Summary
Apresentado aqui é um protocolo para preservar a contração vascular do tecido pulmonar murino PCLS, resultando em uma imagem tridimensional sofisticada da vasculatura pulmonar e das vias aéreas, que pode ser preservada por até 10 dias suscetíveis a inúmeros procedimentos.
Abstract
A visualização do tecido pulmonar murino fornece informações estruturais e celulares valiosas sobre as vias aéreas subjacentes e a vasculatura. No entanto, a preservação de vasos pulmonares que realmente representam condições fisiológicas ainda apresenta desafios. Além disso, a delicada configuração dos pulmões murinos resulta em desafios técnicos na preparação de amostras para imagens de alta qualidade que preservam tanto a composição celular quanto a arquitetura. Da mesma forma, ensaios de contrailidade celular podem ser realizados para estudar o potencial das células para responder aos vasoconstritores in vitro,mas esses ensaios não reproduzem o ambiente complexo do pulmão intacto. Em contraste com essas questões técnicas, o método de corte de precisão da fatia pulmonar (PCLS) pode ser aplicado como uma alternativa eficiente para visualizar o tecido pulmonar em três dimensões sem viés regional e servir como um modelo de contração de substituto vivo por até 10 dias. Tecido preparado com PCLS tem estrutura preservada e orientação espacial, tornando-se ideal para estudar processos de doença ex vivo. A localização de células etiquetadas tdTomato endógenas em PCLS colhidas a partir de um modelo de murina tdTomato indutível pode ser visualizada com sucesso por microscopia confocal. Após a exposição aos vasoconstritores, o PCLS demonstra a preservação tanto da contração do vaso quanto da estrutura pulmonar, que pode ser capturada por um módulo de lapso de tempo. Em combinação com os outros procedimentos, como a análise da mancha ocidental e do RNA, o PCLS pode contribuir para a compreensão abrangente das cascatas sinalizadoras que sustentam uma ampla variedade de distúrbios e levam a uma melhor compreensão da fisiopatologia em doenças vasculares pulmonares.
Introduction
Avanços na preparação e imagem do tecido pulmonar que preserva componentes celulares sem sacrificar a estrutura anatômica fornecem uma compreensão detalhada das doenças pulmonares. A capacidade de identificar proteínas, RNA e outros compostos biológicos, mantendo a estrutura fisiológica, oferece informações vitais sobre o arranjo espacial das células que podem ampliar a compreensão da fisiopatologia em inúmeras doenças pulmonares. Essas imagens detalhadas podem levar a uma melhor compreensão de doenças vasculares pulmonares, como a hipertensão arterial pulmonar, quando aplicadas a modelos animais, potencialmente levando a melhores estratégias terapêuticas.
Apesar dos avanços tecnológicos, a obtenção de imagens de alta qualidade do tecido pulmonar murino continua sendo um desafio. O ciclo respiratório é impulsionado por uma pressão intratorácica negativa gerada durante a inalação1. Ao tradicionalmente obter biópsias e preparar amostras pulmonares para imagem, o gradiente de pressão negativa é perdido resultando no colapso das vias aéreas e da vasculatura, que não se representa mais em seu estado atual. Para alcançar imagens realistas refletindo as condições atuais, as vias aéreas pulmonares devem ser reinfladas, e a vasculatura perfundida, transformando o pulmão dinâmico em uma luminária estática. A aplicação dessas técnicas distintas permite a preservação da integridade estrutural, vasculatura pulmonar e componentes celulares, incluindo células imunes, como macrófagos, permitindo que o tecido pulmonar seja visto o mais próximo possível de seu estado fisiológico.
