Métodos cuantitativos para estudiar la actividad de la arginina metiltransferasa de la proteína 1-9 en células

Resumen

Estos protocolos proporcionan la metodología utilizada para evaluar la actividad enzimática de los miembros individuales de la familia de la proteína arginina metiltransferasa (PRMT) en las células. Las pautas detalladas en la evaluación de actividad de PRMT usando los biomarkers endógenos y exógenos, los anticuerpos de reconocimiento de la metílico-arginina, y los compuestos de la herramienta del inhibidor se describen.

Resumen

Las metiltransferasas de la proteína (PRMTs) catalizan la transferencia de un grupo metílico a los residuos de la arginina de las proteínas del substrato. La familia PRMT consiste en nueve miembros que pueden monomethylate o simétricamente/asimétrico dimethylate residuos de arginina. Varios anticuerpos que reconocen diversos tipos de metilación de la arginina de varias proteínas están disponibles; por lo tanto, proporcionando herramientas para el desarrollo de ensayos de biomarcadores de actividad PRMT. Los ensayos basados en anticuerpos PRMT son desafiantes debido a la superposición de sustratos y especificidades de anticuerpos basados en motivos. Estas ediciones y la configuración experimental para investigar la metilación de la arginina aportada por PRMTs individuales se discuten. A través de la cuidadosa selección de los sustratos representativos que son biomarcadores para ocho de cada nueve PRMTs, se diseñó un panel de ensayos de actividad prmt. Aquí, los protocolos para los análisis celulares que miden cuantitativo la actividad enzimática de los miembros individuales de la familia de PRMT en células se divulgan. La ventaja de los métodos descritos es su rendimiento directo en cualquier laboratorio con cultivo celular y capacidades fluorescentes de western blot. La especificidad del sustrato y la fiabilidad de anticuerpos elegida se validaron completamente con enfoques de derribo y sobreexpresión. Además de las directrices detalladas de los biomarcadores y anticuerpos del ensayo, también se proporciona información sobre el uso de una colección de compuestos de herramientas inhibidoras para los PRMTs.

Introducción

La metilación de arginina es una modificación postraduccional importante que regula las interacciones proteína-proteína y proteína-ARN, jugando así un papel importante en diversos procesos celulares como el empalme pre-ARNm, el daño en el ADN, la respuesta a la transcripción y la transducción mediada por factores de crecimiento^1,2. La arginina es metilada por la proteína arginina metiltransferasas (PRMTs) dando como resultado monometil arginina (Rme1), dimetilarginina asimétrica (Rme2a), o dimetilarginina simétrica (Rme2s)³. Sobre la base del tipo de metilación, los PRMTs se clasifican en tres grupos: Tipo I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 y 8), que catalizan la dimetilación mono y asimétrica; Tipo II (PRMT5 y PRMT9), que catalizan la dimetilación mono y simétrica; y tipo III (PRMT7), que sólo puede monometilar arginina³.

Debido a un número cada vez mayor de anticuerpos metilación-específicos de la arginina disponibles en el comercio, la actividad de PRMT se puede medir usando borrar occidental. Western blot de base fluorescente es la técnica preferida sobre la detección quimioluminiscente debido a un mayor rango dinámico y linealidad, mayor sensibilidad y que permite la multiplexación^4. Para cuantificar los niveles de metilación de proteínas, se requiere la normalización de la señal de metilación a los niveles totales de proteínas. Al elegir los anticuerpos para la proteína total y metilada criada en diferentes especies huésped (por ejemplo, ratón y conejo), se pueden utilizar anticuerpos secundarios etiquetados con diferentes fluoróforos y la señal para ambos anticuerpos se puede determinar en la misma banda de muestra. Los anticuerpos de la Metil-arginina fueron desarrollados para identificar y para caracterizar las proteínas monomethylated, asimétrico, o dimethylated simétricamente donde la metílico-arginina se encuentra en un contexto específico. Dado que la mayoría de los PRMTs metilan motivos ricos en glicina y arginina dentro de sus sustratos^5,se levantaron varios anticuerpos para los péptidos que contenían monometil o repeticiones asimétricas, simétricas de dimetil-arginina-glicina como D5A12, ASYM24 o ASYM25 y SYM11, respectivamente. Otros anticuerpos metil-arginina fueron generados contra una biblioteca peptídica que contenía dimetil- y monometil arginina asimétrica y monometil en un contexto de repetición facilitando la detección de metil-arginina en estos contextos particulares^6. También hay un número creciente de anticuerpos que reconocen la marca específica de la arginina en una sola proteína que permita la detección selectiva de metilación tal como histona H4R3me2a o BAF155-R1064me2a.

Hay varios inhibidores de PRMT disponibles en el comercio, que se pueden utilizar como herramientas para los ensayos celulares de PRMT. Sin embargo, no todos ellos se caracterizan a fondo por la selectividad y los efectos fuera del objetivo y algunos deben utilizarse con precaución. El Consorcio Genómico Estructural, en colaboración con laboratorios académicos y socios farmacéuticos, ha desarrollado inhibidores de PRMT potentes, selectivos y permeables a las células (sondas químicas) bien caracterizados que pueden ser utilizados sin restricciones por la comunidad científica. La información sobre estos inhibidores se puede encontrar en https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics y https://www.chemicalprobes.org/. Las sondas químicas son inhibidores de moléculas pequeñas con IC₅₀ o K_d in vitro < 100 nM, más de 30 veces de selectividad sobre proteínas de la misma familia y una actividad celular significativa a 1 μM. Además, cada sonda química tiene un análogo químico cercano que está inactivo contra el objetivo previsto^{7,8,9,10,11,12.}

La meta de este protocolo es medir la actividad celular de los miembros individuales de la familia de PRMT usando el método occidental fluorescente de la mancha blanca /negra. Aquí se proporciona información detallada sobre biomarcadores de ensayos validados, anticuerpos e inhibidores potentes de células activas, así como estrategias valiosas para la implementación exitosa del ensayo.

