Summary
신경교종 줄기 세포 (GSC)는 가장 널리 퍼진 파괴적인 1 차뇌종양인 교모세포종 (GBM)에서 종양 개시, 혈관 신생 및 약물 내성에서 필수적인 역할을하는 암세포의 작은 부분입니다. GSC의 존재는 GBM개별 표적 에이전트의 대부분에 아주 불응성, 그래서 높은 처리량 검열 방법은 잠재적인 효과적인 조합 치료제를 확인하기 위하여 요구됩니다. 프로토콜은 시너지 상호 작용을 가진 잠재적인 조합 치료를 위한 신속한 검열을 가능하게 하는 간단한 워크플로우를 설명합니다. 이 워크플로우의 일반적인 단계는 루시파아제 태그가 지정된 GSC를 확립하고, 마모젤 코팅 플레이트를 준비하고, 조합 약물 검사, 분석 및 결과 유효성을 검사하는 것으로 구성됩니다.
Abstract
신경교종 줄기 세포 (GSC)는 가장 널리 퍼진 파괴적인 1 차뇌종양인 교모세포종 (GBM)에서 종양 개시, 혈관 신생 및 약물 내성에서 필수적인 역할을하는 암세포의 작은 부분입니다. GSC의 존재는 GBM개별 표적 에이전트의 대부분에 아주 불응성, 그래서 높은 처리량 검열 방법은 잠재적인 효과적인 조합 치료제를 확인하기 위하여 요구됩니다. 프로토콜은 시너지 상호 작용을 가진 잠재적인 조합 치료를 위한 신속한 검열을 가능하게 하는 간단한 워크플로우를 설명합니다. 이 워크플로우의 일반적인 단계는 루시파아제 태그가 지정된 GSC를 확립하고, 마모젤 코팅 플레이트를 준비하고, 조합 약물 검사, 분석 및 결과 유효성을 검사하는 것으로 구성됩니다.
Introduction
교모세포종 (GBM)은 1 차적인 뇌종양의 가장 일반적이고 공격적인 모형입니다. 현재, 최대 치료를받은 GBM 환자의 전반적인 생존 (수술의 조합, 화학 요법, 방사선 요법) 여전히 15 개월 보다 짧습니다. 따라서 GBM에 대한 새롭고 효과적인 치료가 시급히 필요합니다.
GBM에서 신경교종 줄기 세포(GSC)의 존재는 이러한 줄기와 같은 세포가 종양 미세 환경, 약물 내성 및 종양 재발1의유지에 피벗 역할을 하기 때문에 종래의 치료에 상당한 도전을 구성한다. 따라서 GSC를 타겟팅하는 것은 GBM 치료2에대한 유망한 전략이 될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 GBM의 약물 효능에 대한 주요 단점은 유전적 돌연변이, 혼합 된 아류형, 후성 유전학 조절 및 종양 미세 환경의 차이를 포함하되 이질유전학적 특성으로 치료에 매우 내화됩니다. 많은 실패한 임상 시험 후에, 과학자및 임상 연구원은 단 하나 에이전트 표적으로 한 치료가 GBM와 같은 고이질암의 진행을 완전히 통제할 수 없다는 것을 아마 실현했습니다. 반면, 엄선된 약물 조합은 서로의 효과를 시너지 효과 향상시킴으로써 그 효과를 승인하여 GBM 치료에 대한 유망한 솔루션을 제공한다.
CI(조합 지수), HSA(최고 단일제제), 블리스 값 등과 같은 약물 조합의 약물 상호작용을 평가하는방법은 여러 가지가있지만,이러한 계산 방법은 일반적으로 다중 농도 조합을 기반으로 한다. 실제로, 이러한 방법은 약물-약물 상호 작용의 긍정적인 평가를 제공할 수 있지만 높은 처리량 스크리닝에 적용되는 경우 매우 힘들 수 있습니다. 이 과정을 단순화하기 위해 환자 GBM의 외과 생검에서 비롯된 GSC의 성장을 저해하는 잠재적 약물 조합을 신속하게 식별하기 위한 스크리닝 워크플로우가 개발되었습니다. 예상 결합 효과의 차이를 반영하는 감도 지수(SI)는 각 약물의 시너지 효과를 정량화하기 위해 이 방법으로 도입되어 잠재적 후보자를 SI 랭킹에 의해 쉽게 식별할 수 있다. 한편, 본 프로토콜은 20개의 작은 분자 억제제 중 GBM 처리를 위한 일선 화학요법인 테모졸로미드와 항 신경교종 효과를 시너지시킬 수 있는 잠재적 후보(들)를 식별하는 예시 스크린을 보여줍니다.
