Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Jämförande analys av experimentella metoder för att kvantifiera djuraktivitet i Caenorhabditis elegans Modeller av mitokondriell sjukdom

Published: April 4, 2021 doi: 10.3791/62244
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics, The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Denna studie presenterar protokoll för två halvautomatiska lokomotoriska aktivitetsanalysmetoder i C. elegans komplexa I sjukdom gas-1(fc21)maskar, nämligen ZebraLab (en medium-throughput analys) och WormScan (en hög genomströmningsanalys) och ge jämförande analys bland ett brett utbud av forskningsmetoder för att kvantifiera nematod beteende och integrerad neuromuskulär funktion.

Abstract

Caenorhabditis elegans är allmänt erkänd för sitt centrala verktyg som en translationell djurmodell för att effektivt förhöra mekanismer och terapier av olika mänskliga sjukdomar. Maskar är särskilt väl lämpade för genetiska och läkemedelsskärmar med hög genomströmning för att få djupare inblick i terapeutiska mål och terapier genom att utnyttja sin snabba utvecklingscykel, stora kullstorlek, korta livslängd, mikroskopisk transparens, låga underhållskostnader, robust svit av genomiska verktyg, mutanta databaser och experimentella metoder för att förhöra både in vivo- och ex vivo-fysiologi. Mask locomotor verksamhet representerar en särskilt relevant fenotyp som ofta försämras i mitokondriell sjukdom, som är mycket heterogen i orsaker och manifestationer men kollektivt delar en nedsatt kapacitet att producera cellulär energi. Medan en svit av olika metoder kan användas för att förhöra maskbeteende, varierar dessa kraftigt i experimentella kostnader, komplexitet och nytta för genomiska eller droghöggenomströmningsskärmar. Här jämfördes den relativa genomströmningen, fördelarna och begränsningarna för 16 olika aktivitetsanalysmetoder som kvantifierar nematodrörelse, thrashing, faryngala pumpning och/ eller kemotaxis i enstaka maskar eller maskpopulationer av C. elegans i olika stadier, åldrar och experimentella varaktigheter. Detaljerade protokoll demonstrerades för två halvautomatiska metoder för att kvantifiera nematod lokomotorisk aktivitet som representerar nya tillämpningar av tillgängliga programvaruverktyg, nämligen ZebraLab (en medelgenomströmningsmetod) och WormScan (en metod med hög genomströmning). Data från tillämpningen av dessa metoder visade liknande grader av minskad djuraktivitet inträffade i L4 larvstadiet och utvecklats i dag 1 vuxna, i mitokondriellt komplexa Isjukdom (gas-1(fc21)mutantmaskar i förhållande till vilda -typ (N2 Bristol) C. elegans. Dessa data validerar verktyget för dessa nya applikationer av att använda ZebraLab eller WormScan mjukvaruverktyg för att kvantifiera mask lokomotorisk aktivitet effektivt och objektivt, med varierande kapacitet att stödja hög genomströmning drog screening på mask beteende i prekliniska djur modeller av mitokondriell sjukdom.

Introduction

Caenorhabiditis elegans är allmänt erkänd som en enastående modell inom neurovetenskap baserat på att den har 302 nervceller som samordnar alla maskbeteenden, inklusive parning, utfodring, äggläggning, avföring, simning och rörelse på fasta medier1. Dessa hermafrodiska nematoder används också i stor utsträckning för att förstå ett brett spektrum av mänskliga sjukdomsmekanismer, som möjliggjordes av dess väl karakteriserade genom och höga homologi av ~ 80% gener mellan C. elegans och människor2,3,4. C. elegans har länge använts för att förhöra mänskliga mitokondriell sjukdom5,6,7,8,9,10, som är en mycket genetiskt och fenotypiskt heterogen grupp av ärftliga metabola störningar som delar nedsatt kapacitet att generera cellulär energi och ofta kliniskt närvarande med väsentligt nedsatt neuromuskulär funktion, träningsintolerans och trötthet11 ,12,13,14. I detta syfte möjliggör användningen av C. elegans-modeller preklinisk modellering av kvantitativa aspekter av djuraktivitet och neuromuskulär funktion i olika genetiska subtyper av mitokondriell sjukdom, liksom deras svar på kandidatterapier som kan förbättra deras neuromuskulära funktion och övergripande aktivitet.

Neuromuskulär aktivitet i C. elegans är objektivt mätbar med en rad experimentella metoder, inklusive både manuella och halvautomatiska metoder som möjliggör funktionella analyser i antingen fasta eller flytande medier(tabell 1)1,15. Korrekt kvantifiering av C. elegans aktivitet har visat sig viktigt för att möjliggöra upptäckter relaterade till funktion och utveckling av muskel- och nervsystemet16,17,18. Denna studie sammanfattar och jämför experimentella krav, fördelar och begränsningar av 17 olika analyser som kan utföras i forskningslaboratorier för att utvärdera neuromuskulär funktion och aktivitet på fyra viktiga resultat i C. elegans-sjukdomar modeller, både vid baslinjen i en rad utvecklingsstadier och åldrar samt som svar på kandidatterapier (Tabell 1 ). Studien ger en detaljerad översikt över utbudet av tillgängliga experimentella metoder för att karakterisera frekvensen av C. elegans thrashing (kroppsböjningar per minut), lokomotorisk aktivitet, faryngala pumpning och kemotaxis-i varje enskilt fall som anger den experimentella och analytiska metodik som används, fördelarna och begränsningarna för varje metod, den utrustning och programvara som behövs för att utföra och analysera varje analys, och genomströmningskapaciteten för varje metod för att stödja dess användning för genetiska screening- eller läkemedelsscreeningsändamål med hög genomströmning. Genomströmningskapaciteten för varje analys beskrivs som låg, medelhög eller hög baserat på experimentprotokollets komplexitet, inklusive maskunderhåll, bearbetningstid, användning av en- eller flerbrunnsplattor och/eller experimenterande tid som behövs för att slutföra den experimentella inställningen och dataanalyserna.