Protocolo

1. Cultivo celular y chapado

NOTA: Cultíe las células con los medios recomendados y pruebe rutinario para la contaminación del micoplasma. Las células HEK293T, MCF7, y C2C12 fueron elegidas como ejemplos puesto que estas variedades de células fueron utilizadas con éxito en análisis de PRMT.

1. Cultivo de HEK293T, MCF7 y C2C12 en DMEM suplementados con suero fetal bovino al 10%, penicilina (100 U mL⁻¹⁾y estreptomicina (100 μg mL⁻¹⁾en platos tratados con tejido-cultivo de 10 cm (TC).
2. Para el ensayo PRMT8, cultivar células HEK293T inducibles PRMT1 en medios que contengan doxiciclina (2 μg/mL) durante 3 días antes del inicio del ensayo.
3. Para platear las células, retire y deseche los medios de la placa.
4. Añadir 10 mL de PBS (sin^{Ca +2} y Mg⁺² iones) para lavar las células y desechar la solución.
5. Añadir 1 mL de Tripsina-EDTA (0,25%), incubar durante 1 min a temperatura ambiente (RT), y luego desechar la solución. Incubar hasta que las células se vuelvan redondas y se desprendas de la placa. Toque la placa para ayudar a separar las células, si es necesario. Para las células difíciles de tripsinizar, como C2C12, incubar la placa durante 1-2 min a 37 °C.
   NOTA: Evite la exposición celular a la solución de tripsina durante períodos más largos (>10 min) ya que reducirá la viabilidad celular.
6. Agregue 1 mL de medios precalentados a la placa y pipetee suavemente las celdas hacia arriba y hacia abajo para romper los grupos de células. Transfiera las células a un tubo de 15 mL y agregue 3-5 mL de medios.
7. Para medir el número de células, mezcle 10 μL de células con 10 μL de azul trypan y transfiera 10 μL al hemocitómetro o utilice cualquier otro método de recuento celular.
8. Diluya las células a la densidad celular recomendada y ponga 500 μL/pozo en placas TC de 24 pozos (Tabla 1). Para ensayos endógenos (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 y PRMT9), vaya al paso 3.1.

2. Transfección celular

1. Para ensayos exógenos (PRMT3, PRMT6, PRMT8) transfecto células HEK293T con la cantidad recomendada de ADN (Tabla 2). Las células HEK293T son fáciles de transfectar, por lo que se puede utilizar cualquier reactivo de transfección, siguiendo las instrucciones del fabricante.

3. Tratamiento compuesto

NOTA: No exceda el 0,1% de concentración final de dimetil sulfóxido (DMSO) en medios de cultivo. Mantenga la misma concentración de DMSO en cada pozo. Los inhibidores selectivos de la PRMT (sondas químicas) y sus análogos inactivos estrechamente relacionados se pueden encontrar en la Tabla 3.

1. Para ensayos endógenos (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 y PRMT9), elimine los medios de las células y reemplácelos con 500 μL de medios con compuestos o DMSO solos (control).
   NOTA: Por lo general, toma 2 días para observar más del 80% disminución en los niveles de metilación R.
2. Para ensayos exógenos (PRMT3, PRMT6, PRMT8), retirar el medio 4 h después de la transfección, añadir 500 μL de medio con compuesto o DMSO solo (control), e incubar durante 20-24 h.

4. Preparación del lisato celular

1. Retire todos los medios de los pozos, lave con 100 μL de PBS para eliminar los medios residuales y agregue 60 μL de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 10 mM MgCl_2,0,5% Triton X-100, 12,5 U mL−1 benzonasa, cóctel completo de inhibidores de proteasas libre de EDTA) a cada pozo.
   1. Incubar durante menos de 1 min en RT, balanceando la placa para distribuir el tampón de lisis sobre las células. A continuación, añadir 3 μL de dodecil sulfato de sodio al 20% p/v (SDS), hasta una concentración final del 1%, y mezclar agitando suavemente. Transfiera el lisato a tubos de microcentrífuga y manténgalo en hielo.
      NOTA: Agregue benzonasa e inhibidor de proteínas cóctel fresco antes de su uso. La adición de benzonasa hidroliza rápidamente los ácidos nucleicos, lo que reduce la viscosidad del lisato celular.
2. Determine la concentración de proteínas de las muestras utilizando BCA Protein Assay Kit o utilice cualquier otro método que tolere 1% SDS en solución.
   1. Agregue 2 μL de lisiado y proteínas estándar (0, 1, 2, 4 y 8 μg/mL de BSA en tampón de lisis) en los pozos de la placa transparente de 96 pozos.
   2. Mezcle el reactivo A con el reactivo B en proporción 50:1 y agregue 200 μL por pozo. Incubar durante 20 min a 37 °C y leer la absorbancia.
3. Ajuste la concentración de proteínas con tampón de lisis para que sea igual en todas las muestras.
4. Añadir 20 μL de tampón de carga 4x a 60 μL de lisiado celular y calentar a 95 °C durante 5 min. Después de la desnaturalización por calor, los lisiados se pueden almacenar a -20 °C.

