Artículo de método

Manejo avanzado del ritmo cardíaco mediante la aplicación de fotoestimulación optogenética multisitio en corazones murinos

DOI:

10.3791/62335

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26 de agosto de 2021

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1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo informa un método para controlar el ritmo cardíaco de corazones murinos intactos de ratones transgénicos con canalrodopsina-2 (ChR2) utilizando fotoestimulación local con una matriz de micro-LED y mapeo óptico simultáneo del potencial de la membrana epicárdica.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las taquiarritmias ventriculares son una causa importante de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. La desfibrilación eléctrica mediante descargas eléctricas de alta energía es actualmente el único tratamiento para la fibrilación ventricular potencialmente mortal. Sin embargo, la desfibrilación puede tener efectos secundarios, como dolor intolerable, daño tisular y empeoramiento del pronóstico, lo que indica una necesidad médica significativa para el desarrollo de estrategias de manejo del ritmo cardíaco más suaves. Además de los enfoques eléctricos reductores de energía, la optogenética cardíaca se introdujo como una herramienta poderosa para influir en la actividad cardíaca utilizando canales iónicos de membrana sensibles a la luz y pulsos de luz. En el presente estudio, se describirá un método robusto y válido para la fotoestimulación exitosa de corazones murinos intactos perfundidos por Langendorff basado en la estimulación multisitio aplicando una matriz de 3 x 3 de micro diodos emisores de luz (micro-LED). El mapeo óptico simultáneo de las ondas de voltaje de la membrana epicárdica permite la investigación de los efectos de la estimulación específica de la región y evalúa la actividad cardíaca recién inducida directamente en el sitio. Los resultados obtenidos muestran que la eficacia de la desfibrilación depende en gran medida de los parámetros elegidos para la fotoestimulación durante una arritmia cardíaca. Se demostrará que el área iluminada del corazón juega un papel crucial para el éxito de la terminación, así como cómo se puede lograr el control específico de la actividad cardíaca durante la iluminación para modificar los patrones de arritmia. En resumen, esta técnica ofrece la posibilidad de optimizar la manipulación del mecanismo in situ en el camino hacia el control de retroalimentación en tiempo real del ritmo cardíaco y, con respecto a la especificidad de la región, nuevos enfoques para reducir el daño potencial al sistema cardíaco en comparación con el uso de aplicaciones de descargas eléctricas no específicas.

Introducción

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Las primeras investigaciones de la dinámica espacio-temporal durante la arritmia revelaron que los complejos patrones eléctricos durante la fibrilación cardíaca son impulsados por ondas de excitación giratorias similares a vórtices1. Este hallazgo proporcionó nuevos conocimientos sobre los mecanismos subyacentes de las arritmias, que luego condujeron al desarrollo de nuevas terapias de terminación eléctrica basadas en la excitación multisitio del miocardio 2,3,4. Sin embargo, los tratamientos que utilizan estimulación del campo eléctrico no son locales y pueden inervar todas las células excitables circundantes, incluido el tejido muscular, causando daño celular y tisular, así como dolor intolerable. A diferencia de las terapias eléctricas, los enfoques optogenéticos proporcionan una técnica específica y protectora de tejidos para evocar potenciales de acción de cardiomiocitos con alta precisión espacial y temporal. Por lo tanto, la estimulación optogenética tiene el potencial de un control mínimamente invasivo de los patrones de activación caótica durante la fibrilación cardíaca.

La introducción del canal iónico sensible a la luz canalrodopsina-2 (ChR2) en células excitables mediante manipulación genética 5,6,7, permitió la despolarización del potencial de membrana de las células excitables mediante fotoestimulación. Se han desarrollado varias aplicaciones médicas, incluyendo la activación de redes neuronales, el control de la actividad cardíaca, la restauración de la visión y la audición, el tratamiento de lesiones medulares, y otras 8,9,10,11,12,13,14. La aplicación de ChR2 en cardiología tiene un potencial significativo debido a su tiempo de respuesta de milisegundos15, lo que lo hace muy adecuado para el control dirigido de la dinámica cardíaca arrítmica.