Manuella analyser av thrashing19,lokomotoriskaktivitet 20,faryngala pumpning17,21, och kemotaxis22,23 är väletablerade metoder för att utvärdera maskaktivitet som kräver ett stereomikroskop24. Vid mätning av maskarnas slagaktivitet krävs analys i flytande media för att bestämma frekvensen av kroppsböjningar per minut, men masklokomotorisk aktivitet kan mätas antingen på fast media eller i flytande media. Manuella analyser av individuell maskaktivitet är dock i sig tidskrävande och innebär oundviklig användargenererad partiskhet. Automatisering av maskaktivitetsanalyser minimerar användargenererad partiskhet och kan kraftigt öka experimentellt dataflöde25. Videoinspelningar av mask thrashing aktivitet i flytande media kan analyseras med wrMTrck, en ImageJ plugin26. De ursprungliga experimentella inställningarna som utvecklades för wrMTrck begränsade dock dess användbarhet, eftersom för många maskar i en enda vätskedroppe ledde till överlappning av maskar som gjorde noggrann spårning svår. Medan denna experimentella begränsning harlösts 27, kan wrMTrck-metoden inte stödja screening med hög genomströmning.

Det finns en rad metoder för att kvantifiera mask lokomotorisk aktivitet vid baslinjen och som svar på kandidatbehandlingar i C. elegans mitokondriella sjukdomsmodeller. Dessa inkluderar ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28,wide field-of-view nematodspårningsplattform (WF-NTP)29,WormMotel, WormWatcher30,WormLab31,Infinity Chip32och WMicrotracker One33 (Tabell 1). Dessa metoder möjliggör samtidig analys av rörelse i flera maskstammar eller förhållanden, vanligtvis på multi-well plattor, vilket stöder högre genomströmning drog screening applikationer. Vissa av dessa metoder har unika överväganden som kan begränsa eller förbättra deras allmänna nytta, till exempel behovet av dyr utrustning kontra programvara med öppen åtkomst och varierande enkel att utföra experimentella protokoll. Sammantaget är inget enda experimentellt system eller protokoll idealiskt lämpat för alla C. elegans lokomotoriska aktivitetsexperiment. Det är snarare viktigt att noggrant välja vilken metod som är bäst lämpad för den specifika prövarens experimentella mål och krav.

Faryngala pumpning representerar ett annat viktigt resultat för att bedöma neuromuskulär aktivitet i C. elegans. C. elegans pharynx består av 20 muskelceller, 20 nervceller och 20 andra celler som möjliggör intag av Escherichia coli (E. coli) i den främre änden av maskens matsmältningsorgan34,35,36. Flera manuella metoder har fastställts för att bestämma faryngala pumphastigheter17,21,37,38. De flesta metoder är baserade på användningen av ett stereomikroskop och kamera för att visualisera och registrera faryngala pumpfrekvens med direkträkning av den experimentella observatören21. Automatiserad analys av faryngala pumphastigheter är möjlig genom att utföra ett extracellulärt registreringsbelagt elektrofarmageogram (EPG), som ger ytterligare information om varaktigheten för varje pump39. Faryngala pumphastighet analys är också möjligt i ett mikrofluidiskt system, WormSpa, där enskilda maskar är instängda ikamrarna 40,41. En kommersiell metod som finns tillgänglig för att underlätta analys av faryngala pumphastigheten är ScreenChip System (InVivo Biosystems), som mäter, visualiserar och analyserar de neuromuskulära aspekterna av utfodringsbeteende i en enda mask som immobiliseras i ett anpassat chip. Denna faryngala pumpande kvantifieringsmetod kan användas för att bedöma både neuronala och fysiologiska svar på droger, åldrande och andrafaktorer 42,43,44,45.

Chemotaxis beskriver rörelsen av C. elegans som svar på en lukt som placeras bort från maskarna i ett definierat område av nematod tillväxt media (NGM) plattan. Bedömning av kemotaxis svar ger ett integrerat mått på mask neuronal och neuromuskulär aktivitet som är kvantifierbar genom att observera och mäta den fysiska sträckan som rör sig av maskar mot lukten under en definierad tidsperiod46. Multi-Worm Tracker är en automatisk metod som kan användas för att förbättra den experimentella effektiviteten att kvantifiera avståndet som rör sig av maskar mot ett lockande medel eller från en avstötande47.

Här beskrivs det detaljerade protokollet för två nya, halvautomatiska metoder som fastställts för kvantifiering av maskaktivitet. Det första tillvägagångssättet använder ZebraLab en kommersiell programvara som ursprungligen utvecklades för att studera simaktivitet hos Danio rerio (zebrafisk), för en ny medelgenomströmningsapplikation för att kvantifiera övergripande lokomotorisk aktivitet i flytande media av C. elegans baserat på pixelförändringar under rörelse ( Tabell1, figur 1). Datautgång erhålls snabbt från ett stort antal samtidiga förhållanden och prover som analyseras på en glasbild, även om denna metod inte är lämplig för ett multi-well-plattformat. Det andra tillvägagångssättet är en ny anpassning av WormScan-metoden48,49 ( Figur2), som använder en flatbäddsskanner för att skapa en differentialbild av två sekventiella skanningar som variabilt kan användas med programvara med öppen källkod för att möjliggöra halvautomatisk kvantitativ analys av integrerade fysiologiska resultat som fecundity och överlevnad. Här utvecklades en ny filmatisering av WormScan-metoden för att kvantifiera mask lokomotorisk aktivitet i flytande media i populationer av femton larvsteg 4 (L4) maskar per brunn av en 96-brunns platt bottenplatta. Denna halvautomatiska och billiga WormScan-metodik kan enkelt anpassas till höggenomströmningsdrogskärmar, liksom till analyser av olika djurstadier ochåldrar 48,49.