5. Análisis de Western blot

1. Cargue 5-20 μg de lisato celular total para el análisis de proteínas histonas y 20-100 μg para otras proteínas en un gel de proteína Bis-Tris al 4-12%.
2. Haga funcionar el gel en el almacenador intermediario corriente de MOPS SDS (50 mM MOPS, 50 milímetros Tris Base, 0.1% SDS w/v, 1 milímetro EDTA, pH 7.7) por cerca de 2 h en 100 V o hasta que el frente del tinte alcance la parte inferior del gel.
3. Si realiza una transferencia húmeda, monte el sándwich de transferencia en tampón de transferencia tris-glicina helado (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 20% v/v metanol y 0.05% w/v SDS).
   1. Coloque las esponjas, el papel de filtro, la membrana de PVDF y el gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Active la membrana de PVDF remojando en metanol y equilibre el gel en el tampón de transferencia durante 30 s antes del ensamblaje.
      NOTA: Utilice la membrana secante occidental de PVDF recomendada ya que tiene baja autofluorescencia e idoneidad para proteínas de bajo peso molecular, como las histonas(Tabla de Materiales).
4. Transferir proteínas del gel a la membrana de PVDF en tampón de transferencia de Tris-Glicina a 70 V durante 1,5 h en hielo.
5. Bloquee la membrana durante 30 min en el tampón de bloqueo (5% p/v de leche en solución salina tamponada con fosfato, PBS). Enjuague con tampón de lavado (PBST: 0,1% v/v Tween-20 en PBS), e incube con anticuerpos primarios en solución de albúmina sérica bovina (BSA) (5% de BSA en PBST) durante la noche a 4 °C(Tabla 3).
   NOTA: Para un almacenamiento más largo, esterilice la solución de BSA con filtro, agregue azida de sodio al 0.02% p/v y manténgala a 4 °C.
6. Lavar la membrana 3 x 5 min con PBST. A continuación, incubar con anticuerpos de cabra-anti-conejo (IR800) y burro anti-ratón (IR680) en tampón de bloqueo recomendado(Tabla de Materiales, Tabla 3)durante 30 min a RT y lavar 3 x 5 min con PBST.
7. Lea la señal en un generador de imágenes fluorescentes de western blot a 800 y 700 nm. Preferiblemente utilizar el instrumento que permite la proyección de imagen de bandas fuertes y débiles claramente en una sola imagen con alta sensibilidad y rango dinámico, alta relación señal-ruido, una advertencia cuando se alcanza una saturación de la imagen, así como la multiplexación de dos colores fluorescentes en la misma banda de muestra.
8. Determine las intensidades de la venda para el análisis occidental de la mancha blanca /negra usando el software apropiado para la proyección de imagen occidental fluorescente.

Resultados

Ejemplos de resultados de western blot para ensayos celulares de PRMTs individuales se presentan a continuación. Los detalles de los ensayos también se resumen en la Tabla 4.

Ensayo PRMT1
PRMT1 es el principal contribuyente a la histona 4 arginina 3 dimetilación asimétrica (H4R3me2a) en las células^13. Tras la pérdida de actividad de PRMT1, los niveles globales de Rme1 y Rme2s aumentan significativamente¹³. Como se muestra en las Figuras 1A y 1B,se pueden utilizar varios anticuerpos para monitorizar los cambios globales en Rme1, Rme2a, Rme2s, así como H4R3me2a. Una disminución significativa en los niveles globales de Rme2a y H4R3me2a y aumentos en Rme1 y Rme2s se pueden observar después de 3 días de caída de PRMT1 (Figura 1A, B). Las líneas celulares difieren en la señal basal de H4R3me2a, por lo tanto, para facilitar el monitoreo de la pérdida de actividad de PRMT1, se pueden utilizar líneas celulares como MCF7 con altos niveles de metilación basal(Figura 1C). El tiempo óptimo para observar el efecto de la inhibición de la PRMT1, por ejemplo, sobre el tratamiento con el inhibidor de la PRMT tipo I MS023^8,es de 2 días(Figura 1D,1E). Un tratamiento más largo resulta en una reducción de la viabilidad y el crecimiento celular.

Ensayo PRMT3
Para el ensayo celular PRMT3, no se pudieron detectar proteínas biomarcadores selectivas que cambien la metilación en western blot tras la derribo o sobreexpresión de PRMT3. PRMT3 se demostró que asimétricamente dimetilato H4R3 in vitro^14,sin embargo, la marca es depositada predominantemente por PRMT1, y por lo tanto se diseñó un ensayo exógeno con PRMT3 sobreexpresado. De acuerdo con los hallazgos in vitro, la sobreexpresión de PRMT3 de tipo salvaje, pero no de su mutante catalítico (E338Q) condujo a un aumento en los niveles de H4R3me2a (Figura 2A). Se utilizaron células HEK293T ya que tienen baja metilación basal de esta marca (Figura 1C). El ensayo se validó además con el inhibidor selectivo de PRMT3 SGC707^7,que inhibió la metilación asimétrica de H4R3 dependiente de PRMT3(Figura 2B).

Ensayo PRMT4
PRMT4 dimetilato asimétrico BAF155 en arginina 1064¹⁵. Dado que el anticuerpo que detecta BAF165-R1064me2a está disponible comercialmente, la actividad de PRMT4 en las células puede ser monitoreada por western blot mediante la detección de los cambios en los niveles de marca R1064me2a. La pérdida de la proteína PRMT4 o la inhibición de la actividad catalítica con el inhibidor selectivo de LA PRMT4, TP-064^10,da lugar a una disminución de los niveles de BAF165-R1064me2a(Figura 3). Un tratamiento de 2 días suele ser suficiente para eliminar la mayor parte de la señal de metilación.