En este estudio, se muestra la fotoestimulación multisitio de corazones intactos de un modelo de ratón transgénico. En resumen, se estableció una línea de ratones alfa-MHC-ChR2 transgénicos en el ámbito del Séptimo Programa Marco FP7/2007-2013 de la Comunidad Europea (HEALTH-F2-2009-241526) y amablemente proporcionada por el Prof. S. E. Lehnart. En general, los machos adultos transgénicos C57/B6/J, que expresaban Cre-recombinasa bajo control de alfa-MHC se emparejaron para aparearse con hembras B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Dado que el casete STOP cardíaco se eliminó en la segunda generación, la descendencia mostró una expresión estable de MHC-ChR2 y se utilizó para mantener colonias fotosensibles cardíacas. Todos los experimentos se realizaron con ratones adultos de ambos sexos a una edad de 36 a 48 semanas. La iluminación se logra utilizando una matriz de micro-LED de 3 x 3, fabricada como se describe en16,17, excepto que la carcasa a base de silicio y las fibras cortas de vidrio óptico no están implementadas. Su primer uso en una aplicación cardíaca se encuentra en18. Se ha aplicado una matriz lineal de micro-LED basada en una tecnología de fabricación similar como sonda penetrante para la estimulación cardíaca19. Los micro-LED están dispuestos en una matriz de 3 x 3 a un paso de 550 μm, proporcionando una alta resolución espacial y una alta potencia radiante en un área muy pequeña. Los autores demuestran en este trabajo una fotoestimulación multisitio local versátil que puede abrir el camino para desarrollar nuevos métodos de terapia antiarrítmica.

El siguiente protocolo experimental implica una perfusión de Langendorff retrógrada ex vivo, para la cual la aorta canulada funciona como entrada de perfusión. Debido a la presión de perfusión aplicada y la contracción cardíaca, el perfusión fluye a través de las arterias coronarias, que se ramifican de la aorta. En el trabajo presentado, el corazón se perfunde utilizando una configuración de presión constante lograda elevando los reservorios de perfusión a 1 m de altura, equivalente a 73.2 mmHg, lo que produce un caudal de 2.633 ± 0.583 mL / min. Dos tipos de solución de Tyrode se utilizan como perfusión durante el experimento. La solución regular de Tyrode apoya un ritmo sinusal estable, mientras que la solución de Low-K+ Tyrode se mezcla con Pinacidil para permitir la inducción de arritmia en corazones murinos. El uso de un baño de agua hexagonal permite la observación del corazón a través de seis ventanas planas diferentes, lo que permite el acoplamiento de varios componentes ópticos con menos distorsión por refracción.

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Protocolo

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Todos los experimentos siguieron estrictamente la regulación de bienestar animal, de acuerdo con la legislación alemana, las estipulaciones locales y de acuerdo con las recomendaciones de la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia de Animales de Laboratorio (FELASA). La solicitud de aprobación de experimentos con animales ha sido aprobada por la autoridad responsable de bienestar animal, y todos los experimentos fueron reportados a nuestros representantes de bienestar animal.