Här demonstreras protokollet och effekten av att analysera C. elegans lokomotorisk aktivitet med både ZebraLab och WormScan halvautomatiska metoder i en väletablerad C. elegans modell för mitokondriell komplex I sjukdom, gas-1(fc21). gas-1 (genen K09A9.5) är en ortolog av human NDUFS2 (NADH: ubiquinone oxidoreductase core (järn-svavelprotein) underavdelning 2) (Figur 3). C. elegans gas-1(fc21) mutant stam bär en homozygous p.R290K missense mutation i den mänskliga orthologen av NDUFS250, orsakar betydligt minskad fecundity och livslängd, nedsatt andningskedja oxidativ fosforylering (OXPHOS)kapacitet 51, samt minskad mitokondriell massa och membran potential med ökad oxidativ stress5,8 . Trots dess väletablerade användning under de senaste två decennierna för att studera mitokondriell sjukdom, rapporterades inte lokomotorisk aktivitet av gas-1(fc21)mutanter tidigare. Här tillämpades ZebraLab- och WormScan-metoder för att självständigt kvantifiera den lokomotoriska aktiviteten hos gas-1(fc21) jämfört med vilda maskar (WT, N2 Bristol), både som ett sätt att validera metoderna samt för att visa deras jämförande nytta och effektivitet hos experimentella protokoll och informatikanalyser. ZebraLab programvara tillät snabb kvantifiering av flera samtidiga villkor för mask locomotor verksamhet i C. elegans mitokondriell sjukdom modeller, med potentiell tillämpning för riktade drog screening eller validering studier. WormScan analys, i synnerhet, är väl lämpad för att lätt möjliggöra hög genomströmning drog skärmar av sammansatta bibliotek och prioritera leads som förbättrar djuret neuromuskulär funktion och den lokomotoriska aktiviteten i prekliniska C. elegans modeller av primära mitokondriell sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Worm locomotor aktivitetsanalys i flytande media på glasbilder med ZebraLab programvara

  1. Nematodtillväxt och hantering
    1. Odla C. elegans på Petri tallrikar som innehåller nematod tillväxt media (NGM) och spridas med Escherichia coli OP50 som matkälla. Behåll maskkulturen vid 20 °C, som tidigarebeskrivits 8.
    2. Synkronisera maskar som utför ett tidsandetägg låg 52 och studerar maskar i önskat skede. I detta protokoll analyserades L4 steg maskar.
    3. Öka kontrollen och mutanta maskstammar på NGM-plattor med och utan läkemedelsbehandlingar som ska testas eller buffertkontroll. För att utvärdera läkemedelsbehandlingseffekterna, förbered önskad läkemedelslagerkoncentration i S. basal lösning; sprida den beräknade specifika volymen på NGM-plattorna och låta den torka. Överför maskarna i ett specifikt larv- eller vuxenstadium och behåll på läkemedelsbehandlingsplattan under önskad tid före analys.
  2. Experimentell uppsättning maskar för videoinspelning av lokomotorisk aktivitet och ZebraLab-analys
    1. Välj 5 synkroniserade L4-maskar per stam och tillstånd med hjälp av en maskplockning. Pipett en enda 20 μL droppe S. basal lösning på en glasbild placerad under ett stereomikroskop ansluten till en kamera och överföra 5 maskar till den (Figur 1A,B). Överför de 5 maskarna från Petri-skålen som innehåller NGM och E. coli OP50 till vätskedroppe endast vid det ögonblick som föregår inspelningen.
      OBS: Fortsätt att underhålla de andra maskarna på Petri-skålen tills den tidigare videon spelas in. Detta kommer att undvika skador som orsakas på de andra maskarna på grund av torkning av 20 μl droppar under proceduren (torrtid ~ 15-20 min).
    2. Pipett flera droppar på en bild för att erhålla flera tekniska replikat (Figur 1A). Välj maskar från olika NGM-plattor (biologisk replikat). Använd inte täcksedeln.
    3. Justera mikroskopets arbetsavstånd för att visualisera hela området för en enda droppe. Ställ in och underhåll en låg videoupplösning (<1024 x 768) för att ladda upp filerna i programvaran.
    4. Låt maskar acklimatisera sig på bilden vid rumstemperatur i 1 minut före inspelning.
    5. Spela in masksimaktiviteten i 1 droppe i 1 min med 15 bilder per sekund (fps). Upprepa avbildningen för varje ytterligare droppe på plattan.
  3. C. elegans locomotor aktivitet inspelning analys i ZebraLab programvara
    1. Använd alternativet ZEBRALAB AVI för att ladda upp videor till programvaran. Klicka på alternativet Kvantisering med AVI Files (Bild 1C).
    2. Om du vill skapa ett nytt protokoll väljer > skapa protokolloch lägger sedan till antalet områden som valts för analysen. Välj Platsantal: 1.
    3. Öppna Protokollparametrar och välj 1 minut i fönstret Experimentvaraktighet. Välj en annan experimentell varaktighet för olika experimentella varaktigheter. Markera eller avmarkera fönstret Ingen tidslagerplats och välj Integrationsperiod, beroende på önskat datautflöde. I denna studie valdes Ingen tidsfack (figur 1D).
      Obs: Tidslagerplats är den tid under vilken aktiviteten kommer att vara genomsnittlig.
    4. Om ett protokoll redan har skapats väljer du Öppna protokoll och väljer det sparade protokollet (i .vte-format).
    5. Välj Arkiv och Öppna en film för att ladda upp varje enskild videofil som tidigare spelats in.
    6. Välj den områdesikon som anges i figur 1E (svart pil) för att skapa ett enda detekteringsområde och skapa ett område runt hela vätskefallet där maskar finns. Klicka på Väljoch sedan på den gröna cirkelikonen (grå pil) under Områden > Build > Clear marks.
      OBS: Aktiviteten hos alla maskar i den definierade droppen kommer att upptäckas i det valda området (Figur 1E, F).
    7. Gå till Kalibrering > Rita skala (Bild 1E) och rita en vågrät linje från vänster till höger om videoområdet. Ange det verkliga avståndet för kalibrering. Välj sedan Använd på grupp.
    8. Avmarkera den valda ikonen för att bygga området (pilen i bild 1E)och markera eller avmarkera Genomskinlig.
      OBS: I denna studie valdes Transparent och gav bättre resultat.
    9. Justera detekteringskänslighet och aktivitetströskel för att tillåta detektering av alla olika C. elegans maskstammar som analyseras.
      OBS: I detta experiment fastställdes detektionskänsligheten till 8 med burst- och frysvärden på 15 respektive 2 (figur 1F).
    10. Ställ in Display Scale på 70 för att visualisera djurets spår medan aktivitetsanalys pågår. Välj sedan Använd på grupp ( bild1F).
    11. Klicka på Experiment > Kör > Spara somoch sedan på Start. Ett fönster öppnas. Välj Vill du bearbeta videomediet med maximal datorhastighet? för att analysera videon snabbt (t.ex. analyseras en 1 min videoinspelning av programvaran i ZebraLab i 5 s).
    12. Ett annat fönster öppnas: Kör experiment; klicka på Börja för att fortsätta med experimentet.
    13. När videoinspelningen är klar stoppas analysen. Klicka på Experiment > Stop. Detta sparar aktiviteten som analyseras från en enda droppe i ett kalkylblad.
    14. Upprepa analysen för varje video av individuell droppe. Varje droppe är en teknisk replikat.
  4. Utdata och analys av ZebraLab-data
    Efter experimentet sparas data från varje video individuellt som separata kalkylblad i den valda mappen. I datautdatafilen registreras den integrerade aktivitetsnivån för alla maskar som rör sig i en enskild droppe när pixeln ändras under actinteg.
    1. Öppna varje kalkylblad som erhålls från analysen av varje video. Kompilera dem manuellt till en enda fil.
      Normalisera mutant- och wild-typdata till en procent av kontrollen. Här utfördes statistiska analyser för att jämföra genomsnittliga aktivitetsnivåer mellan grupper.