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Protocol
GBM 표본은 난징의과대학 제1부속병원의 인간연구윤리위원회의 완전한 동의를 얻은 후 일상적인 수술 중 환자로부터 취득되었다.
1. 환자 유래 GSC의 격리 및 문화
- 멸균 PBS로 채워진 15mL 원심분리기 튜브에 신선한 외과 적 절제 된 교모세포종 조직을 놓고 추가 수술이 있을 때까지 조직을 얼음에 저장하십시오.
- GBM 조직을 해부 가위를 사용하여 직경 약 0.5~1mm 조각으로 다진 후 신경 기저 배지로 조직 표본을 세척하여 생물 안전 캐비닛에서 세포 이물질을 제거합니다.
- 조직 단편을 37°C에서 37°C에서 37°C로, 4°C에서 5분 동안 400xg의 원심분리기를 소화합니다.
- 상체를 제거하고 빈 신경 기저 배지로 펠릿을 중단하고 얼음에 반복적인 파이펫팅을 통해 펠릿을 기계적으로 분리합니다.
- GSC 배양 배지로 채워진 초저부착 6웰 배양판(레시피용 표 1 참조)에서 혼합물을 배양하여 37°C에서 5% CO2 및 90%의 습도를 신경구형성까지 배양한다.
- 충분한 신경구 형성시, 실온에서 5 분 동안 800 x g에서 1.5 mL 마이크로 튜브및 원심 분리기에서 파이펫을 사용하여 수집하십시오.
- 펠릿을 다시 중단하고 기본 GSC를 유지하기 위해 위의 배양 매체로 채워진 여러 플라스크로 분할합니다.
참고: 예에 사용된 환자 유래 GSC는 WHO 등급 IV 재발GBM을 가진 34세 남성 환자의 외과 생검에서 유래되었다. GSC는 향후 실험을 위해 XG387로 선정되었습니다. PCR 기반 마이코플라즈마 시험은 상기 GSCs에 대해 수행되어 미코플라즈마 오염이 존재하지 않는지 확인하였다. 이 프로토콜에 사용된 GSC와 관련된 모든 실험은 <15개의 구절을 수행하였다.
2. 루시파아제 태그가 태그된 GSC 준비
- 중간 배양에서 GSC를 수집하고 원심 분리기는 실온에서 3 분 동안 70 x g로 수집합니다.
- 상체를 제거하고 37 °C에서 4 분 동안 accutase로 세포를 소화하십시오. 200 μL 팁과 파이펫을 반복적으로 사용하여 셀 펠릿을 분리하고 다시 분리합니다.
- 세포를 12웰 배양판에서 잘 당 2 x 105 세포로 희석시키고 하룻밤 동안 세포를 배양한다.
- 플레이트내 각 웰에 30 μL 루시파아제-EGFP 바이러스 체퍼너티(titer >108 TU/mL)를 넣고 25°C에서 2시간 동안 1,000xg의 세포를 원심분리합니다. 하룻밤 동안 세포를 배양.
- 다음 날 배지를 새로 고치고 다른 48 h에 대한 세포를 배양합니다.
- GFP 양성 세포의 출현을 확인하기 위해 식물 성 현미경으로 세포를 관찰한다.
- 유동 셀 선별기를 사용하여 GFP 형광이 높은 GsCs를 선별하고 선택하여 세포를 배양합니다.
3. 세포 생존가능성의 바이오 발광 기반 측정
- 세포외 매트릭스 (ECM) 혼합물 (예를 들어, Matrigel)을 가진 코팅 플레이트는 각 우물에 0.15 mg /mL ECM 혼합물의 40 μL을 추가하고 37 °C에서 1 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 여분의 ECM 혼합물을 제거하고 PBS로 한 번 부드럽게 헹구십시오.
- 15,000, 10,000, 8,000, 6,000, 4,000, 2,000, 1,000 및 500 XG387-Luc 세포를 포함하는 100 μL 배양 배지를 96°C 의 광학 3개 에서 각각 6s에 대한 대조군으로 추가합니다.
- 상체를 제거하고, 각 우물에 150 ng/μL D-luciferin을 함유한 50 μL 배양 배지를 추가하고 37°C에서 5분 동안 세포를 배양한다.
- IVIS 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 플레이트내의 세포 바이오 발광의 이미지를 촬영합니다. 내장 소프트웨어를 사용하여 관심 영역(ROI)의 여러 원형 영역을 만들고 세포 바이오 발광을 정량화합니다.
4. 테모졸로미드 치료 및 조합 스크리닝
- 전술한 바와 같이 4개의 96웰 플레이트를 치료하기 전에 전코트한다.
