Cortes pulmonares de corte de precisión como herramienta eficiente para estudios ex vivo de estructura de vasos pulmonares y contractilidad

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para preservar la contractilidad vascular del tejido pulmonar murino PCLS, lo que resulta en una imagen tridimensional sofisticada de la vasculatura pulmonar y las vías respiratorias, que se puede preservar hasta por 10 días que es susceptible a numerosos procedimientos.

Resumen

La visualización del tejido pulmonar murino proporciona información estructural y celular valiosa sobre la vía aérea subyacente y la vasculatura. Sin embargo, la preservación de los vasos pulmonares que realmente representa las condiciones fisiológicas todavía presenta desafíos. Además, la delicada configuración de los pulmones murinos resulta en desafíos técnicos al preparar muestras para imágenes de alta calidad que preservan tanto la composición celular como la arquitectura. Del mismo modo, se pueden realizar ensayos de contractilidad celular para estudiar el potencial de las células para responder a los vasoconstrictores in vitro,pero estos ensayos no reproducen el entorno complejo del pulmón intacto. En contraste con estos problemas técnicos, el método de corte pulmonar cortado con precisión (PCLS) se puede aplicar como una alternativa eficiente para visualizar el tejido pulmonar en tres dimensiones sin sesgo regional y servir como un modelo de contractilidad sustituto vivo durante hasta 10 días. El tejido preparado mediante PCLS ha conservado la estructura y la orientación espacial, por lo que es ideal para estudiar los procesos de la enfermedad ex vivo. La ubicación de las células endógenas tdTomato-labeladas en PCLS cosechadas de un modelo murino inducible tdTomato reporter se puede visualizar con éxito mediante microscopía confocal. Después de la exposición a vasoconstrictores, PCLS demuestra la preservación tanto de la contractilidad de los vasos como de la estructura pulmonar, que puede ser capturada por un módulo de lapso de tiempo. En combinación con los otros procedimientos, como el análisis de western blot y ARN, PCLS puede contribuir a la comprensión integral de las cascadas de señalización que subyacen a una amplia variedad de trastornos y conducir a una mejor comprensión de la fisiopatología en las enfermedades vasculares pulmonares.

Introducción

Los avances en la preparación e imagen del tejido pulmonar que preserva los componentes celulares sin sacrificar la estructura anatómica proporcionan una comprensión detallada de las enfermedades pulmonares. La capacidad de identificar proteínas, ARN y otros compuestos biológicos mientras se mantiene la estructura fisiológica ofrece información vital sobre la disposición espacial de las células que puede ampliar la comprensión de la fisiopatología en numerosas enfermedades pulmonares. Estas imágenes detalladas pueden conducir a una mejor comprensión de las enfermedades vasculares pulmonares, como la hipertensión arterial pulmonar, cuando se aplican a modelos animales, lo que potencialmente conduce a mejores estrategias terapéuticas.

A pesar de los avances en la tecnología, la obtención de imágenes de alta calidad del tejido pulmonar murino sigue siendo un desafío. El ciclo respiratorio es impulsado por una presión intratorácica negativa generada durante la inhalación¹. Cuando tradicionalmente se obtienen biopsias y se preparan muestras de pulmón para la obtención de imágenes, el gradiente de presión negativa se pierde, lo que resulta en el colapso de la vía aérea y la vasculatura, que ya no se representa en su estado actual. Para lograr imágenes realistas que reflejen las condiciones actuales, las vías respiratorias pulmonares deben volver a inflarse y la vasculatura perfundirse, cambiando el pulmón dinámico en un accesorio estático. La aplicación de estas técnicas distintas permite la preservación de la integridad estructural, la vasculatura pulmonar y los componentes celulares, incluidas las células inmunes como los macrófagos, lo que permite que el tejido pulmonar se vea lo más cerca posible de su estado fisiológico.