Ensayo PRMT5
PRMT5 es responsable de la mayoría de la proteína arginina dimethylation simétrico. Se ha informado previamente que las diversas proteínas del complejo SMN, incluyendo SmBB', son sustratos PRMT5¹⁶. La actividad de PRMT5 se puede supervisar observando los cambios en los niveles globales de dimetilación simétrica de arginina o dimetilación simétrica de las proteínas SmBB'. La caída de PRMT5,pero no de PRMT1, 3, 4, 6 y 7, resulta en una disminución en los niveles globales de Rme2s (Figura 4A). En la mayoría de las líneas celulares, el tratamiento de células con inhibidores selectivos de PRMT5 LLY-283¹¹ y GSK591 durante 2-3 días suprimió la mayor parte de la señal de SmBB'Rme2s(Figura 4B). La mayoría de las células son sensibles a la inhibición de PRMT5, lo que resulta en una disminución de la proliferación celular y la muerte celular con exposición prolongada a inhibidores.

Ensayo PRMT6
Se ha divulgado que PRMT6 es el contribuidor principal a la dimethylation asimétrico de la arginina 2 de la histona H3 (H3R2me2a) en las células^17. En las células HEK293T, la caída de PRMT6 durante 3 días no fue suficiente para observar una disminución significativa de los niveles de H3R2me2a. Sin embargo, la sobreexpresión de prmt6 de tipo salvaje pero no su mutante catalítico (V86K/D88A) aumenta los niveles de H3R2me2a, así como H3R8me2a y H4R3me2a (Figura 5A). Existen varios inhibidores que inhiben la actividad de la PRMT6 con diferente potencia y selectividad: el inhibidor selectivo y alastésico de la PRMT6 SGC6870^18,el inhibidor de la PRMT tipo I MS023^8,y el inhibidor de la PRMT4/6 MS049^9. Todos estos inhibieron la PRMT6 dependiente de H3R2(Figura 5B),así como la dimetilación asimétrica de H4R3 y H3R8 (datos no mostrados).

Ensayo PRMT7
PRMT7 monometilatos de arginina 469 en formas constitutivas e inducibles de HSP70 (HSPA8 y HSPA1/6, respectivamente)¹². Aunque no hay anticuerpos disponibles en el mercado, que detectan los niveles de HSP70-R469me1, la marca se puede detectar con anticuerpos monometil de la cacerola. La pérdida de la proteína PRMT7 o la inhibición de la actividad catalítica con el inhibidor selectivo de la PRMT7, SGC3027^12,da lugar a una disminución de los niveles de HSP70-R469me1(Figura 6A,B). SGC3027 es un profármaco permeable a las células, que en las células se convierte por reductasas al inhibidor selectivo PRMT7 SGC8158, por lo tanto, la potencia celular puede diferir entre líneas celulares. Varias variedades de células cancerosas expresan isoformas inducibles de HSP70 a niveles altos, y la metilación puede ser difícil de detectar debido a una banda inespecífica superpuesta de origen nuclear (Figura 6C). Por lo tanto, para el análisis celular PRMT7, las variedades de células que expresan sobre todo HSPA8 tales como C2C12 se recomiendan, o puesto que HSP70 localiza principalmente en el citoplasma, determinan niveles HSP70-R469me1 en la fracción citoplásmica de variedades de células preferidas.

Ensayo PRMT8
PRMT8 es el único PRMT con un patrón de expresión restringido en tejidos - en gran parte expresado en el cerebro¹⁹. Comparte un 80% de similitud de secuencia y tiene una preferencia de sustrato similar a la prmt1^19. Se diferencia de la PRMT1 principalmente en el N-terminal, donde la miristilación da lugar a la asociación de la PRMT8 con la membrana plasmática^20. Se ha informado de que PRMT8 junto con PRMT1 metila la proteína de unión a ARN EWS²¹. Dado que la actividad de PRMT8 es baja en líneas celulares no neuronales y EWS también puede ser metilado por PRMT1, se desarrolló un ensayo en el que PMRT8 se coexpresa junto con EWS en células de derribo PRMT1. Dado que la PRMT1 es un gen esencial y su pérdida a largo plazo resulta en la muerte celular, se utilizó un sistema inducible en el que la PRMT1 se derriba durante 3 días antes de su uso en el ensayo PRMT8(Figura 7A). La coexpresión de PRMT8 de tipo salvaje, pero no catalíticamente inactiva mutante (E185Q), junto con EWS dio lugar a un aumento de los niveles de dimetilación asimétrica de EWS(Figura 7B). Varios anticuerpos asimétricos del dimethylarginine fueron probados y la metilación fue detectada solamente con el anticuerpo Asym25. El ensayo se validó además con una sonda química selectiva prmt tipo I, MS023^8,que disminuyó la dimetilación asimétrica dependiente de PRMT8 de EWS exógeno(Figura 7B). Aunque la MS023 es muy potente en la inhibición de la PRMT8 en ensayos in vitro, en las células se requieren altas concentraciones de MS023 para ver la inhibición de la metilación^21.

Ensayo PRMT9
Prmt9 se demostró que simétricamente dimetilato SAP145 en arginina 508²². Desafortunadamente, ningún anticuerpo disponible comercialmente puede reconocer la marca. Para el ensayo PRMT9, se utilizaron anticuerpos que fueron amablemente dotados por el Dr. Yanzhong Yang (Beckman Research Institute of City of Hope). Cuando se sobreexpresa, el mutante SAP145 de tipo salvaje pero no R508K es metilado por PRMT9(Figura 8A). El ensayo fue diseñado para monitorizar los niveles endógenos de SAP145-R508me2s y fue validado con el Compuesto X, un prototipo de inhibidor de PRMT9 (trabajo en curso, aún no publicado), que inhibe potentemente PRMT9 in vitro con potencia nanomolar. El compuesto X disminuyó los niveles de SAP145-R508me2s de manera dependiente de la dosis (Figura 8B).