- 종자 XG387-Luc 세포는 100 μL 배양 배지에서 1,000개의 세포밀도로 96웰의 광학 바닥 플레이트의 각 우물로 하룻밤 동안 세포를 배양한다.
- 테모졸로미드와 대상 에이전트를 주식 용액으로부터 미리 준비하십시오. 단일 제제 처리를 위한 배양 배지에서 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM 및 50 μM 테모졸로미드로 구성된 농도 계열을 준비한다. 배양 배지내의 스테모졸로미드 및 표적 제제를 각각 200 μM 및 2 μM의 최종 농도를 얻어 조합 약물 스크리닝(표2)을희석한다.
- 대부분의 GSC가 플레이트의 바닥을 고수할 때 배양 배지를 제거합니다. 테모졸로미드를 함유한 상시 제조된 배지를 각 웰에 추가하여 치료당 3개의 기술적 복제를 한다.
- Temozolomide를 치료하고 약물 조합을 스크리닝하기 위해 빈 매체를 제거하고 200 μM 테모졸로미드 또는 2 μM 표적제를 포함하는 상급 배지를 추가하거나, 치료당 3개의 기술적 복제를 위해 각각의 양분의 조합을 첨가한다.
- 모든 플레이트를 37°C, 5% CO2에서 3일 동안 배양합니다.
- 약물 함유 매체를 제거하고, 각각 의 우물에 150 ng/μL D-luciferin을 포함하는 50 μL 빈 배지를 추가하고 37°C에서 5분 동안 세포를 배양한다.
- IVIS 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 플레이트내의 세포 바이오 발광의 이미지를 촬영합니다. 내장 소프트웨어를 사용하여 여러 원형 ROI를 만들고 세포 바이오 발광을 정량화합니다.
5. XG387-Luc 및 XG328-Luc 세포주에서 테모졸로미드및 UMI-77의 조합 치료
- 전술한 바와 같이 3개의 96웰 플레이트를 치료하기 전에 미리 코팅한다.
- 종자 XG387-Luc 및 XG328-Luc 세포는 배양 배지의 100 μL에서 각각 1,000개의 밀도로 각각 96웰의 광학 바닥 플레이트와 하룻밤 사이에 세포를 배양한다.
- 600 μM로 구성된 농도 계열을 준비하고, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM, 0 μM 테모졸로미드 및 농도 계열은 6 μM, 3 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0.5 μM, 0.5 μM, 0μM UMI-77로 구성된 농도 계열로 구성되어 있습니다.
- 대부분의 GSC가 플레이트의 바닥을 고수할 때 빈 매체를 제거합니다. 처리당 3개의 기술 복제를 위해 위에서 준비한 매체를 각 우물에 추가합니다.
- 37 °C, 5 % CO2에서3 일 동안이 플레이트를 배양하십시오.
- 약물 함유 매체를 제거; 각 우물에 150 ng/μL D-luciferin을 포함하는 빈 배지 의 50 μL을 추가하고 생물 발광 측정을 위해 37 °C에서 5 분 동안 세포를 배양합니다.
6. 데이터 분석
- 도 2A의수식에 따라 테모졸로미드 및 표적 제제의 감도 지수(SI) 점수를 계산한다.
참고: SI 점수는 다른 약물의 첨가의 영향을 정량화하는 것입니다. 테모졸로미드 시너지 효과를 나타내는 양수 값으로 -1에서 +1까지 다양했습니다. - CompuSyn 소프트웨어를 사용하여 테모졸로미드와 UMI-77 사이의 조합 지수(CI) 값을 계산하여 결합된 상호 작용을 분석합니다. CI 값 <1은 시너지 효과를 나타냅니다. CI 값 >1은 적대감을 나타냅니다.
- Combenefit 소프트웨어를 사용하여 테모졸로미드와 UMI-77 사이의 높은 단일 에이전트(HSA) 값을 계산합니다. HSA 값은 결합된 억제 효과를 나타낸다. HSA 값 >0은 시너지 효과를 나타내고 HSA 값 <0은 적대감을 나타냅니다.