El corte pulmonar de precisión (PCLS) es una herramienta ideal para estudiar la anatomía y fisiología de la vasculatura pulmonar². PCLS proporciona imágenes detalladas del tejido pulmonar en tres dimensiones al tiempo que preserva los componentes estructurales y celulares. PCLS se ha utilizado en modelos animales y humanos para permitir imágenes vivas y de alta resolución de las funciones celulares en tres dimensiones, lo que lo convierte en una herramienta ideal para estudiar posibles objetivos terapéuticos, medir la contracción de las vías respiratorias pequeñas y estudiar la fisiopatología de enfermedades pulmonares crónicas como la EPOC, la EPI y el cáncer de pulmón³. Utilizando técnicas similares, la exposición de muestras de PCLS a vasoconstrictores puede preservar la estructura pulmonar y la contractilidad de los vasos, replicando las condiciones in vitro. Además de preservar la contractilidad, las muestras preparadas pueden someterse a análisis adicionales, como la secuenciación de ARN, Western blot y citometría de flujo cuando se preparan correctamente. Finalmente, las células marcadas con tdTomato marcadas con fluorescencia de tdTomato después de la cosecha pulmonar pueden preservar el etiquetado después de preparar microslices, lo que lo hace ideal para estudios de seguimiento celular. La integración de estas técnicas proporciona un modelo sofisticado que preserva la disposición espacial de las células y la contractilidad de los vasos que puede conducir a una comprensión más detallada de las cascadas de señalización y las posibles opciones terapéuticas en la enfermedad de la vasculatura pulmonar.

En este manuscrito, el tejido pulmonar murino PCLS se expone a vasoconstrictores, lo que demuestra la integridad estructural preservada y la contractilidad de los vasos. El estudio demuestra que el tejido preparado y manipulado adecuadamente puede permanecer viable durante 10 días. El estudio también demuestra la preservación de células con fluorescencia endógena (tdTomato), lo que permite a las muestras proporcionar imágenes de alta resolución de la vasculatura pulmonar y la arquitectura. Finalmente, se han descrito formas de manejar y preparar rodajas de tejido para la medición de ARN y Western blot para investigar los mecanismos subyacentes.

Protocolo

Todo el cuidado de los animales estaba de acuerdo con las pautas del Boston Children's Hospital y los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Los ratones utilizados en este estudio son ratones salvajes tipo C57/B6 y ratones cruzados Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.

1. Preparación de soluciones

1. Prepare la solución tampón de fosfato (1x PBS) y la solución de agarosa al 2% requerida durante el experimento con anticipación.
   1. Mezcle 2 g de polvo de agarosa en 100 ml de agua en autoclave. Calentar en el microondas unos segundos a la vez hasta que la solución esté clara.
   2. Coloque la solución en un baño de agua a 42 °C hasta su uso.
      NOTA: Tanto el PBS como la agarosa al 2% se pueden almacenar a temperatura ambiente durante semanas.

2. Extracción del pulmón del ratón

1. Eutanasia al ratón por sobredosis de isoflurano. Lograr la sobredosis de isoflurano colocando una pequeña cantidad de isoflurano sobre papel tisú en el nivel inferior y colocando el ratón en el nivel superior en un desecador. El ratón permanece en el desecador hasta quedar inconsciente.
2. Asegure la muerte del ratón aplicando una presión inferior en el cuello y tirando de la caudal en la cola. Lleve el ratón a la superficie de disección.
3. Coloque el ratón en posición supina y asegúrelo en su lugar pegando las patas y la nariz a la mesa con cinta adhesiva.
4. Rocíe la superficie ventral del ratón con etanol al 70% y limpie el exceso de etanol.
5. Levante la piel abdominal del ratón con pórceps en la ubicación de la vejiga y corte en la línea media con tijeras quirúrgicas, moviéndose superiormente a la región cervical, exponiendo la tráquea.
6. Levante la capa fascial subyacente con pinzas y corte con tijeras quirúrgicas para exponer los órganos viscerales y el compartimiento mediastínico, nuevamente cortando inferiormente a superior.
7. Corte el esternón en la línea media para exponer el corazón y el pulmón.
8. Usando disección contundente, separe el diafragma del hígado y el compartimiento abdominal.
9. Localice la vena cava inferior (IVC) debajo de los intestinos y corte la IVC.
10. Localice el ventrículo derecho.
    NOTA: El ventrículo derecho tendrá un aspecto más ligero en comparación con el ventrículo izquierdo y se debe visualizar el tabique intraventricular, separando el ventrículo derecho del ventrículo izquierdo.
11. Inyecte 0,5 ml de heparina fraccionada al 1% en el ventrículo derecho con una aguja de mariposa de 25-30 G y luego enjuague lenta pero constantemente con 10-15 ml de 1x PBS(Figura 1A).
    1. Tenga cuidado de no insertar la aguja a través del corazón e inyectar heparina en la cavidad mediastínica.
       NOTA: La inyección de 1x PBS vuelve el tejido pulmonar blanco. El líquido que extravasa de la aorta abdominal debe ser claro e incoloro y el hígado puede volverse blanco en apariencia después de un enrojecimiento exitoso.
12. Localice la laringe y diseccione la fascia y el tejido circundantes con pinzas de punta roma.
13. Coloque la sutura quirúrgica debajo de la tráquea y ate libremente un nudo quirúrgico.
14. Coloque un pequeño orificio en la tráquea superior a la cuerda y canula con una aguja roma de 20 G.
15. Apriete la sutura alrededor de la aguja y la tráquea con un nudo quirúrgico.
16. Inyecte 2.5-4 ml de agarosa en la tráquea y controle la inflación del pulmón.
17. Después de inculcar la agarosa, vierta 1x PBS frío y frío sobre el pulmón para solidificar la agarosa.
18. Cortar la tráquea superior a la sutura quirúrgica y diseccionar el pulmón y el corazón del mediastino mediante la eliminación de las adherencias y la fascia.
19. Después de la solidificación, coloque 1x DMEM (suficiente para sumergir el tejido) en una placa de Petri para mantenerse en hielo. Corte inmediatamente un lóbulo usando una máquina vibratome (Figura 1B).