Figura 1. Ensayo celular PRMT1. (A)La caída de PRMT1 resulta en una disminución de la dimetilación global asimétrica de arginina (Rme2a) y un aumento de los niveles de dimetilación simétrica de arginina (Rme2s) y monometilación (Rme1). La eficiencia de derribo prmt1 se presenta en el panel B.(B)PRMT1 knockdown disminuye la dimetilación asimétrica de la histona H4R3 (H4R3me2a). (C)Los niveles basales de H4R3me2a difieren entre diferentes líneas celulares. (D)El inhibidor de PRMT tipo I MS023 disminuye los niveles de H4R3me2a de una manera dependiente de la dosis. Las células MCF7 fueron tratadas con MS023 por 2 días. (E) El gráfico representa el ajuste no lineal de las intensidades de la señal H4R3me2a normalizadas a la histona total H4. MS023 IC50 = 8,3 nM (n=1). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2. Ensayo celular PRMT3. (A)La sobreexpresión de tipo salvaje (WT) pero no E338Q mutante catalítico de PRMT3 aumenta los niveles de H4R3me2a en las células HEK293T. Las células fueron transfectadas con PRMT3 marcado con FLAG durante 24 h.(B)inhibidor selectivo de PRMT3, SGC707, disminuye la desmetilación asimétrica ectópica dependiente de PRMT3 H4R3 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Ensayo celular PRMT4. (A)La caída de PRMT4 resulta en una disminución de la dimetilación asimétrica de arginina BAF155-R1064 (células HEK293T). (B)Inhibidor selectivo de PRMT4, TP-064, disminuye los niveles de BAF155-R1064Rme2a. Las células de HEK293T fueron tratadas con el compuesto por 2 días. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 4. Ensayo celular PRMT5. (A)La caída de PRMT5 resulta en una disminución de los niveles de dimetilación de arginina simétrica global (células MCF7). (B)Los inhibidores selectivos de PRMT5 GSK591 y LLY-283, disminuyen la dimetilación simétrica de arginina SmBB' (verde), mientras que los niveles totales de SmBB' permanecen inalterados (rojo). Las células MCF7 fueron tratadas con los compuestos por 2 días. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 5. Ensayo celular PRMT6. (A)La sobreexpresión de tipo salvaje (WT) pero no V86K/D88A mutante catalítico PRMT6 aumenta H4R3me2a, H3R2me2a, y los niveles de H3R8me2a en las células HEK293T. Las células fueron transfectadas con PRMT6 marcado con bandera para 24 h.(B)inhibidor selectivo de PRMT6 (SGC6870), inhibidor de PRMT tipo I (MS023), y el inhibidor de PRMT4/6 (MS049) disminuyen los niveles dependientes de PRMT6 H3R2me2a. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 6. Ensayo celular PRMT7. (A)El knockout de PRMT7 resulta en una disminución de la monometilación HSP70-R469 (células HCT116). (B)Los inhibidores selectivos de PRMT7, SGC3027, disminuyen la monometilación de HSP70-R469 en las células C2C12. Las células fueron tratadas con el compuesto por 2 días. (C)La detección de metilación de HSP70-R469 de HSP70 inducible (HSPA1/6) con anticuerpos de arginina monometil pan (Rme1) puede ser difícil debido a una banda inespecífica superpuesta de origen nuclear. Se recomienda medir los niveles de metilación de HSP70 en la fracción citoplasmática. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 7. Ensayo celular PRMT8. (A)La metilación de PRMT8 de EWS se puede detectar cuando la actividad de PRMT1 es inhibida por la caída. Las células HEK293T fueron transducidas con un vector de derribo PRMT1 inducible. Después de 3 días de tratamiento con doxiciclina, los niveles de PRMT1 se redujeron drásticamente. (B)Cuando se derriba la PRMT1, el EWS exógeno es dimetilado asimétricamente por el tipo salvaje sobreexpresado PRMT8 pero no por el mutante catalítico (E185Q) de la PRMT8. La metilación es disminuida por una alta concentración de inhibidor de PRMT tipo I (MS023). Las células HEK293T PRMT1KD fueron co-transfectadas con el mutante salvaje o catalítico PRMT8 marcado con FLAG y el EWS etiquetado con GFP y tratados con MS023 durante 20 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. Ensayo celular PRMT9. (A)El mutante SAP145 de tipo salvaje pero no R508K es metilado por PRMT9. Las células HEK293T fueron transfectadas con SAP145 GFP-marcado por 1 día. (B)El prototipo de inhibidor de PRMT9 (Compuesto X) disminuye la dimetilación simétrica de R508 dependiente de PRMT9 de SAP145 de una manera dependiente de la dosis. Las células de HEK293T fueron tratadas con el compuesto por 2 días. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

PRMT	células	Densidad por ml
PRMT1	MCF7	1 x 105
PRMT3	HEK293T	2 x 105
PRMT4	HEK293T	1 x 105
PRMT5	MCF7	1 x 105
PRMT6	HEK293T	2 x 105
PRMT7	C2C12	1 x 105
PRMT8	HEK293T (PRMT1 KD)*	2 x 105
PRMT9	HEK293T	2 x 105
*tratar las células con doxiciclina (2 μg/mL) 3 días antes del enchapado para el ensayo PRMT8

Tabla 1. Tipos y densidades celulares recomendadas para ensayos de PRMT.