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Representative Results
XG387 세포는 극저부착 6-웰 배양플레이트 또는 비코팅 플레이트5(도 1A)에서 표 1에 기재된 배양 배지에서 신경구를 형성하였다. 먼저, XG387-Luc 세포로부터의 생체 발광 강도가 세포 수에 비례했는지 여부를 확인하기 위한 테스트를 수행하였다. 도 1B에도시된 바와 같이, 바이오 발광 강도는 세포 밀도에 비례하여 증가하고 그들 사이의 선형 보정을 초래했다(Pearson r = 0.9872; p < 0.0001; 그림 1C). 루시파라래기 태그된 세포의 생체 발광은 측정이 쉽고 빠르기 때문에 실행 가능한 GSC의 밀도를 측정하는 간단한 방법을 제공합니다. 다음으로, 테모졸로미드의 증식 방지 활성을 평가하였다. 도 1D에도시된 바와 같이, 400 μM 테모졸로미드는 XG387-Luc 세포의 약 20% 증식 억제를 일으켰으며, 이는 유용하지만 반GBM 효과가 더욱 개선될 수 있음을 시사한다. 200 μM의 농도는 조합 스크리닝을 위해 선택되었다.
예를 들어, 20개의 표적 선택적 소분자 억제제는 테모졸로미드의 항GBM 효과를 향상시키는 잠재적인 후보를 식별하기 위해 약물 조합 스크리닝에 활용되었다. 그 결과, 대상 에이전트 13개중의 민감지수(SI) 값이 0을 초과했고, 그 중 5개액은 0.1(그림2B,C)을상회하였다. 특히, 상위 2명의 후보 약물 인 UMI-77과 A 83-01의 SI는 0.25보다 높았으며 테모졸로미드와 시너지 효과를 낼 수 있는 잠재력을 시사했습니다.
상기 발견을 검증하기 위해, HSA와 블리스3,4,6의 고전적인 시너지 모델은 GSC에서 테모졸로미드및 UMI-77의 결합된 효과를 결정하기 위해 적용되었다. 또한, XG328-또 다른 환자 유래 GSC 모델은 조기 확립되어 동일한 평가를 수행하는 데 사용되었다. 테모졸로미드 및 UMI-77의 결합된 처리의 항증식 분석체는 6x6용량 적정매트릭스에서 수행되었다. 결과는 시너지 억제를 위한 판독인 HSA 및 Bliss 값을 획득하고 예상되는 억제와 관찰된 억제사이의 차이를 묘사하기 위해 분석되었다. 도 3B-D에도시된 바와 같이, 조합지수(CI) 값<1 및 고단일제제(HSA) 값이 >0의 대부분의 테모졸로미드와 UMI-77의 조합에 대해 서로 다른 농도에서, XG387과 XG328 GSCs 모두에서 테모졸로미드와 UMI-77의 전반적인 시너지 상호작용을 시사한다.
도 1: GBM 환자 유래 GSCs XG387. (A)신경권 형성. (B)XG387-Luc 세포에 의해 생성된 생체 발광 생성은 GsC를 태그한 luciferase태그GSC.(C)바이오 발광은 세포 밀도에 비례하였다. (D)XG387의 테모졸로미드 트리트먼트. 각 치료는 두 개의 독립적 인 실험과 triplicate에서 수행되었다. 데이터는 평균 ± SD로 표현됩니다.
도 2: GsC를 이용한 약물 조합 스크리닝. (A)조합 화면에서 테모졸로미드(TMZ)를 가진 20개의 표적 제제의 SI(감도 지수)를 계산하는 수식. (B)대상 에이전트 20의 SI 값 분포. 빨간 점 : 상위 5 후보 약물. (C)상위 5개 후보자 대상 대리인의 정보. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: XG387-Luc 및 XG328-Luc 세포주에서 테모졸로미드(TMZ)와 UMI-77의 조합 처리. (A)XG387-Luc 및 XG328-Luc 세포에서 증식 분석에서 테모졸로미드및 UMI-77의 단일 및 조합 적정. (B)이소볼로그램 및 XG387-Luc 및 XG328-Luc 세포에서 의 증식 억제의 조합 지수 분석이 테모졸로미드 및 UMI-77로 처리되었다. CI <1은 시너지 효과를 나타냅니다. (C,D) 테모졸로미드와 UMI-77 간의 상호 작용을 보여주는 Combenefit에 의해 생성된 시너지 플롯. 상호 작용의 분석은 HSA (높은 단일 에이전트) 값 및 Bliss 값을 초래하여 예상에서 계산된 시너지 효과를 나타냅니다. HSA 및 Bliss 값 >0은 시너지 효과를 나타냅니다. 각 치료는 두 개의 독립적 인 실험과 triplicate에서 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 연구에서는, 환자 유래 GSC를 사용하여 GBM에 대한 잠재적인 조합 요법을 식별하기 위해 적용될 수 있는 프로토콜이 설명되었다. Loewe, BLISS 또는 HSA 방법과 같은 표준 시너지/첨가도 메트릭 모델과 달리, 기존의 방법으로서 약물 쌍을 여러 농도로 결합할 필요가 없는 간단하고 빠른 워크플로우가 사용되었습니다. 이러한 워크플로우에서, 작은 분자 억제제와 함께 siRNAs의 감광 효과를 평가하는 연구에서 유래된 SI(감도 지수)는 2개의 작은 분자 억제제7의시너지 효과의 정량화하도록 도입되었다. SI 값의 범위는 -1에서 1까지이며, 양수 SI 값은 각 약물 간의 민감성 효과를 나타낸다. SI 값이 높을수록 시너지 효과가 강해졌습니다. SI 값만으로는 약물 상호 작용의 유형(시너지, 첨가제 또는 길항성)에 대한 긍정적인 답을 제공할 수 없지만, 상위권 후보자는 관심 있는 약물과 시너지 효과를 낼 확률이 높기 때문에 추가 검증의 가치가 있습니다. 이에 비해, 현재 고처리량 약물 조합 스크리닝 방법론의 대부분은 여전히 힘들고 어려운알고리즘8,9를포함한다.