1. Preparación de experimentos y materiales

  1. Configuración de mapeo óptico
    NOTA: La configuración óptica, así como la configuración eléctrica, se muestran en la Figura 1. Todos los componentes utilizados en la configuración óptica y eléctrica se enumeran en detalle en la Tabla de materiales.
    1. Utilice el LED 1 y el LED 2 para la inducción de arritmias y la desfibrilación de respaldo. Elija LED de alta potencia con una longitud de onda λazul cercana a 475 nm, que es el pico de la longitud de onda de excitación de ChR26. Para reducir aún más el espectro óptico, utilice un filtro de paso de banda de 470 ± 20 nm.
      NOTA: En este trabajo, el LED 1 y el LED 2 tienen un flujo radiante típico de 3.9 a 5.3 W, según la hoja de datos20.
    2. Ilumine el epicardio para el mapeo óptico con un LED rojo de alta potencia (LED 3 en la Figura 1), que emite luz con una longitud de onda central de λrojo = 625 nm y un flujo radiante de 700 mW21. La luz roja se filtra con un filtro de paso de banda de 628 ± 20 nm y se refleja en un espejo dicroico (DM) de paso largo con una longitud de onda de corte de λDM = 685 nm.
    3. Utilice un filtro de emisión con λfiltro-leva = 775 ± 70 nm delante del objetivo de la cámara para registrar solo la emisión de fluorescencia de la actividad cardíaca. Utilice un objetivo rápido que sea adecuado para aplicaciones con poca luz.
      NOTA: La frecuencia de fibrilación del corazón de un ratón varía de 20 a 35 Hz; por lo tanto, use una cámara lo suficientemente rápida para grabar con una frecuencia de 1 a 2 kHz, o incluso superior.
  2. Matriz de micro-LED
    NOTA: Las matrices de micro-LED aplicadas aquí se realizan utilizando el procesamiento de microsistemas como se detalla en otra parte16,17.
    1. Capa de centrifugación de una capa de poliimida (PI) de 5 μm de espesor sobre sustratos de silicio de 4 pulgadas (pulido por una sola cara, 525 μm de espesor).
    2. Curar esta capa PI a una temperatura máxima de 450 °C bajo una atmósfera de nitrógeno. Mantenga la temperatura máxima constante durante 10 min.
    3. Deposite y modele una fotorresistencia (PR) de inversión de imagen utilizando litografía ultravioleta (UV) y deposite una capa de platino delgada (Pt) de 250 nm.
    4. Espesar esta metalización basada en Pt galvanoplastia una capa de oro (Au) de 1 μm de espesor con el PR estampado que sirve como capa de enmascaramiento.
    5. Antes de recubrir por centrifugado una segunda capa PI, exponga la oblea con su primera capa PI y la metalización galvanizada con Au-galvanizado a un plasma de oxígeno que activa químicamente la superficie de la capa PI.
    6. Curar la segunda capa PI de nuevo a 450 °C, aplicar litografía UV para modelar una capa PR y abrir las almohadillas de contacto de la matriz para los chips micro-LED y la placa de circuito impreso de interfaz (PCB) mediante grabado iónico reactivo (RIE) utilizando el PR modelado como capa de enmascaramiento.
      NOTA: En estos pasos del proceso RIE, se recomienda aplicar 200 W y 100 W durante 10 y 30 min, respectivamente, para definir las aberturas de la almohadilla de contacto, así como la forma exterior de la matriz de microLED bidimensional (2D).
    7. Pelar el PR utilizando disolventes y grabado por plasma. Espesar aún más las almohadillas de contacto galvanoplastia una capa adicional de oro de 6 μm de espesor.
    8. Conecte los chips micro-LED a las almohadillas de contacto utilizando un adhesivor flip-chip.
    9. Active la superficie PI en un plasma de oxígeno y rellene los chips micro-LED con un adhesivo sin disolventes. Curar el adhesivo durante 12 h a 120 °C.
    10. Para encapsular los chips micro-LED, realice otro tratamiento de plasma con argón y aplique una capa delgada de fluoropolímero manualmente. Precurar esta capa a 80 °C durante 1 h.
    11. Aplique manualmente silicona como capa de encapsulación final después de exponer la matriz de micro-LED a un plasma de oxígeno, utilizado para mejorar la adhesión del silicio a la capa de fluoropolímero subyacente. Curar la capa de silicona a 80 °C y 180 °C durante 1 h cada una. Estos pasos finales de curado también curan completamente la capa de fluoropolímero.
    12. Suelde las almohadillas de contacto del sustrato PI a una placa de circuito impreso que lleva conectores de tira para la interconexión de la matriz a una instrumentación externa. Cubra las almohadillas de soldadura en la PCB con un adhesivo.
  3. Configuración eléctrica
    1. Use electrodos adecuados para registrar un electrocardiograma (ECG), por ejemplo, electrodos de plata/cloruro de plata o electrodos de potencial de acción monofásico (MAP) y un amplificador de ECG para monitorear la actividad eléctrica del corazón continuamente. Además, utilice un dispositivo de adquisición (AD) adecuado para registrar todas las señales eléctricas obtenidas.
    2. Elija un controlador adecuado para los LED de alta potencia (LED 1, LED 2 y LED 3), que pueden administrar la corriente máxima aplicada a cada dispositivo. Utilice un generador de funciones arbitrarias (AFG) para controlar la salida de los controladores LED con precisión.
    3. Utilice un controlador LED multicanal para controlar la corriente que fluye a través de la matriz de micro-LED. Un AFG con múltiples salidas también es adecuado para esta tarea.
      NOTA: Es recomendable elegir controladores LED que limiten la corriente a la corriente máxima del micro-LED, de lo contrario los diodos podrían dañarse. Un ejemplo de un controlador micro-LED multicanal se describe en otro trabajo18. Si es necesario, el AFG o cualquier otro controlador LED puede conectarse a una computadora para controlar de forma remota la configuración del micro-LED. Si este es el caso, conecte el controlador LED a la computadora con el protocolo de comunicación de su elección, por ejemplo, Bus de interfaz de propósito general (GPIB) o una conexión serie.