O corte de precisão do corte pulmonar (PCLS) é uma ferramenta ideal para estudar a anatomia e a fisiologia da vasculatura pulmonar2. O PCLS fornece imagens detalhadas do tecido pulmonar em três dimensões, preservando componentes estruturais e celulares. O PCLS tem sido usado em modelos animais e humanos para permitir imagens vivas e de alta resolução de funções celulares em três dimensões, tornando-se uma ferramenta ideal para estudar potenciais alvos terapêuticos, medir a contração das pequenas vias aéreas e estudar a fisiopatologia de doenças pulmonares crônicas como DPOC, ILD e câncer de pulmão3. Utilizando técnicas semelhantes, a exposição de amostras de PCLS a vasoconstritores pode preservar a estrutura pulmonar e a contratilidade do vaso, replicando condições in vitro. Juntamente com a preservação da contratilidade, as amostras preparadas podem passar por análises adicionais, como sequenciamento de RNA, mancha ocidental e citometria de fluxo quando preparadas corretamente. Finalmente, as células rotuladas de cor repórter marcadas com fluorescência tdTomato após a colheita pulmonar podem preservar a rotulagem após o preparo de microslices, tornando-a ideal para estudos de rastreamento celular. A integração dessas técnicas proporciona um modelo sofisticado preservando o arranjo espacial das células e da contratude dos vasos que podem levar a uma compreensão mais detalhada das cascatas sinalizadoras e potenciais opções terapêuticas na doença da vasculatura pulmonar.
Neste manuscrito, o tecido pulmonar murino PCLS é exposto a vasoconstritores, demonstrando integridade estrutural preservada e contratlidade do vaso. O estudo demonstra que o tecido preparado e manuseado adequadamente pode permanecer viável por 10 dias. O estudo também demonstra a preservação de células com fluorescência endógena (tdTomato), permitindo que as amostras forneçam imagens de alta resolução da vasculatura pulmonar e da arquitetura. Finalmente, foram descritas formas de manusear e preparar fatias de tecido para a medição do RNA e da mancha ocidental para investigar mecanismos subjacentes.
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Protocol
Todos os cuidados com animais estavam de acordo com as diretrizes do Hospital Infantil de Boston e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovou protocolos. Os camundongos utilizados neste estudo são ratos do tipo selvagem C57/B6 e camundongos cruzados Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.
1. Preparação de soluções
- Prepare a solução tampão fosfato (1x PBS) e a solução de 2% de agarose necessária durante o experimento com antecedência.
- Misture 2 g de pó de agarose em 100 mL de água autoclavada. Aqueça-o no micro-ondas alguns segundos de cada vez até que a solução esteja clara.
- Coloque a solução em um banho de água a 42 °C até usar.
NOTA: Tanto o PBS quanto a 2% de agarose podem ser armazenados à temperatura ambiente por semanas.
2. Extração do pulmão do camundongo
- Eutanize o rato por overdose de isoflurane. Obter overdose de isoflurane colocando uma pequena quantidade de isoflurane no papel de tecido no nível inferior e colocando o rato no nível superior em um dessecador. O rato permanece no desiccator até inconsciente.
- Certifique-se da morte do mouse aplicando pressão inferior no pescoço e puxando caudal na cauda. Leve o mouse para a superfície de dissecação.
- Coloque o mouse na posição supina e fixe-o no lugar batendo patas e nariz à mesa com fita adesiva.
- Pulverize a superfície ventral do mouse com 70% de etanol e limpe o excesso de etanol.
- Levante a pele abdominal do camundongo com fórceps na localização da bexiga e corte na linha média com uma tesoura cirúrgica, movendo-se superiormente para a região cervical, expondo a traqueia.
- Levante a camada fascial subjacente com pinças e corte com tesoura cirúrgica para expor órgãos viscerais e compartimento mediastinal, cortando novamente inferiormente para superior.
- Corte o esterno no meio da linha para expor o coração e o pulmão.
- Usando dissecção sem cortes, retire o diafragma do fígado e do compartimento abdominal.
- Localize a veia cava inferior (IVC) sob os intestinos e corte o IVC.
- Localize o ventrículo direito.
NOTA: O ventrículo direito terá uma aparência mais leve em comparação com o ventrículo esquerdo e o septo intraventricular deve ser visualizado, separando o ventrículo direito do ventrículo esquerdo. - Injete 0,5 mL de heparina fracionada de 1% no ventrículo direito com uma agulha borboleta de 25-30 G e depois lave lentamente, mas firmemente com 10-15 mL de 1x PBS(Figura 1A).