2. Worm locomotor aktivitetsanalys i flytande media i 96-brunnsplattaformat av WormScan mjukvaruanalys

  1. Nematodtillväxt och hantering
    1. Grow C. elegans enligt beskrivningen i avsnitt 1.1.1.
    2. Synkronisera maskar enligt beskrivningen i avsnitt 1.1.2.
    3. Odla maskar på specifika medier enligt beskrivningen i avsnitt 1.1.3 till L4 steg eller dag 1 vuxen.
  2. Experimentell uppsättning av maskar i 96-brunnsplatta för WormScan aktivitetsanalys
    1. Tillsätt 50 μL 2% vikt per volym E. coli OP50 i flytande suspension i S. basal medium till varje brunn i en 96-brunn, klar, platt botten, mikroplatta, som tidigarebeskrivits 49,53.
    2. Under ett stereomikroskop väljer du manuellt 15 synkroniserade maskar på L4-stadium eller dag 1 vuxen från sina NGM-plattor till flytande media inom varje experimentell brunn av 96-brunnsmikroplattan. Låt maskarna acklimatisera sig till det flytande mediet i 20 minuter före skanning.
      OBS: Andra djurstadier och åldrar kan lätt ersättas med studier.
  3. WormScan aktivitetsanalys i 96-brunnsplatta och dataexport till kalkylblad.
    1. Skanna varje 96-brunns, klar, platt botten, mikroplatta två gånger sekventiellt med en vanlig flatbäddsskanner, med mindre än 10 s mellan skanningarna.
      OBS: Här användes fotoskannern med upplösningen 1 200 punkter/in och 16-bitars gråskala för att producera jpeg-bilder. Den tid som krävs för att skanna fyra 96-brunnsplattor med hjälp av fotoskannern är mindre än 10 min.
    2. Justera de två sekventiella skanningarna(bild 2A)med hjälp av programvara med öppen källkod49.
      OBS: Programvaran genererar en skillnadsbild för att utvärdera pixelförändringar mellan de två sekventiella bilderna för en intresseregion (figur 2B) och en relativ WormScan Score. Denna WormScan Score motsvarar förändringar i lokomotoriskt svar baserat på den ljusintensitet som skannern har producerat när den är inställd på en pixeltröskel på 5 (figur 2C).
    3. Exportera data från WormScan som ett kalkylblad. Spara kalkylbladet som innehåller data på den lokala datorn. Normalisera data i procent av bekämpning (POC) och jämför över biologiska replikatexperiment för olika mutant- eller behandlingsförhållanden. Utför statistisk analys för att jämföra mutant- och kontrollmedel med hjälp av studentenst-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analys av C. elegans locomotor verksamhet i flytande medier kan lätt fånga en integrerad fenotyp av mitokondriell sjukdom mask modeller som kanske inte är lätt kvantifierbara på fasta medier. ZebraLab användes för att kvantifiera lokomotorisk aktivitet hos den väletablerade mitokondriella komplexa I sjukdom gas-1(fc21)stam i förhållande till WTworms i flytande medier på L4 larvstadiet. Aktiviteten hos 5 maskar i en enda vätskedroppe registrerades över 1 min, med totalt 19 videor (tekniska replikat) registrerade för varje stam, vilket resulterade i totalt analysen av 95 maskar per stam. Fyra biologiska replikat experiment erhölls per stam. Maskaktivitet visas som pixelförändring (bild 3A) och som procent av kontrollen (POC) när den normaliseras till N2 Bristol WT-kontroll (Figur 3B). Gasmaskarna(62% och 62 % ± 16 % pixelbyte, medelvärdet ± SD, n = 19) hade en signifikant minskning på 38% (p < 0,001, t-test) i sin lokomotoriska aktivitet i L4-stadiet jämfört med WT-maskar (100% ± 11,35%, genomsnittlig ± SD, n = 95 maskar per tillstånd i 19 tekniska replikat över 4 biologiska replikat).