   

2. Procedimientos experimentales

  1. Preparación de la solución
    1. Prepare la solución de Tyrode: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO3, 1.8 mM CaCl 2, 1.2 mM KH2 PO4, 5.6 mM Glucosa, 0.1% BSA/Albúmina.
    2. Prepare la solución de Low-K+ Tyrode: Low-K+ Tyrode's se fabrica de la misma manera que la solución regular de Tyrode, excepto que solo se agrega la mitad de la cantidad de KCl (2 mM en lugar de 4 mM KCl).
      NOTA: Para un experimento que dura 3 h, generalmente 2-3 L de Tyrode de Low-K+ (mezclado adicionalmente con Blebbistatin (Paso 2.1.5) si se realiza mapeo óptico) y 1-2 L de Tyrode regular son suficientes.
    3. Agregue Pinacidil a la solución de Low-K+ Tyrode para facilitar el proceso de inducción de arritmias, como se describe en22, para obtener una concentración de 100 mM. Use guantes protectores de laboratorio cuando manipule Pinacidil.
    4. Preparar 1 ml de 50 μM DI-4-ANBDQPQ con la solución regular de Tyrode. Proteja el tinte de la luz para evitar el fotoblanqueo.
    5. Haga una solución madre de 10 mM de blebbistatina. Para el mapeo óptico, mezclar Blebbistatin con la solución de Pinacidil-Tyrode de 100 mM (Paso 2.1.3) para obtener una solución de 5 μM. Use guantes protectores de laboratorio cuando manipule blebbistatina.
      NOTA: Mantenga el tinte y la solución de blebbistatina a un lado hasta que comience el mapeo óptico.
  2. Perfusión de Langendorff
    NOTA: La configuración consta de dos depósitos para las dos soluciones de Tyrode. Están conectados a una trampa de burbujas a través de tubos con pollos de tres vías. El corazón se une más tarde a la trampa de burbujas mediante un conector de bloqueo Luer, y luego se suspende en un baño de agua hexagonal. El baño de agua está, a su vez, conectado a un contenedor de residuos para recoger la solución usada de Tyrode.
    1. Limpie todos los tubos antes de cada experimento con agua totalmente desmineralizada.
    2. Airear ambas soluciones de Tyrode con Carbogen (5% CO2 y 95%O2) durante 30 min a temperatura ambiente antes de comenzar el experimento. Ajuste el valor de pH de las soluciones de Tyrode a 7,4 con NaOH.
    3. Llene 500 ml de cada solución de Tyrode en el depósito correspondiente y desairee los tubos, así como la trampa de burbujas, pasando la solución de Tyrode a través del sistema de perfusión hasta que no se vean más burbujas de aire atrapadas en los tubos o en la trampa de burbujas.
    4. Continuar aireando las soluciones de Tyrode durante todo el experimento en los depósitos con Carbogen para garantizar que el pH del perfusato permanezca estable más adelante durante la perfusión.
    5. Calentar el sistema de perfusión a 37 °C con una bomba de calor de agua. Mantenga constante la temperatura de perfusión dentro del baño de agua utilizando un elemento calefactor adicional, como un cable calefactor impermeable.
      NOTA: Durante el experimento, es crucial volver a llenar los depósitos del Tyrode antes de que se vacíen. De lo contrario, las burbujas de aire pueden ingresar al corazón, lo que puede obstruir los vasos y provocar isquemia.
  3. Preparación del ratón
    1. Inyecte por vía subcutánea 0,1 ml de 500 I.E. heparina 30 min antes del procedimiento de aislamiento cardíaco.
    2. Llene una placa de Petri de 6 cm y una jeringa de 2 ml con la solución helada de Tyrode. Colocar bajo el microscopio estereoscópico.
    3. Realizar anestesia a corto plazo de ratones por un ambiente saturado de isoflurano durante 2 min y luxación cervical inmediata después.
      NOTA: Para verificar suficiente anestesia es absolutamente necesario verificar el reflejo negativo entre los dedos del pie.
    4. Abra el pecho, retire el corazón, como se describe en otra parte23, y colóquelo en la placa de Petri de 6 cm con la solución helada de Tyrode. Los latidos cardíacos disminuirán debido a la caída de la temperatura.
    5. Hacer la preparación fina bajo un microscopio estereoscópico, como se detalla en otra parte23. Coloque la aorta en la aguja roma y fije el vaso con material de sutura.
    6. Como control, inyecte la solución helada de Tyrode a través de la aguja en el corazón y verifique que el corazón esté bien montado. Este paso también enjuaga la sangre restante del corazón.