- Tenha cuidado para não inserir a agulha através do coração e injetar heparina na cavidade mediastinal.
NOTA: A injeção de 1x PBS torna o tecido pulmonar branco. O fluido extravasado da aorta abdominal deve ser claro e incolor e o fígado pode ficar branco na aparência após o sucesso da descarga.
- Tenha cuidado para não inserir a agulha através do coração e injetar heparina na cavidade mediastinal.
- Localize a laringe e disseque a fáscia e o tecido ao redor usando pinças de ponta cega.
- Coloque a sutura cirúrgica sob a traqueia e amarre um nó cirúrgico.
- Coloque um pequeno orifício na traqueia superior à corda e canulate com agulha de 20 G sem corte.
- Aperte a sutura ao redor da agulha e da traqueia usando um nó cirúrgico.
- Injete 2,5-4 mL de agarose na traqueia e monitore a inflação do pulmão.
- Depois que a agarose é incutida, despeje frio, resfriado 1x PBS sobre o pulmão para solidificar a ágarose.
- Corte a traqueia superior à sutura cirúrgica e disseque o pulmão e o coração do mediastino removendo quaisquer aderências e fáscia.
- Após a solidificação, coloque em 1x DMEM (suficiente para submergir tecido) em uma placa de Petri para manter no gelo. Corte imediatamente um lobo usando uma máquina de vibratome(Figura 1B).
3. Cortes de precisão de fatias pulmonares
- Conecte a amostra à plataforma com supercola, mantendo o lado medial da amostra voltado para cima.
- Encha o recipiente de amostra com 1x PBS, garantindo que a amostra esteja completamente submersa.
- Encha o recipiente ao redor do recipiente de amostra com gelo para manter o PBS circundante e prove frio.
- Ligue o vibratome e ajuste-se às configurações desejadas abaixo.
- Coloque a espessura em 300um.
- Defina a frequência para 100 Hz.
- Defina a amplitude para 0,6 mm.
- Defina a velocidade para 5 μm/s.
- Usando uma chave Allen, gire o suporte da lâmina na posição segura e abra as mandíbulas para inserir uma lâmina.
- Aperte as mandíbulas com uma chave Allen e gire o suporte da lâmina na posição apropriada para cortar.
- Coloque a amostra e a plataforma sobre a caixa e deslize na frente da lâmina.
- Encha a caixa ao redor da plataforma de amostra com 1x PBS até que a amostra esteja submersa.
- Leve a lâmina vibratome até a borda do bloco e baixe manualmente a lâmina até que esteja mesmo com a parte superior da amostra.
- Confirme as configurações apropriadas e execute o vibratome(Figura 2).
- À medida que as fatias frescas são cortadas, remova as amostras do PBS e coloque-as em uma placa de Petri estéril com 10 mL de 1x DMEM contendo 1x antibiótico-antimíctico.
- Quando terminar, retraia a lâmina inteiramente e, em seguida, use a chave Allen para levantar a lâmina em uma posição segura.
- Armazene as amostras em 1x DMEM em uma incubadora a 37 °C com viabilidade preservada por até 10 dias (veja experiência de viabilidade abaixo).
4. Exemplo de experimento vasoconstritor
- Coloque uma fatia de vibratome em um slide de microscópio.
- Antes de colocá-lo no slide, use uma limpeza para se livrar do meio de excesso (PBS).
- Coloque a amostra sob microscopia de contraste de fase e use ampliação de 10-20x para identificar um vaso.
- Coloque 500 μL de vasoconstritores, como 60 mM KCl ou 1 μM Endothelin-1 para submergir completamente o slide.
- Observe e capture o vídeo gravando para 30 s-60 s(Vídeo 1).
5. Preparando o tecido para RNA ou lise proteica no PCLS
- Antes de começar o experimento, encha uma pequena caixa de espuma de poliestireno com 1 L de nitrogênio líquido.
- Coloque dois pequenos tubos de microcentrifuutura (1,5 mL) no recipiente com nitrogênio líquido antes de iniciar.