PRMT	μg DE ADN/24-pozo	Addgene #	Notas adicionales
PRMT3	0.5 BANDERA-PRMT3	164695
	o 0,5 FLAG-PRMT3 (E338Q)	164696
PRMT6	0.5 BANDERA-PRMT6	164697
	o 0,5 FLAG-PRMT6(V86K/D88A)	164698
PRMT8	0,05 EWS-GFP	164701
	0,45 PRMT8-FLAG	164699
	o 0,45 PRMT8(E185Q)-FLAG	164700
PRMT9	0,05 SAP145-GFP	Na	regalo del Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope
	o 0,05 SAP145-R508K-GFP
	Vector vacío 0,45

Tabla 2. La concentración de ADN recomendada para el experimento de transfección.

PRMT	anticuerpo	Punta de prueba química (Actividad IC50 de la célula)	Control negativo
PRMT1	H4R3me2a (1:2000)	MS023 -PRMT tipo I	MS094
	Rme1 (1:1000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM, respectivamente)
	Rme2s (1:2000)
	- Rme2a (1:2000)
	Rme2a (ASYM24, 1:3000)
	Rme2a (ASYM25, 1:2000)
	H4 (1:2000)
	B-actina (1:500 )
PRMT3	H4 (1:2000)	SGC707 (IC50 = 91 nM)	XY-1
	H4R3me2a (1:2000)
	BANDERA (1:5000)
PRMT4	BAF155 (1:200)	TP-064 (IC50 = 43 nM)	TP064N
	BAF155-R1064me2a (1:3000)	SKI-73 (IC50 = 540 nM)*	SKI-73N*
PRMT5	anti-SmBB' (1:100)	LLY-283 (IC50 = 30 nM)	LLY-284
	Rme2s (#13222, 1:2000)	GSK591 (IC50 = 56 nM)	SGC2096
PRMT6	H4R3me2a (1:2000)	SGC6870 (IC50 = 0,9 μM)	SGC6870N
	H4 (1:2000)	MS023 -PRMT tipo I	MS094
	H3R2me2a (1:2000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM, respectivamente)
	H3R8me2a (1:2000)	MS049 (PRMT 4, 6 IC50 = 970, 1400 nM, respectivamente)	MS049N
	H3 ( 1:5000)
	BANDERA ( 1:5000)
PRMT7	Rme1 (1:1000)	SGC3027 (IC50 = 1300 nM) *	SGC3027N*
	Hsp/Hsc70 (1:2000)*
PRMT8	GFP (1:3000)	MS023 (50 μM)	MS094
	Rme2a (ASYM25,1:2000)
	BANDERA (1:5000)
PRMT9	SAP145 (1:1000)
	SAP145-R508me2s -amable regalo del Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope (1:1000) (PIMID: 25737013)
Anticuerpos secundarios	cabra-anti-conejo IgG-IR800 (1:5000)
	burro anti-ratón IgG-IR680 (1:5000)
*- anticuerpo reconoce HSPA8, HSPA1 y HSPA6 (probado con proteínas marcadas con GFP sobreexpresadas), *profármaco – el IC50 puede diferir entre varias líneas celulares

Tabla 3. Anticuerpos recomendados y compuestos de la sonda química/de la herramienta de control negativo de PRMT.

PRMT

Biomarcador

Lectura del ensayo

Validación de ensayos

Línea celular recomendada

Ref.

PRMT1

H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a

Los niveles de H4R3me2a normalizados a los niveles globales totales de H4 Rme1, Rme2a o Rme2s normalizados a B-actina.

La caída de PRMT1 disminuyó los niveles basales de H4R3me2a y Rme2a globales y aumentó los niveles globales de Rme1 y Rme2s en las células (Fig.1A, B). La sonda química PRMT Tipo I MS023 disminuyó los niveles de H4R3me2a de manera dependiente de la dosis (Fig. 1D).

Las células difieren en los niveles basales de H4R3me2a (Fig. 1C). Las células MCF7 tienen altos niveles basales de H4R3me2a, lo que lo hace preferible para los ensayos que monitorean la disminución de la actividad de PRMT1.

8

PRMT3

H4R3me2a

Niveles de metilación de H4R3me2a causados por PRMT3 WT con marca de bandera exógena o mutante catalítico E338Q (fondo) normalizados a la histona total H4

La sobreexpresión de tipo salvaje PRMT3 pero no su mutante catalítico (E338Q) aumentó H4R3me2a (Fig. 2A). El inhibidor selectivo de PRMT3 SGC707 disminuyó el aumento dependiente de PRMT3 en los niveles de H4R3me2a (Fig. 2B)

Las células HEK293T tienen bajos niveles basales de H4R3me2a (Fig. 1C), lo que es preferible para monitorear la actividad exógena de PRMT3

7

PRMT4

BAF155-R1064me2a

Niveles de BAF155-R1064me2a normalizados al total de BAF155

La caída de PRMT4 disminuyó la dimetilación asimétrica de BAF155 (Fig. 3A). El tratamiento de 2 días con sonda química selectiva PRMT4 (TP-064) disminuyó la dimetilación asimétrica de BAF155 (Fig. 3B).

Cualquier línea celular

10

PRMT5

SmBB'-Rme2s

Niveles de SmBB'-Rme2s detectados con anticuerpos pan Rme2s (CST) normalizados a SmBB' total

La caída de PRMT5 dio lugar a la disminución de los niveles de dimetilación simétrica de SmBB' (Fig. 4A). Tratamiento de 2 días con sondas químicas selectivas PRMT5, GSK591 y LLY285, disminución de los niveles de SmBB'-Rme2s (Fig. 4B).