WormScan analys utfördes också för att kvantifiera lokomotoriska aktiviteten i L4 steg gas-1(fc21) och WT maskar i flytande medier. Data samlades in för tre biologiska replikat experiment, där varje biologisk replikat platta utvärderades av två sekventiella bilder skannas med hjälp av en standard flatbed scanner. Maskaktiviteten för differentialbilderna jämfördes som pixeländring och normaliserades till samtidig N2 Bristol WT-kontroll. På samma sätt, som sågs av Zebrafish beteende screening metod, WormScan baserade analys visat att gas-1(fc21)maskar (65,9 ± 6,1, genomsnittlig ± SD, n = 13 brunnar) hade en signifikant minskning av lokomotorisk aktivitet med 34% (p < 0,001, t-test)jämfört med N2 Bristol vildmaskar (100% ± 4,8%, medelvärdet ± SEM, n = 12 brunnar) ( Figur3C). Analys med WormScan på dag 1 vuxna gas-1(fc21)maskar (50,1% ± 10,7%, genomsnittlig ± SD, n = 7 brunnar) visade en minskning av lokomotorisk aktivitet med 49% (p < 0,001, t-test)jämfört med WT-maskar (100% ± 16,2%, medelvärdet ± SD, n = 6 brunnar) ( Figur3D).

Tabell 1: Jämförande översikt över experimentella analyser tillgängliga för att utvärdera C. elegans neuromuskulär aktivitet. En detaljerad översikt ges av ett brett utbud av 16 olika experimentella tekniker som kan användas för att kvantifiera mask neuromuskulär aktivitet på fenotypiska resultat av thrashing, locomotion, faryngala pumpning och/eller chemotaxis i C. elegans. Läsformat, metodik, experimentell dataflödeskapacitet, krav på programvara och/eller utrustning samt fördelar och begränsningar för varje analys beskrivs. Referenser och relevanta webbplatser för varje analys- och programvaruverktyg tillhandahålls också. Varje analyss genomströmningskapacitet beskrivs som låg, medelhög eller hög, baserat på den experimentella komplexiteten, användningen av en- eller flerbrunnsplattor och/eller experimenterande tid som behövs för att slutföra den experimentella inställningen och dataanalyserna. * Anger att metoderna också kan användas för utvärdering av rörelse. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Figure 1
Bild 1: C. elegans lokomotorisk aktivitetsanalys med ZebraLab-programvara. A,B) Experimentellt protokoll för maskvideoinspelningar. Fem maskar introducerades per droppe (20 μL) av S. basal lösning, med fyra droppar placerade på en enda glasbild under ett stereomikroskop. Varje droppe av 5 maskar representerade ett tekniskt replikatexperiment och spelades in i 1 minut i en separat film med hjälp av en CCD-kamera (Charged-Coupled Device). (C-F) Experimentella inställningar i ZebraLab anpassade till utvärdering av lokomotorisk aktivitet i C. elegans. (C) Val av kvantisering med AVI-filer för att kvantifiera masklokomotorisk aktivitet för varje inspelad video. (D) Inställningar för protokollparameter, med 1 min vald som experimentvaraktighet. (E) Bygg område för att välja intresseområde. Området valdes och byggdes cirka 1 droppe lösning där 5 maskar placerades. (F) Detektion fastställdes baserat på gråskalans tröskelvärde för att upptäcka hela kroppen av varje mask (röd). I tröskelvärdet valdes burst- och frysningsvärden för att analysera maskaktivitet när pixeln ändras. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Bild 2: C. elegans lokomotorisk aktivitetsanalys med WormScan-metodik. (A) Med hjälp av en Epson v800 flatbäddsskanner fångades två omedelbart sekventiella skanningar av en 96-brunnsplatta med en upplösning på 1 200 punkter/in och 16-bitars gråskala för att producera jpeg-bilder. (B) Dessa två sekventiella bilder av en 96-brunnsplatta justerades sedan till en referensregion av intresse (ROI), av WT-maskar. (C) Bildanalysen baseras på en skillnad bildpoäng beräknad för varje ROI med 15 maskar/brunn för N2 Bristol. Differensbilden normaliserades och rapporterades i procent av kontrollen (POC). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3:Jämförande analys av lokomotorisk aktivitet av ZebraLab och WormScans programvaruanalyser i gas-1(fc21)mitokondriella sjukdomsmaskar i förhållande till N2 Bristol vildmaskar. (A,B) WT och gas-1(fc21) maskaktivitet i flytande droppar (5 maskar / droppe) video inspelad i 1 min och kvantifierad som (A) pixlar förändring eller (B ) ) procentandel av wild-type-kontrollen med ZebraLab-programvaran. Sammantaget visade ZebraLab-baserad maskaktivitetsanalys en signifikant minskning med 38% i gas-1(fc21) L4-stegmaskar jämfört med vilda kontroller (*** p < 0,001). Diagrammet visar genomsnittlig ± SD för alla data, där varje punkt förmedlar den totala aktiviteten för fem maskar per S. basal droppe. Varje droppe representerar en teknisk replikat, med totalt fyra biologiska replikat studerade per tillstånd. Totalt spelades 19 videor in (en video för varje droppe av 5 maskar), över totalt 95 enskilda maskar studerade per tillstånd. Statistisk analys utfördes med hjälp av studenten t-test i Prism -GraphPad v6. (C) WT och gas-1(fc21) maskar på L4-stadiet analyserades genom flatbed skanning för att producera två sekventiella bilder som analyserades i WormScan programvara för att ge en skillnad bild. Tre biologiska replikat experiment utfördes med 15 maskar per brunn i en 96 väl-platta. Aktiviteten hos WT-maskar användes som baslinje för att normalisera procentandelen kontroll (POC). gas-1(fc21)aktiviteten minskade med 34% jämfört med vilda typ kontroll (*** p < 0,001). Stapelgrafer förmedlar medelvärdes- och standardavvikelser över tre biologiska replikatexperiment. (D) N2 och gas-1(fc21)maskar på vuxen dag 1 steg analyserades på samma sätt som detaljerade för panel C. gas-1(fc21) aktivitet i dag 1 vuxna minskades med 49,1% i förhållande till vilda typ kontrollmaskar (*** p < 0,001). Stapelgrafer förmedlar medelvärde och standardavvikelse för pixelförändringar i en biologisk replikat som jämför N2 (n = 6 brunnar med 15 maskar/brunn) och gas-1(fc21) (n = 7 brunnar med 15 maskar/brunn). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här sammanfattade studien detaljerad information och motiveringar för att studera C. elegans neuromuskulär aktivitet på nivån för olika resultat, inklusive mask thrashing, rörelse, faryngala pumpning och chemotaxis. Jämförelsen av 16 olika aktivitet analys metoder utfördes när det gäller relativa genomströmning, fördelar och begränsningar av kvantifiera nematod verksamhet i en enda mask eller mask populationer i olika åldrar och experimentella varaktigheter. Bland dessa lyftes två nya anpassningar och tillämpningar av halvautomatiska analyser fram för att påvisa betydande minskning av lokomotorisk aktivitet i larv-steg maskar på L4 larv utvecklingsstadiet och i dag 1 unga vuxna av en väletablerad mitokondriell komplexa I sjukdom C. elegans stam, gas-1(fc21) i förhållande till WT kontroller.