NOTA: O nitrogênio líquido deve esfriar fora dos tubos, no entanto, não estar dentro. Certifique-se de manusear nitrogênio líquido com cuidado e não exponha a pele a nitrogênio líquido. Use fórceps e luvas para colocar e remover tubos da caixa. - Coloque 4-5 fatias frescas de vibratome em uma tigela de argamassa.
- Despeje 5-10 mL de líquido N2 em cima das fatias na tigela de argamassa.
- Use rapidamente o pilão para moer as fatias de congelamento de flash em pó antes que o nitrogênio líquido evapore.
NOTA: O tecido deve condensar em um pó fino. Se não, adicione nitrogênio líquido adicional até ser alcançado. - Usando um scooper de laboratório de aço (pré-eded com nitrogênio líquido), colher o pó nos dois tubos de microcentrifuuge refrigerados.
- Lise o pó adicionando 500 μL de reagente de extração de RNA para prosseguir com o isolamento de RNA ou 500 μL de tampão RIPA (contém 1x inibidores de protease) para prosseguir com a lise proteica.
- Armazene as amostras a -80 °C até o isolamento adicional do RNA, medição de BCA e mancha ocidental.
6. Determinando a viabilidade
- Após a preparação do vibratome, coloque duas fatias pulmonares em uma placa de cultura de 24 poços com 450 μL de mídia DMEM e 50 μL de reagente de viabilidade celular (certifique-se de que o tecido está totalmente submerso).
- Coloque as amostras de volta em 5% de CO2 a 37 °C da incubadora durante a noite com exposição mínima à luz.
- Pela manhã, observe a solução para a mudança de cor. A solução azul fica rosa quando o tecido é viável.
7. Preservação da rotulagem celular
- Trate um Cdh5-CreERT2 transgênico cruzado com o mouse Ai14 tdTomato com uma injeção IP de Tamoxifen (2 mg/dia) por um total de 5 dias (dose total de 10 mg tamoxifen) para induzir células positivas de rótulo TdTomato.
- Uma semana após a injeção, prepare os pulmões usando os passos acima 1 a 3.
- Após a preparação da fatia pulmonar cortada com precisão, coloque o tecido em uma lâmina de microscópio e coloque uma mancha de cobertura em cima do tecido.
- Use um microscópio confocal para detectar a coloração do TdTomato (usando comprimento de onda de excitação 555 nm).
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Representative Results
Quando adicionado às células ou tecidos, o reagente de viabilidade é modificado pelo ambiente redutor do tecido viável e fica rosa/vermelho, tornando-se altamente fluorescente. As alterações de cor representativas detectadas a partir do dia 0-1 e do dia 9-10 são demonstradas na Figura 3. Como observado, a solução começou azul e ficou rosa da noite para o dia, demonstrando viabilidade. A mudança de cor normalmente ocorre dentro de 1-4 h; no entanto, um tempo maior pode ser necessário. Para avaliar a viabilidade, um leitor de placas foi usado para determinar a absorção de uma amostra preparada por vibratome e uma fatia pulmonar fixa de 4% PFA, servindo como controle. As soluções em que as amostras foram incubadas foram lidas com uma absorção de 562 nm e 630 nm seguindo a recomendação do fabricante. A diferença diária entre a absorvância em 562 nm e 630 nm de comprimento de onda para o tecido preparado por vibratome e comparação com o tecido de controle são mostradas na Figura 3.
Para demonstrar a contrariedade do tecido pulmonar preparado por vibratome, um novo pedaço de tecido foi colocado sob o microscópio de campo brilhante em 400x e tratado usando KCL ou Endothelian-1 até que o tecido fosse submerso. Um vídeo feito acima de 30-60 s do tecido revela a constrição da vasculatura (Vídeo 1).
Para demonstrar a preservação da rotulagem celular 1 semana após a injeção de tamoxifen, as fatias pulmonares obtidas após a seção de vibratome utilizando o protocolo acima foram observadas sob um microscópio confocal. A rotulagem tdTomato nas fatias pulmonares é demonstrada na Figura 4.
