cyclerion Therapeutics, Epirium Bio, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics, NeuroVive, Reneo Therapeutics, Stealth BioTherapeutics, Zogenix, Inc.) e/ou um colaborador de pesquisa patrocinado (AADI Therapeutics, Cardero Therapeutics, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics Inc., Mission Therapeutics, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics e Stealth BioTherapeutics).

Acknowledgments

Somos gratos a Anthony Rosner, PhD., com seu apoio organizacional para a preparação antecipada deste projeto, e a Erin Haus por contribuir para a análise do protocolo. Este trabalho foi financiado pelo Juliet's Cure FBXL4 Mitochondrial Disease Research Fund, o Jaxson Flynt C12ORF65 Research Fund e os Institutos Nacionais de Saúde (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 e T32-NS007413). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos financiadores ou dos Institutos Nacionais de Saúde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

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Comportamento Problema 170 worms C. elegans,atividade locomotor bombeamento faríneal quimotáxi thrashing ZebraLab WormScan capacidade de triagem de alto rendimento gás-1(fc21)
Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em <em>Caenorhabditis elegans Modelos</em> de Doença Mitocondrial
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Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah,… More

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).

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