I synnerhet C. elegans neuromuskulär funktion och lokomotorisk aktivitet har studerats utförligt på fasta medier eftersom WT mask rörelse är mycket regelbunden i sinusoidal våg mönster. Avvikelser i deras reguljära rörelseväg och hastigheten kan mikroskopiskt detekteras och manuellt poängsättas av den experimentella observatören, i analyser som ofta är låggenomströmning och tråkiga. Om du vill öka experimentellt data flöde bör automatiserade metoder och metoder för hög data flöde väljas. Nedsatt aktivitet hos maskar kan kvantifieras i flytande media, där övergripande lokomotorisk aktivitet hos maskar i droppar på glasrutschbanor eller i multi-well-plattor kan videoinspelas och kvantifieras på halvautomatiskt eller automatiserat sätt med olika programvaruverktyg. Faktum är att våra data belyser nyttan av objektivt och effektivt mätning av nematod lokomotorisk aktivitet både genom en ny tillämpning av ZebraLab-programvara för att kvantifiera lokomotorisk aktivitet i videor av maskar i flytande droppar på glasrutschbanor (en medelgenomströmningsscreeningskapacitet), samt genom att använda WormScan-programvara för att kvantifiera masklokmotorisk aktivitet i differentierade plattbäddsskanningsbilder av maskar i en 96-brunns platt flytande mediemetod54, 55,56 (en metod för screeningkapacitet med hög genomströmning). ZebraLab-programvarumetoden anses vara en medelgenomströmningsanalys eftersom det kräver att enstaka plattor används för varje studerade tillstånd, utan nuvarande utvecklat protokoll för multi-well-plattformat. Medan användning av ZebraLab-programvarumetoden kräver minimal tid när man analyserar C. elegans-aktivitet under några få förhållanden, ökar den experimentella tiden när den tillämpas på flera villkor. Här var den experimentella tiden ungefär 2 h för att överföra maskar till flytande droppar och spela in videor av deras aktivitet, med tanke på 18 tekniska replikat för varje tillstånd. Den tid som spenderades för analys av dessa videor med ZebraLab-programvaran var ungefär 1 h. Som jämförelse är WormScan-metoden hög genomströmning eftersom den innehåller ett multi-well-plattformat som tillåter samtidig analys av fyra 96-brunnsplattor på mindre än 10 minuter och att ställa in en 96-brunnsplatta med en COPAS Bisoter är också mindre än 10 min.

Båda metoder visade en på samma sätt minskad aktivitet i L4 larv steg gas-1(fc21) mitokondriell sjukdom mutanta maskar i förhållande till WT maskar, vilket validerar båda distinkta metoder för kvantifiering av skillnader i mask beteende. Vidare användes WormScan analys för att lätt visa att progressiv minskning av djur locomotor verksamhet inträffade med åldern i gas-1(fc21)maskar som var uppenbart dag 1 vuxen etappen.

De främsta fördelarna med att vi anpassar ZebraLab-programvaran som utvecklades för zebrafisksimningsanalys till C. elegans aktivitetsanalys är att det är experimentellt enkelt och billigt att objektivt fånga maskrörelser i videor, med halvautomatisk kvantitativ analys i filmfiler uppladdade till ZebraLab-programvara som kräver bara sekunder per teknisk replikering och tar bort prövarbaserad partiskhet som finns i manuella kvantifieringsmetoder. Vidare är det användbart att ha detta enda mjukvaruverktyg i forskningslaboratoriet för att kvantifiera lokomotorisk aktivitet i två djurmodellarter, nämligen zebrafisk och C. elegans. Nackdelen är att detta är en kommersiell programvara som kräver köp och maskvideor måste laddas upp manuellt i programvaran, även om uppladdningsprocessen är enkel och programvaruanalystiden är relativt snabb. Sammantaget har den nya applikationen som beskrivs här av att använda ZebraLab-programvara för att kvantifiera C. elegans lokomotorisk aktivitet direkt potential att utvärdera läkemedelseffekter på maskbeteende, även om dess genomströmning förblir låg till medelmedium med tanke på dess högupplösta krav kräver att filmer fångas av maskar som rör sig i mediedroppar placerade på glasrutschbanor.