Cualquier línea celular

11

PRMT6

H4R3me2a H3R2me2a H3R8me2a

Los niveles de metilación de H4R3me2a, H3R2me2a o H3R8me2a se incrementan en PRMT6 WT con etiqueta FLAG exógena, pero no en el mutante catalítico V86K, D88A (fondo) normalizado a la histona total H4 o H3, respectivamente

La sobreexpresión de tipo salvaje PRMT6 pero no su mutante catalítico (V86K,D88A) aumentó los niveles de H3R2me2a, H3R8me2a y H4R3me2a (Fig. 5A). El inhibidor alastérico de PRMT6 (SGC6870), el inhibidor de PRMT tipo I MS023, el inhibidor de PRMT4/6 MS049 disminuyeron el aumento dependiente de PRMT6 en los niveles de H3R2me2a (Fig. 5B).

Las células HEK293T tienen bajos niveles basales de H4R3me2a, H3R2me2a y H3R8me2a, lo que es preferible para monitorear la actividad exógena de PRMT6

8,9

PRMT7

HSP70-R469me1

Niveles de metilación de HSP70-Rme1 normalizados al total de HSP70

El knockout o knockdown de PRMT7 redujo la monometilación HSP70 (Fig. 6A). El tratamiento de 2 días con la sonda química selectiva PRMT7 SGC3027 disminuyó la monometilación dependiente de PRMT7 de HSP70 de manera dependiente de la dosis (Fig. 6B).

C2C12, HT180 Varias variedades de células cancerosas expresan una forma inducible de HSP70 cuya señal de metilación se superpone con una proteína inespecífica de origen nuclear (Fig. 6C). En este caso, recomendamos analizar los niveles de metilación de HSP70 en la fracción citoplasmática.

12

PRMT8

EWS-Rme2a

Exógeno GFP-etiquetado EWS niveles de metilación causados por exógeno FLAG-etiquetado PRMT8 WT o E185Q mutante catalítico (fondo), normalizado a la señal total de GFP en las células PRMT1 KO.

Sobreexpresión del mutante EMT8 de tipo salvaje PERO NO CATALÍTICO E185Q metilado ectópico sólo en células PRMT1 KD (Fig. 7A). La sonda química PRMT tipo I MS023 inhibió la dimetilación asimétrica de EWS exógenos por PRMT8 (Fig. 8B).

HEK293T PRMT1 KD (inducible). Prmt1 knockdown resulta en la muerte celular por lo tanto, se recomienda el uso de un sistema inducible.

8

PRMT9

SAP145-R508me2s

Dependientes de PRMT9 SAP145 dimetilación simétrica en R508 normalizado a SAP145

La pérdida de PRMT9 pero no de PRMT5 conduce a una disminución de la dimetilación simétrica de SAP145. SAP145 WT, pero no SAP145mut (R508K), etiquetado con GFP, fue metilado por PRMT9 (Fig. 8A). El tratamiento de 2 días con Copound X, el inhibidor prototipo de PRMT9, disminuyó los niveles de SAP145-R508me2s de una manera dependiente de la dosis Fig. 8B).

Cualquier línea celular

21

Tabla 4. Resumen de ensayos de PRMT.

Discusión

Aquí, los protocolos celulares detallados del análisis para los miembros de la familia de PRMT se describen que utilizan métodos occidentales fluorescentes del borrón y cuenta nueva. Los substratos únicos para los cuales los cambios en la metilación de la arginina se pueden detectar fácilmente sobre pérdida individual de PRMT o la inhibición catalítica y no se pueden compensar por otros miembros de familia fueron seleccionados. Algunas proteínas son metiladas por múltiples PRMTs^21,23,lo que sugiere una superposición en la especificidad del sustrato donde algunos PRMTs contribuyen sólo una pequeña cantidad de marca celular en un sustrato proteico dado^24,25,26,27,por ejemplo, tanto PRMT8 como PRMT1 contribuyen a la metilación de EWS. Por lo tanto, cada ensayo requirió la validación completa de sustratos y anticuerpos con experimentos de derribo y / o sobreexpresión y una validación adicional con inhibidores selectivos bien caracterizados. Los substratos específicos de PRMT fueron identificados para los cuales los cambios de la marca de la metilación se podrían detectar en el plazo de 2-3 días de pérdida/inhibición de poste-PRMT para evitar efectos de composición de la viabilidad y de la proliferación reducidas de la célula que puedan afectar indirectamente a los niveles de la marca de la metílico-arginina. Aunque fue posible encontrar sustratos únicos para PRMT1, 4, 5, 7 y 9; para PRMT3, 6, y 8 el enfoque de ganancia de la función tuvo que ser empleado. Varios anticuerpos metílico-específicos de la arginina fueron probados para las varias blancos celulares, pero ningunos podían detectar cambios significativos en el plazo de 3 días de la caída prmt3 y prmt6; por lo tanto, los análisis del biomarker fueron desarrollados usando las enzimas ectópicamente expresadas junto con los mutantes catalítico inactivos, que sirvieron como control para la metilación del substrato de la línea de fondo. PRMT8 es un homólogo prmt1 cercano y comparte preferencias de sustrato similares. Como no se pudo identificar un biomarcador selectivo de PRMT8, se desarrolló un ensayo en células de derribo PRMT1, donde PRMT8 se co-expresó junto con EWS. PRMT1 es también una enzima importante responsable de la metilación asimétrica H4R3, por lo tanto, para utilizar H4R3me2a como biomarcador para los ensayos celulares PRMT3 y PRMT6, se eligieron células con bajos niveles basales de H4R3me2a, así como mutantes catalíticamente inactivos se utilizaron como control de fondo. Aunque se prefieren los ensayos endógenos, los ensayos exógenos resultan invaluables para probar la potencia celular de varios inhibidores selectivos de la PRMT^7,8,9. Con el creciente conocimiento de la biología de PRMT, esperamos mejorar los ensayos mediante la búsqueda de proteínas biomarcadores más específicas para PRMT3, PRMT6 y PRMT8.