    7. Transfiera el corazón montado al sistema de perfusión. Asegúrese de que el perfusado fluya para evitar que el aire entre en el corazón mientras conecta la aguja con la trampa de burbujas. Compruebe que el corazón esté cubierto con la solución de Tyrode en el baño maría. Los pasos 2.3.4, 2.3.5 y 2.3.7 se ilustran en la Figura 2.
    8. Asegúrese de que el corazón comience a latir en unos pocos minutos. Deje que el corazón se adapte a la configuración de perfusión durante 15 a 20 minutos, luego cambie a la solución de Tyrode bajo K + con Pinacidil (Paso 2.1.3) respectivamente la solución de Tyrode bajo K + con Pinacidil y Blebbistatin (Paso 2.1.5) si se va a realizar un mapeo óptico.
  4. Inducción de arritmias y desfibrilación óptica
    1. Coloque uno de los electrodos de ECG lo más cerca posible de la superficie del corazón para garantizar una buena calidad de señal. Suspenda el segundo electrodo de ECG en la solución de Tyrode. Asegúrese de que el ECG adquirido está siendo registrado por el AD de elección.
    2. Coloque la matriz de micro-LED en el área de interés del estudio, por ejemplo, en el ventrículo izquierdo.
    3. Cambie la perfusión a Tyrode's low-K+ con Pinacidil y perfunda el corazón durante 15 a 30 min.
    4. Para inducir arritmia, ilumine el corazón con LED 1 y LED 2 con un tren de 20 a 50 pulsos de luz con una frecuencia f ind de 25 a 35 Hz, duración del pulso Wind de 2 a 15 ms e intensidad de luz LIopt_ind de 2.8 mW mm-2.
    5. Repita el proceso hasta que se induzca la arritmia.
      NOTA: Las arritmias son fáciles de identificar en la señal del ECG porque la frecuencia y la morfología de la señal difieren del ritmo sinusal normal. Si la arritmia termina dentro de los próximos 5 s, clasifíquela como autoterminada y comience un nuevo intento de inducción.
    6. Una vez que se detecta visualmente una arritmia sostenida, aplique una ráfaga de pulsos con diferentes anchos W def y frecuencias fdef, utilizando tres, seis o nueve micro-LEDs de la matriz a unpulso de corriente pulsante I de 15 mA que produzca una intensidad de luz LIμLED = 33.31 ± 2.05 mW mm-2.
    7. Si la arritmia continúa después de cinco ensayos de desfibrilación basados en matrices de micro-LED, clasifique el intento como fallido y comience la desfibrilación de respaldo.
    8. Para la desfibrilación de respaldo, use LED 1 y LED 2 utilizando los mismos parámetros de sincronización establecidos para la matriz de micro-LED.
      NOTA: Debido a que el corazón está expuesto al estrés isquémico y metabólico durante todo el período experimental, es posible que los intentos de terminación de la arritmia no tengan éxito incluso con la desfibrilación de respaldo. Siempre que esto suceda, cambie la solución de perfusión a la de Tyrode regular y deje que el corazón se recupere durante 5 a 10 minutos. Cuando el ECG vuelva al ritmo sinusal, repita de nuevo el protocolo del paso 2.4.3.
  5. Mapeo óptico
    1. Perfundir el corazón con la solución de Blebbistatin preparada en el paso 2.1.5 y esperar hasta que se produzca el desacoplamiento mecánico. Esto se logra cuando el corazón deja de latir, pero una señal de ECG sigue siendo medible.
      NOTA: Mezclar la solución de Blebbistatin a la concentración mencionada y mantener el corazón perfundido con esta solución mantiene la actividad mecánica cardíaca desacoplada de la actividad eléctrica durante todo el experimento.
    2. Dar el colorante de tensión DI-4-ANBDQPQ de 1 ml (preparado en el paso 2.1.4) como bolo en la trampa de burbujas de la perfusión de Langendorff. Espere de 5 a 10 minutos para permitir que el tinte perfunda el corazón de manera uniforme.
      NOTA: Evite el fotoblanqueo del tinte apagando la luz roja siempre que no se realice ninguna grabación. Si la relación señal/ruido de la grabación se vuelve demasiado pequeña (la señal adquirida es demasiado ruidosa), repita los pasos 2.1.4 y 2.5.2.
    3. Enfoque la cámara sobre la superficie del corazón, encienda el LED 3 y aplique una potencia óptica de 1,27 mW mm-2 .
    4. Apague las luces del laboratorio y comience a grabar. Asegúrese de que se está adquiriendo una señal óptica comparando la frecuencia de la señal obtenida con la frecuencia del ECG grabado. Esto asegura que la señal óptica obtenida esté puramente relacionada con la actividad eléctrica del corazón.
      NOTA: Dado que la luz fluorescente emitida por el tinte es muy semanal, el mapeo óptico se realiza en una habitación oscura. Esto evita la interferencia de la señal de cualquier otra fuente de luz.