이 방법의 타당성을 예시하기 위해 소규모 테스트 화면이 수행되었습니다. 그 결과, GSC 성장 억제에서 테모졸로미드와 시너지 효과를 내는 20개의 표적 제제 중 상위 후보로 선별된 MCL1 억제제인 UMI-77을 식별할 수 있었다. 실제로, 이전 연구에서, UMI-77은 또한 기존 GBM세포(10)에서테모졸로미드의 항 신경교종 활성을 시너지효과를 향상시키는 것으로 나타났다. 현재 연구에서는, UMI-77과 테모졸로미드 사이의 시너지 상호 작용은 고전적인 추탈라이 조합 지수, BLISS 또는 HSA 방법을 사용하여 GSCs에서 다시 승인되었다. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 셀의 실행 가능한 비율을 측정하기 위한 luciferase 태그가 지정된 GSC의 사용입니다. 세포의 루시파라제 활성은 루시페린, 루시파아제기기의 기판의 첨가에 의해 쉽게 측정될 수 있으며, 발광 측정 기능을 가진 모든 계측기에 의해 발광을 포착할 수 있다. 루시파라제-루시페린 반응은 빠르기 때문에, 본원에서 기존의 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드), MTS(3-3--3-)와 비교하여 저렴하고 빠른 솔루션을 제공합니다. (4,5-디메틸티아졸-2-yl)-5-(3-카박스티메톡톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H 테트라졸륨) 또는 CCK-8(셀 카운팅 키트-8) 이 모든 것은 긴 잠복기가 필요합니다. 함께, 프로토콜은 GBM에 대한 잠재적 인 약물 조합의 높은 처리량 검사를 제공합니다. 또한 이 프로토콜은 표준 시너지 평가 방법 외에도 약물 조합 스크린에 대한 선택적 빠르고 간단한 솔루션을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 충돌이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
중국 국립자연과학재단(81672962), 장쑤성 혁신팀 프로그램 재단, 동남아시아대학교 공동핵심사업재단, 난징의과대학 공동지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 50X |
| EGF | Gibco | PHG0313 | 20 ng/ml |
| FGF | Gibco | PHG0263 | 20 ng/ml |
| Gluta Max | Gibco | 35050061 | 100X |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | 1X |
| Penicillin-Streptomycin | HyClone | SV30010 | P: 10,000 units/ml S: 10,000 ug/ml |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 2088876 | 100 mM |
| Table 1. The formulation of GSC complete culture medium. | |||
| ABT-737 | MCE | Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor | |
| Adavosertib (MK-1775) | MCE | Wee1 inhibitor | |
| Axitinib | MCE | Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor | |
| AZD5991 | MCE | Mcl-1 inhibitor | |
| A 83-01 | MCE | Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase | |
| CGP57380 | Selleck | Potent MNK1 inhibitor | |
| Dactolisib (BEZ235) | Selleck | Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor | |
| Dasatinib | MCE | Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor | |
| Erlotinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Gefitinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Linifanib | MCE | Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family | |
| Masitinib | MCE | Inhibitor of c-Kit | |
| ML141 | Selleck | Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase | |
| OSI-930 | MCE | Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R | |
| Palbociclib | MCE | Selective CDK4 and CDK6 inhibitor | |
| SB 202190 | MCE | Selective p38 MAP kinase inhibitor | |
| Sepantronium bromide (YM-155) | MCE | Survivin inhibitor | |
| TCS 359 | Selleck | Potent FLT3 inhibitor | |
| UMI-77 | MCE | Selective Mcl-1 inhibitor | |
| 4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene) | Selleck | Selective estrogen receptor (ER) modulator | |
| Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table. |
References
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