3. Cortes de pulmón cortados con precisión

1. Conecte la muestra a la plataforma con superpegamento, manteniendo el lado medial de la muestra hacia arriba.
2. Llene el recipiente de la muestra con 1x PBS, asegurándose de que la muestra esté completamente sumergida.
3. Llene el recipiente que rodea el recipiente de muestra con hielo para mantener el PBS circundante y la muestra fría.
4. Encienda el vibratome y ajuste a la configuración deseada a continuación.
   1. Establezca el grosor en 300um.
   2. Ajuste la frecuencia a 100 Hz.
   3. Ajuste la amplitud a 0,6 mm.
   4. Ajuste la velocidad a 5 μm/s.
5. Con una llave Allen, gire el soporte de la cuchilla en la posición segura y abra las mandíbulas para insertar una cuchilla.
6. Apriete las mandíbulas con una llave Allen y gire el soporte de la cuchilla en la posición adecuada para cortar.
7. Coloque la muestra y la plataforma en la caja y deslícese frente a la cuchilla.
8. Llene la caja alrededor de la plataforma de muestra con 1x PBS hasta que la muestra esté sumergida.
9. Lleve la cuchilla del vibratomo hasta el borde del bloque y baje manualmente la cuchilla hasta que esté uniforme con la parte superior de la muestra.
10. Confirme la configuración adecuada y ejecute el vibratomo (Figura 2).
11. A medida que se cortan las rodajas frescas, retire las muestras del PBS y colóquelas en una placa de Petri estéril con 10 ml de 1x DMEM que contenga 1x antibiótico-antimicótico.
12. Cuando termine, retraiga la cuchilla por completo y luego use la llave Allen para elevar la cuchilla a una posición segura.
13. Almacene las muestras en 1x DMEM en una incubadora a 37 °C con viabilidad conservada durante un hasta 10 días (consulte el experimento de viabilidad a continuación).

4. Ejemplo de experimento vasoconstrictor

1. Coloque una rebanada de vibratomo en un portaobjetos de microscopio.
2. Antes de colocarlo en el portaobjetos, use una toallita de limpieza para deshacerse del exceso de medio (PBS).
3. Coloque la muestra bajo microscopía de contraste de fase y use un aumento de 10-20x para identificar un vaso.
4. Coloque 500 μL de vasoconstrictores, como 60 mM KCl o 1 μM Endothelin-1 para sumergir completamente el portaobjetos.
5. Observe y capture el video grabando durante 30 s-60 s (Video 1).