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Resultados

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El protocolo permite la inducción de arritmias ventriculares en corazones murinos intactos mediante pulsos de fotoestimulación generados por LED 1 y LED 2 (Figura 1) con una frecuencia f ind entre 25 Hz y 35 Hz y una duración de pulso Wind entre 2 ms y 10 ms. Tenga en cuenta que el objetivo de tales pulsos de luz rápidos no es capturar el ritmo cardíaco, sino desequilibrar la actividad cardíaca para que se puedan generar ondas eléctricas erráticas, que luego facilitan u...

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Discusión

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Un tratamiento exitoso de las taquiarritmias cardíacas es clave para la terapia cardíaca. Sin embargo, los mecanismos biofísicos subyacentes a la iniciación, perpetuación y terminación de la arritmia no se comprenden completamente. Por lo tanto, la investigación cardíaca tiene como objetivo optimizar la terapia de choque eléctrico hacia una terminación más suave de las arritmias, aumentando así la calidad de vida de los pacientes 28,29,30,31.

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Divulgaciones

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Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer a Marion Kunze y Tina Althaus por su excelente apoyo técnico durante los experimentos. La investigación que ha dado lugar a los resultados ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco FP7/2007-2013 de la Comunidad Europea en virtud del acuerdo de subvención número HEALTH-F2-2009-241526. El apoyo también fue proporcionado por el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular, DZHK e.V. (Proyecto MD28), el sitio asociado Goettingen, la Fundación Alemana de Investigación CRC 1002 (proyecto C03) y la Sociedad Max Planck. Este trabajo fue apoyado en parte por BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence financiado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG, número de subvención EXC 1086).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Componentes
BlebbistatinTargetMolT603810 mM solución madre
BSA/AlbúminaSigma-AldrichA4919
Cloruro de calcioSigma-AldrichC1016CaCl2
CarbogenWestfalenFrasco de 50 l
DI-4-ANBDQPQAAT Bioquest21499Colorante para mapeo óptico
GlucosaSigma-AldrichD9434C6H12O6
HeparinaLEO PharmaHeparina-Natrio Leo 25.000 I.E./5 ml, disponible solo con receta
médica Clorhídrico ÁcidoMerck1.09057.1000HCl, 1 M solución madre
IsofluranoCP Pharma1 ml/ml, disponible solo con receta
médica Magnesio Cloruro Merck8.14733.0500MgCl2
Fosfato monopotásicoSigma-Aldrich30407KH2PO4
Pinacidil monohidratoSigma-AldrichP154-500mg10 mM solución madre
Cloruro de potasioSigma-AldrichP5405KCl
Bicarbonato de sodioSigma-AldrichS5761NaHCO3
Sodio CloruroSigma-AldrichS5886NaCl