Figura 1: Preparação do tecido pulmonar murino para seção de vibratome. (A) O RV é canulado com uma agulha borboleta 30G para facilitar a troca de soluções de Heparin para PBS. (B) Os lóbulos pulmonares inteiros após a inflação de agarose Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Fatias pulmonares usando seção vibratome. Espessura: 300 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Experiência de viabilidade para fatias de PCLS do dia 1º ao dia 10. (A) Imagens representativas da mudança de cor do reagente do tecido preparado para PCLS versus tecido fixo pfa de 4%. Tecido PCLS fresco e 4% de tecido PFA fixo foram colocados em 450 μL de mídia tecidual e 50 μL de reagente de viabilidade. Solução de cor inicialmente roxo, como pode ser visto no dia 0 e dia 9. Após a incubação da noite para o dia, a solução contendo tecidos PCLS recém-preparados mudou para cor roxa/rosa (Dia 1 e Dia 10) devido ao ambiente redutor de tecidos vivos. (B) Quantificação da viabilidade do PCLS do dia 1 ao dia 10 pela razão da absorvância em 562 nm e 630 nm com leitor de placas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Demonstração de células tdTomato preservadas rotulagem após a colheita. A preparação do PCLS é de um mouse transgênico Cdh5-tdT. Barra de escala = 20 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Constrição de vasos usando Endothelin-1 no PCLS. Os camundongos wildtype C57/B6 são inflados com 1,5 mL de 1,5% de agarose e seccionados em 130 μm usando um vibratome. Um pedaço fresco de tecido foi colocado sob o microscópio de campo brilhante em 400x e tratado usando KCL ou Endothelian-1. Ampliação: 400x. Clique aqui para baixar este Vídeo.
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Discussion
Neste manuscrito, descreve-se um método aprimorado para produzir imagens de alta resolução do tecido pulmonar murino que preserva a estrutura vascular e otimiza a flexibilidade experimental, utilizando especificamente a aplicação do PCLS para obter microsapos de tecido pulmonar que podem ser visualizados em três dimensões com contrariedade preservada da vasculatura. Usando o reagente de viabilidade, o protocolo demonstra que fatias cuidadosamente preparadas e preservadas podem reter viabilidade por mais de uma semana. A viabilidade preservada das microslices permite a possibilidade de experimentos múltiplos e prolongados serem realizados em vasculatura e estruturas das vias aéreas, tornando-se uma amostra ideal para testar a resposta ex vivo de múltiplas drogas, avaliar mecanismos moleculares subjacentes e testar reagentes. Isso faz das amostras preparadas a plataforma ideal para estudar potenciais efeitos terapêuticos no tom vascular antes dos ensaios in vivo 4. A preservação das vias aéreas pulmonares e da vasculatura permite que amostras preparadas sejam tratadas com técnicas adicionais, como testes de contraditude descritos neste artigo e resumidos na Tabela 1. Isso permite a oportunidade de fornecer imagens de alta resolução detalhando o arranjo espacial da vasculatura pulmonar e sinalizando cascatas, contribuindo para a patogênese de doenças vasculares pulmonares.
A preparação de microslices teciduais para experimentação é uma técnica que usa uma vibratome, ou lâmina vibrante, para produzir fatias organotipicas cortadas com precisão. Isso permite maior precisão e reprodutibilidade em comparação com as técnicas tradicionais5. Microslices dos pulmões obtidas com PCLS mantêm a estrutura fisiológica do tecido pulmonar a um nível celular, tornando-se uma ferramenta útil para estudar uma variedade de doenças vasculares pulmonares. A tecnologia tem sido utilizada em modelos animais e humanos para estudar a complexa anatomia pulmonar e patologia pulmonar, com foco específico em exposições tóxicas, doenças infecciosas e estudos imunológicos6,7,8. Dependendo da fisiopatologia subjacente, microslices podem ser obtidas dos lóbulos específicos de interesse ou um/todos os lóbulos para comparar a heterogeneidade da doença. Fatias muito finas resultam em dificuldade em preservar a integridade estrutural, enquanto fatias mais grossas podem ser mais difíceis de realizar colorações adicionais ou profundas em imagens de tecido.