5. Preparación del tejido para la lisis de ARN o proteínas en PCLS

1. Antes de comenzar el experimento, llene una pequeña caja de espuma de poliestireno con 1 L de nitrógeno líquido.
2. Coloque dos tubos pequeños de microcentrífuga (1,5 ml) en el recipiente con nitrógeno líquido antes de comenzar.
   NOTA: El nitrógeno líquido debe enfriarse fuera de los tubos, sin embargo, no debe estar dentro. Asegúrese de manejar el nitrógeno líquido con cuidado y no exponga la piel al nitrógeno líquido. Use forrceps y guantes para colocar y quitar los tubos de la caja.
3. Coloque 4-5 rodajas frescas de vibratomo en un tazón de mortero.
4. Vierta 5-10 ml de N2 líquido sobre las rebanadas en el tazón de mortero.
5. Use rápidamente el mortero para moler las rodajas de congelación flash en polvo antes de que el nitrógeno líquido se evapore.
   NOTA: El tejido debe condensarse en un polvo fino. De lo contrario, agregue nitrógeno líquido adicional hasta que se logre.
6. Usando una cuchara de laboratorio de acero (preenfriada con nitrógeno líquido), cuchara el polvo en los dos tubos de microcentrífuga refrigerados.
7. Lise el polvo agregando 500 μL de reactivo de extracción de ARN para proceder con el aislamiento de ARN o 500 μL de tampón RIPA (contiene 1x inhibidores de la proteasa) para proceder con la lisis de proteínas.
8. Almacene las muestras a -80 °C hasta el aislamiento adicional de ARN, la medición de BCA y el western blot.

6. Determinación de la viabilidad

1. Después de la preparación del vibratomo, coloque dos rodajas de pulmón en una placa de cultivo de 24 pozos con 450 μL de medios DMEM y 50 μL de reactivo de viabilidad celular (asegúrese de que el tejido esté sumergido por completo).
2. Vuelva a colocar las muestras en una incubadora de CO_{2 al 5%} a 37 °C durante la noche con una exposición mínima a la luz.
3. Por la mañana, observe la solución para el cambio de color. La solución azul se vuelve rosa cuando el tejido es viable.

7. Conservación del etiquetado celular

1. Tratar un Cdh5-CreERT2 transgénico cruzado con ratón Ai14 tdTomato con una inyección IP de Tamoxifeno (2 mg/día) durante un total de 5 días (dosis total 10 mg Tamoxifeno) para inducir tdTomato etiqueta células Cre positivas.
2. Una semana después de la inyección, prepare los pulmones usando los pasos anteriores 1 a 3.
3. Después de la preparación de la rodaja de pulmón cortada con precisión, coloque el tejido en un portaobjetos de microscopio y coloque una funda en la parte superior del tejido.
4. Utilice un microscopio confocal para detectar la tinción de tdTomato (utilizando la longitud de onda de excitación de 555 nm).

Resultados

Cuando se agrega a las células o tejidos, el reactivo de viabilidad se modifica por el entorno reductor del tejido viable y se vuelve rosa / rojo, volviéndose altamente fluorescente. Los cambios de color representativos detectados desde el día 0-1 y el día 9-10 se demuestran en la Figura 3. Como se señaló, la solución comenzó de color azul y se volvió rosa durante la noche, demostrando viabilidad. El cambio de color generalmente ocurre dentro de 1-4 h; sin embargo, puede ser necesario un tie...

Discusión

En este manuscrito se describe un método mejorado para producir imágenes de alta resolución del tejido pulmonar murino que preserva la estructura vascular y optimiza la flexibilidad experimental, utilizando específicamente la aplicación de PCLS para obtener microslices de tejido pulmonar que se pueden ver en tres dimensiones con contractilidad preservada de la vasculatura. Utilizando el reactivo de viabilidad, el protocolo demuestra que las rodajas cuidadosamente preparadas y conservadas pueden conservar la viabilidad du...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,5 cc de heparina fraccionada en jeringa	BD	100 unidades USP por mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
Aguja de punta roma de calibre 20 1/2 pulgadas para canulación de tráquea	Cml Supply	90120050D
jeringa de 30cc	BD	309650
Anti Anti solución	Gibco	15240096
Microtomo de cuchilla vibratoria automatizada	Leica	VT1200S
Reactivo de viabilidad celular (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco' s Modified Eagle Medium y GLutaMAX, suplementados con 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelina-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortero	Amazon
RIPA tampón de lisis y extracción	Thermoscientific	89900
Sutura quirúrgica 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reactivo	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Juego de extracción de sangre con alas (aguja de mariposa) 25-30G	BD	25-30G