Hidróxido de sodioMerck1.09137.1000NaOH, solución madre de 1 M
Configuración
Biopac MP150Biopac SystemsMP150WSWsistema de adquisición y análisis
de datos ECG hecho a medida, alternativa ECG100CBiopac SystemsECG100CAmplificador de electrocardiograma
Calentador de baño de agua hecho a medida con cable calefactorRMS Sistemade calefacción HK-5,0-12Cable calefactor 120W
agua hexagonal
Controlador LED Fuente de alimentaciónThorlabsKPS10115 V, 2.4 A Unidad de fuente de alimentación con conector Jack de 3,5 mm para un cubo K o T.
Controlador LED LEDD1BThorlabsLEDD1BT-Cube Controlador LED, 1200 mA Corriente de accionamiento máxima
MAP, electrodo de ECGHugo Sachs ElektronikBS4  73-0200Mini-ECG Electrodo para corazones aislados
Controlador micro-LED p. ej. AFGAgilent InstrumentsA-2230 Generador defunciones arbitrarias (AFG)
Generador de señalesAgilent InstrumentsA-2230AFG
micro-LED Array Componentes
Pegamento epóxidoTecnología epoxiEPO-TEK 353NDEpoxi
de dos componentesFluoropolímero  Vidrio Asahi Co., Ltd.Cytop 809MFluoropolímero con alta transparencia
Inversión de imagen fotorresistenteMerck KGaAAZ 5214EResistencia a la inversión de imagen para chip LED de alta resolución
  Cree Inc.C460TR2227-S2100Fotorresistencia micro-LED azul
Merck KGaAAZ 9260Fotorresistencia positiva gruesa
PoliimidaUBE Industries Ltd.U-VarnishS Solución de poliimida
SiliconaNuSil Technology LLCMED-6215Elastómero de silicona de baja viscosidad
Adhesivo sin disolventesJohn P. Kummer GmbHEpo-Tek 301-2Resina epoxi con mapeo
Filtro azul ChromaTechnology CorporationET470/40xFiltro
CámaraFotométricaCascade 128+Cámara EMCCD de alto rendimiento
Objetivo de la cámaraNavitarDO-5095Navitar lentes de distancia focal fija de alta velocidad funciona con cámaras CCD y CMOS
Espejo dicroicoSemrockFF685-Di02-25x36685 nm BrightLine® epifluorescencia estándar de un solo borde divisor de haz dicroico
Filtro de emisiónSemrockFF01-775/140-25775/140 nm BrightLine® filtro de paso de banda de banda única
Disipador de calorSoluciones térmicas avanzadasATSEU-077A-C3-R0Disipadores de calor - LED STAR LED Disipador de calor LED, 45 mm de diámetro, 68 mm, negro/plateado, placa base sin rosca Herrajes
LED 1 y LED 2Engin OsramLZ4-00B208LED de alta potencia - Azul de un solo color, 460 nm 130 lm, 700 mA
LED 3ThorlabsM625L3625 nm, 700 mW (min) LED montado, lentes de 1000
mA LED Engin OsramLLNF-2T06-HIluminación LED Conjuntos de lentes LZ4 LENTE HAZ DE INUNDACIÓN ESTRECHO
Fotodiodo para medidor de potenciaThorlabsS120VCFotodiodo estándar Sensor de potencia Medidor
potenciaThorlabsPM100DMedidor de potencia y potencia compacto
Filtro rojoSemrockFF02-628/40-25BrightLine® Filtro de paso de banda de banda única
químicoseléctricaBaño deóptico de baja viscosidad de excitación azul borde de de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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