Específico para doenças vasculares, o PCLS tem sido utilizado para estudar a hipertensão arterial pulmonar (APS), permitindo um modelo sofisticado para analisar os efeitos das terapias potenciais9,10,11. A preservação da contratilidade vascular em amostras de pulmão murinas tem inúmeros benefícios terapêuticos e investigacionais. Ao incorporar uma técnica que preserva tanto a estrutura quanto a contratilidade da vasculatura pulmonar, amostras preparadas podem modelar doença vascular pulmonar ex vivo. Isso foi demonstrado no passado por Rieg et al., que com amostras de PCLS foram capazes de demonstrar que as veias pulmonares eram mais sensíveis com agonistas agonistas e b2-agonistas, sugerindo que o uso desses medicamentos na insuficiência cardíaca esquerda pode causar aumento do edema pulmonar12. Utilizando esse modelo para estudar os efeitos dos medicamentos, o ex vivo ajuda a identificar os potenciais agentes terapêuticos para possíveis ensaios clínicos. Neste manuscrito, o protocolo descreve métodos para manusear e armazenar o tecido com viabilidade preservada por 10 dias, permitindo o monitoramento de tecidos após possíveis intervenções e oferece maior flexibilidade experimental. Estudos anteriores aplicaram métodos semelhantes para preservar a contratilidade das vias aéreas em modelos de asma, com o efeito IL-13 persistindo por até 15 dias3. A imunosstaining de RNA e citocinas pode levar a uma melhor compreensão da patogênese subjacente responsável pela progressão e desenvolvimento da doença em várias doenças vasculares. As amostras preparadas podem reter rotulagem celular após a preparação, demonstrada neste manuscrito com a preservação de células endoteliais rotuladas de TDH5+. A preservação dessa rotulagem em amostras preparadas com vibratome permite que a estrutura seja preservada juntamente com a rotulagem celular, tornando-a uma ferramenta ideal para realizar experimentos de rastreamento celular. Finalmente, as amostras preparadas são suscetíveis a investigações mais aprofundadas, como lise de RNA ou mancha ocidental descrita neste protocolo para estudar melhor a fisiopatologia subjacente e os mecanismos que causam a progressão da doença.
Apesar de suas vantagens para outras técnicas, há limitações ao tecido preparado pelo PCLS. A realização do PCLS transforma o pulmão dinâmico em uma luminária estática, fornecendo um instantâneo no tempo das células e moléculas presentes no tecido pulmonar no momento da biópsia. A menos que inúmeras amostras sejam obtidas, não contabiliza a grande heterogeneidade comumente vista em muitas doenças pulmonares, como a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Os tecidos preparados com PCLS são limitados principalmente a pequenas vias aéreas e doenças dos vasos. Isso se deve aos desafios técnicos com a colheita de tecidos, já que a traqueia é tipicamente incisada pela inflação pulmonar e identificar e isolar grandes brônquios é um desafio. Essas limitações técnicas tornam o uso do tecido PCLS subótimo para estudar brônquios maiores e as vias aéreas condutoras. Os testes dinâmicos também são limitados, tornando-se uma plataforma menos que ideal para estudar doenças pulmonares associadas ao ventilador e barotrauma. Finalmente, a aplicação do PCLS no campo da pneumologia tem se concentrado principalmente no tecido pulmonar murino, e mais testes e protocolos são necessários antes de serem aplicados ao tecido humano em um cenário clinicamente relevante.
Em resumo, o manuscrito fornece um método complementar preservando a contrailidade vascular do tecido pulmonar murino PCLS, resultando em imagens de alta resolução da vasculatura pulmonar por até 10 dias que contém células fluorescentes endógenas e inúmeros outros procedimentos.
Tabela 1: Característica e usos de vários vasoconstritores. (*utilizado neste estudo) Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Yuan Hao e Kaifeng Liu pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado por um NIH 1R01 HL150106-01A1, a Parker B. Francis Fellowship, e o Prêmio de Pesquisa da Associação de Hipertensão Pulmonar Aldrighetti ao Dr. Ke Yuan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
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