Vi anpassade också WormScan programvara för att effektivt kvantifiera maskar locomotor kapacitet maskar i flytande media i en 96-brunnsplatta. Detta tillvägagångssätt erbjuder en hög genomströmning och lågkostnads experimentell metod som använder en standard flatbed scanner för att objektivt kvantifiera djur fecundity och överlevnad och har tidigare använts för hög genomströmningsskärmar i C. elegans49. De främsta fördelarna med denna teknik är att den är mycket mottaglig för screening med hög genomströmning, vilket möjliggör parallella jämförelser av ett stort antal förhållanden i alla skeden eller åldrar, med användarvänlighet, låg installationskostnader och snabb analys på ett objektivt sätt av WormScan-programvaran som är gratis och offentligt tillgänglig49. Nackdelen med WormScan är att den bara kan förhöra förändringen som sker mellan de sekventiella skanningarna, som i vissa mutationer eller tillstånd kanske inte är tillräckligt känsliga för att upptäcka små grader av fenotypisk förändring. Eftersom både ZebraLab- och WormScan-metoder uteslutande förlitar sig på bildpixelförändringar för att analysera djuraktivitet, kan betydande skillnader i maskstorlek som kan uppstå mellan stammar eller som svar på en specifik behandling över tid behöva övervägas och/eller användas som en normaliseringsfaktor för båda metoderna, för att mer specifikt möjliggöra utvärdering och jämförelse av mutations- och/eller behandlingseffekter på djurlokomotorisk aktivitet.

Sammantaget kan ett brett utbud av experimentella metoder användas för att bedöma nematod neuromuskulär aktivitet på integrerade fenotypiska resultat av thrashing, rörelse, faryngala pumpning och/eller chemotaxis. Vi jämförde 16 av dessa metoder (tabell 1), som belyser deras specifika experimentella och analytiska krav, fördelar, begränsningar och genomströmningskapacitet. Bland dessa tillhandahöll vi detaljerade experimentella protokoll för två nya applikationer av befintliga programvaruverktyg, ZebraLab (en medelgenomströmningsmetod) och WormScan (en hög genomströmningsmetod), som är särskilt användbara för att halvautomatiskt, objektivt och snabbt kvantifiera masklokomotionaktivitet i flytande media. Båda experimentella metoder visade en liknande minskad grad av rörelse verksamhet inträffade i mitokondriell sjukdom (gas-1(fc21)) i förhållande till WT C. elegans stammar på L4-stadiet, med progressiv nedgång i locomotor verksamhet av unga vuxna etappen i gas-1(fc21) maskar. Dessa data visar giltigheten hos dessa experimentella metoder som ger internt konsekventa data. Dessutom är denna mängd metoder mycket mångsidiga, vilket möjliggör ett brett utbud av mask lokomotoriska aktivitetsmått i olika sjukdomar etiologies, djurstadier och åldrar, och som svar på kandidat terapeutisk modellering eller hög genomströmning läkemedelsskärmar som är användbara för preklinisk utvärdering av blymål för mänsklig sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.L., N.D.M., N.S., och E.N.-O. inte har några relevanta finansiella upplysningar. M.J.F. är en av grundarna av MitoCUREia, Inc., vetenskaplig rådgivande styrelseledamot med eget kapital i RiboNova, Inc., och vetenskaplig styrelseledamot som betald konsult med Khondrion och Larimar Therapeutics. M.J.F. har tidigare varit eller är för närvarande engagerad i flera företag som är involverade i mitokondriell sjukdom terapeutisk preklinisk och/ eller klinisk fasutveckling som betald konsult (Astellas [tidigare Mitobridge] Pharma Inc., Cyclerion Therapeutics, Epirium Bio, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics, NeuroVive, Reneo Therapeutics, Stealth BioTherapeutics, Zogenix, Inc.) och/eller en sponsrad forskningspartner (AADI Therapeutics, Cardero Therapeutics, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics Inc., Mission Therapeutics, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics och Stealth BioTherapeutics).

