Cortes pulmonares de corte de precisión como herramienta eficiente para estudios ex vivo de estructura de vasos pulmonares y contractilidad

Timothy Klouda; Hyunbum Kim; Jiwon Kim; Gary Visner; Ke Yuan

doi:10.3791/62392

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Artículo de método

Cortes pulmonares de corte de precisión como herramienta eficiente para estudios ex vivo de estructura de vasos pulmonares y contractilidad

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DOI:

10.3791/62392

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24 de mayo de 2021

Timothy Klouda¹ , Hyunbum Kim¹ , Jiwon Kim¹ , Gary Visner¹ , Ke Yuan¹

¹Divisions of Pulmonary Medicine, Boston Children's Hospital

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para preservar la contractilidad vascular del tejido pulmonar murino PCLS, lo que resulta en una imagen tridimensional sofisticada de la vasculatura pulmonar y las vías respiratorias, que se puede preservar hasta por 10 días que es susceptible a numerosos procedimientos.

Resumen

La visualización del tejido pulmonar murino proporciona información estructural y celular valiosa sobre la vía aérea subyacente y la vasculatura. Sin embargo, la preservación de los vasos pulmonares que realmente representa las condiciones fisiológicas todavía presenta desafíos. Además, la delicada configuración de los pulmones murinos resulta en desafíos técnicos al preparar muestras para imágenes de alta calidad que preservan tanto la composición celular como la arquitectura. Del mismo modo, se pueden realizar ensayos de contractilidad celular para estudiar el potencial de las células para responder a los vasoconstrictores in vitro,pero estos ensayos no reproducen el entorno complejo del pulmón intacto. En contraste con estos problemas técnicos, el método de corte pulmonar cortado con precisión (PCLS) se puede aplicar como una alternativa eficiente para visualizar el tejido pulmonar en tres dimensiones sin sesgo regional y servir como un modelo de contractilidad sustituto vivo durante hasta 10 días. El tejido preparado mediante PCLS ha conservado la estructura y la orientación espacial, por lo que es ideal para estudiar los procesos de la enfermedad ex vivo. La ubicación de las células endógenas tdTomato-labeladas en PCLS cosechadas de un modelo murino inducible tdTomato reporter se puede visualizar con éxito mediante microscopía confocal. Después de la exposición a vasoconstrictores, PCLS demuestra la preservación tanto de la contractilidad de los vasos como de la estructura pulmonar, que puede ser capturada por un módulo de lapso de tiempo. En combinación con los otros procedimientos, como el análisis de western blot y ARN, PCLS puede contribuir a la comprensión integral de las cascadas de señalización que subyacen a una amplia variedad de trastornos y conducir a una mejor comprensión de la fisiopatología en las enfermedades vasculares pulmonares.

Introducción

Los avances en la preparación e imagen del tejido pulmonar que preserva los componentes celulares sin sacrificar la estructura anatómica proporcionan una comprensión detallada de las enfermedades pulmonares. La capacidad de identificar proteínas, ARN y otros compuestos biológicos mientras se mantiene la estructura fisiológica ofrece información vital sobre la disposición espacial de las células que puede ampliar la comprensión de la fisiopatología en numerosas enfermedades pulmonares. Estas imágenes detalladas pueden conducir a una mejor comprensión de las enfermedades vasculares pulmonares, como la hipertensión arterial pulmonar, cuando se aplican a modelos animales,....