El uso de anticuerpos validados y los controles apropiados son críticos para el rendimiento del ensayo prmt. Todos los anticuerpos recomendados aquí han sido validados a fondo por experimentos de derribo y sobreexpresión, sin embargo, las diferencias de lote a lote, especialmente en el caso de los anticuerpos policlonos, todavía pueden influir en su rendimiento. Por lo tanto, es crucial utilizar métodos genéticos y sondas químicas junto con sus controles negativos estrechamente relacionados para confirmar la fiabilidad del ensayo. Además, para los ensayos de PRMT que requieren sobreexpresión de proteínas, es crucial utilizar mutantes catalíticamente inactivos junto con proteínas de tipo salvaje para determinar los niveles de metilación basal.

Esta colección de ensayos cuantitativos para perfilar la actividad de los PRMTs en las células puede ser ampliamente útil para la comunidad científica, ya que se puede implementar rápida y fácilmente con un equipo mínimo y una experiencia técnica limitada, que implica solo el cultivo básico de células y las técnicas fluorescentes de western blotting. Los anticuerpos y las sondas químicas recomendadas para los PRMTs también se pueden utilizar para ensayos de perfiles de proteínas basados en la actividad (ABPP) para establecer la idoneidad de una sonda ABPP dada, monitorear el compromiso objetivo y evaluar los efectos fuera del objetivo mediante el uso del formato ABPP competitivo. Los acercamientos del desarrollo del análisis discutidos aquí se pueden también extrapolar para otras familias de la enzima tales como lisina-methyltransferases de la proteína y acetiltransferasas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Platos TC de 10 cm	Greiner bio-one	664160
Platos TC de 24 pocillos	Greiner bio-one	662160
4– 12% Bis-Tris Proteína Geles ThermoFisher	Scientiffic	NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX
Amersham Hybond P Membrana PVDF	Millipore-Sigma	10600021
anti-Asym 24	Millipore-Sigma	07-414
anti-Asym 25	Millipore-Sigma	09-814
anti-B-actina	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47778
anti-BAF155	Santa Cruz Biotechnologies	sc-32763
anti-BAF155-R1064me2a	Millipore-Sigma	ABE1339
anti-FLAG (#, 1:5000)	Millipore-Sigma	F4799
anti-GFP	Clontech	632381
anti-H3	Abcam	ab10799
anti-H3R2me2a	Millipore-Sigma	04-848
anti-H3R8me2a	Rockland	600-401-I67
anti-H4	Abcam	ab174628
anti-H4R3me2a	Motivo activo	39705
anti-Hsp/Hsc70	Enzo	ADI-SPA-820
anti-PRMT1	Millipore-Sigma	07-404
anti-PRMT3	Abcam	ab191562
anti-PRMT4	Bethyl	#A300-421A
anti-PRMT5	Abcam	ab109451
anti-PRMT6	Abcam	ab47244
anti-PRMT7		Abcam ab179822
anti-Rme1	CST	8015
anti-Rme2a	CST	13522
anti-Rme2s	CST	13222
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000)		09-814
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)	Abcam	ab56800
anti-SAP145-R508me2s			amable regalo del Dr. Yanzhong Yang, Instituto de Investigación Beckman de City of Hope
anti-SmBB'	Santa Cruz Biotechnologies	sc-130670
benzonase			PRODUCIDO INTERNAMENTE
BSA	Millipore-Sigma	A7906
C2C12			regalo del Dr. Stephane Richard, Universidad McGill
cOmplete, cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA	Millipore-Sigma	11873580001
DMEM	Wisent	319-005-CL
DMSO	Bioshop	DMS666.100
burro anti-ratón IgG-IR680	Licor	926-68072
doxiciclina	Millipore-Sigma	D9891
EDTA	Bioshop	EDT111.500
FBS	Wisent	80150
glicina		Bioshop GLN002.5
cabra-anti-conejo IgG-IR800	Licor	926-32211
HEK293T			regalo del Dr. Sam Benchimol, Universidad de York
Estudio de imagen Software ver 5.2	Licor
Tampón de carga: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	ThermoFisher Scientiffic	NP0007
MCF7		ATCC® HTB-22 y comercio;
NaCl	Bioshop	SOD001.1
NuPAGE MOPS SDS Tampón	ThermoFisher Scientiffic	NP0001
Odyssey (diluido 4 veces con PBST)	También	927-40000	Intercept (PBS) # 927-70001 Sistema de
imágenes Odyssey CLX	Número	modelo Licor 9140
PBS (cultivo de tejidos)	Wisent	311-010-CL
PBS (western blot)	Bioshop	PBS405.4
penstrep	Wisent	450-201-EL
Pierce™ Kit de ensayo de proteínas BCA	ThermoFisher Scientiffic	23225
SDS	Bioshop	SDS001.1
leche desnatada en polvo	Bioshop	SKI400.500
TC20 contador de células automatizado	Biorad	1450102
Tripsin-EDTA (0.25%)	Wisent	325-043-EL
Tris	Bioshop	TRS003.5
Tritton X-100	Bioshop	TRX506
azul tripano	GIBCO	15250-061
Tween-20	Bioshop	TWN510.500