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot Anthony Rosner, phD., med hans organisatoriska stöd för den tidiga förberedelsen av detta projekt, och till Erin Haus för att bidra till protokollanalys. Detta arbete finansierades av Juliets Cure FBXL4 Mitokondriell sjukdomsforskningsfond, Jaxson Flynt C12ORF65 Research Fund och National Institutes of Health (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 och T32-NS007413). Innehållet är enbart upphovsmännens ansvar och representerar inte nödvändigtvis finansiärerna eller De nationella hälsoinstitutens officiella åsikter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
  2. Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
  3. van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), 1000027 (2008).
  4. Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
  5. Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
  6. Polyak, E., Zhang, Z., Falk, M. J. Molecular profiling of mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 837, 241-255 (2012).
  7. McCormick, E., Place, E., Falk, M. J. Molecular genetic testing for mitochondrial disease: from one generation to the next. Neurotherapeutics. 10 (2), 251-261 (2013).
  8. McCormack, S., et al. Pharmacologic targeting of sirtuin and PPAR signaling improves longevity and mitochondrial physiology in respiratory chain complex I mutant Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 22, 45-59 (2015).
  9. Polyak, E., et al. N-acetylcysteine and vitamin E rescue animal longevity and cellular oxidative stress in pre-clinical models of mitochondrial complex I disease. Molecular Genetics and Metabolism. 123 (4), 449-462 (2018).
  10. Guha, S., et al. Pre-clinical evaluation of cysteamine bitartrate as a therapeutic agent for mitochondrial respiratory chain disease. Human Molecular Genetics. 28 (11), 1837-1852 (2019).
  11. Gorman, G. S., et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Annals of Neurology. 77 (5), 753-759 (2015).
  12. Mancuso, M., Orsucci, D., Filosto, M., Simoncini, C., Siciliano, G. Drugs and mitochondrial diseases: 40 queries and answers. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 13 (4), 527-543 (2012).
  13. Gai, X., et al. Mutations in FBXL4, encoding a mitochondrial protein, cause early-onset mitochondrial encephalomyopathy. American Journal of Human Genetics. 93 (3), 482-495 (2013).
  14. Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  15. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  16. Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
  17. Avery, L., Horvitz, H. R. Effects of starvation and neuroactive drugs on feeding in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 253 (3), 263-270 (1990).
  18. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  19. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. Journal of Experimental Biology. 211 (23), 3703-3711 (2008).
  20. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  21. Avery, L. Motor neuron M3 controls pharyngeal muscle relaxation timing in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 175, 283-297 (1993).
  22. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  23. Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. Chemosensory cell function in the behavior and development of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 529-538 (1990).
  24. Anne, C. H. Behavior. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 2005-2018, (2006).
  25. Biston, M. C., et al. An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes. Physics in Medicine & Biology. 48 (11), 1551-1563 (2003).
  26. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52321 (2015).
  27. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab on a Chip. 8 (9), 1432-1435 (2008).
  28. Javer, A., et al. An open-source platform for analyzing and sharing worm-behavior data. Nature Methods. 15 (9), 645-646 (2018).
  29. Koopman, M., et al. Assessing motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide field-of-view nematode tracking platform. Nature Protocols. 15 (6), 2071-2106 (2020).
  30. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  31. Angstman, N. B., Kiessling, M. C., Frank, H. G., Schmitz, C. High interindividual variability in dose-dependent reduction in speed of movement after exposing C. elegans to shock waves. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 12 (2015).
  32. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  33. Bianchi, J. I., Stockert, J. C., Buzzi, L. I., Blazquez-Castro, A., Simonetta, S. H. Reliable screening of dye phototoxicity by using a Caenorhabditis elegans fast bioassay. PLoS One. 10 (6), 0128898 (2015).
  34. Albertson, D. G., Thomson, J. N. The pharynx of Caenorhabditis elegans. Philososophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 275 (938), 299-325 (1976).
  35. Raizen, D. M., Avery, L. Electrical activity and behavior in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Neuron. 12 (3), 483-495 (1994).
  36. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
  37. Morck, C., Rauthan, M., Wagberg, F., Pilon, M. pha-2 encodes the C. elegans ortholog of the homeodomain protein HEX and is required for the formation of the pharyngeal isthmus. Developmental Biology. 272 (2), 403-418 (2004).
  38. Song, B. M., Avery, L. Serotonin activates overall feeding by activating two separate neural pathways in Caenorhabditis elegans. TheJournal of Neuroscience. 32 (6), 1920-1931 (2012).
  39. Avery, L., Raizen, D., Lockery, S. Electrophysiological methods. Methods in Cell Biology. 48, 251-269 (1995).
  40. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab in a Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  41. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nature Communications. 8, 14221 (2017).
  42. Brinkmann, V., Ale-Agha, N., Haendeler, J., Ventura, N. The Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in the aging process: Another puzzling role for this highly conserved transcription factor. Frontiers in Physiology. 10, 1561 (2019).
  43. Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, 43059 (2019).
  44. Zhu, B., et al. Functional analysis of epilepsy-associated variants in STXBP1/Munc18-1 using humanized Caenorhabditis elegans. Epilepsia. 61 (4), 810-821 (2020).
  45. Weeks, J. C., Robinson, K. J., Lockery, S. R., Roberts, W. M. Anthelmintic drug actions in resistant and susceptible C. elegans revealed by electrophysiological recordings in a multichannel microfluidic device. International Journal of Parasitology. Drugs and Drug Resistance. 8 (3), 607-628 (2018).
  46. Haroon, S., et al. Multiple molecular mechanisms rescue mtDNA disease in C. elegans. Cell Reports. 22 (12), 3115-3125 (2018).
  47. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  48. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
  49. Mathew, M. D., et al. Using C. elegans forward and reverse genetics to identify new compounds with anthelmintic activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005058 (2016).
  50. Kayser, E. B., Morgan, P. G., Hoppel, C. L., Sedensky, M. M. Mitochondrial expression and function of GAS-1 in Caenorhabditis elegans. Journal Biological Chemistry. 276 (23), 20551-20558 (2001).
  51. Falk, M. J., Kayser, E. B., Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mitochondrial complex I function modulates volatile anesthetic sensitivity in C. elegans. Current Biology. 16 (16), 1641-1645 (2006).
  52. Kwon, Y. J., Guha, S., Tuluc, F., Falk, M. J. High-throughput BioSorter quantification of relative mitochondrial content and membrane potential in living Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 40, 42-50 (2018).
  53. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  54. Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: Application to the Neuro-stimulant caffeine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57938 (2018).
  55. Carlsson, G., Blomberg, M., Pohl, J., Orn, S. Swimming activity in zebrafish larvae exposed to veterinary antiparasitic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Pharmacology. 63, 74-77 (2018).
  56. Yang, X., et al. High-throughput screening in larval zebrafish identifies novel potent sedative-hypnotics. Anesthesiology. 129 (3), 459-476 (2018).

Tags

Beteende Problem 170 maskar C. elegans lokomotorisk aktivitet faryngala pumpning chemotaxis thrashing ZebraLab WormScan hög genomströmning screening kapacitet gas-1 (fc21)
Jämförande analys av experimentella metoder för att kvantifiera djuraktivitet <em>i Caenorhabditis elegans</em> Modeller av mitokondriell sjukdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah,… More

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter