Sistema de inducción organoide retiniana para la derivación de tejidos retinianas 3D a partir de células madre pluripotentes humanas

Resumen

Aquí describimos un sistema optimizado de inducción organoide retiniana, que es adecuado para varias líneas de células madre pluripotentes humanas para generar tejidos retinianas con alta reproducibilidad y eficiencia.

Resumen

Las enfermedades degenerativas de la retina son las principales causas de ceguera irreversible sin un tratamiento eficaz. Las células madre pluripotentes que tienen el potencial de diferenciarse en todo tipo de células de la retina, incluso los tejidos mini-retinianas, tienen grandes promesas para los pacientes con estas enfermedades y muchas oportunidades en el modelado de enfermedades y la detección de fármacos. Sin embargo, el proceso de inducción de las hPSC a las células de la retina es complicado y requiere mucho tiempo. Aquí, describimos un protocolo de inducción retiniana optimizado para generar tejidos retinianas con alta reproducibilidad y eficiencia, adecuados para diversas células madre pluripotentes humanas. Este protocolo se realiza sin la adición de ácido retinoico, lo que beneficia el enriquecimiento de los fotorreceptores de cono. La ventaja de este protocolo es la cuantificación del tamaño de EB y la densidad de recubrimiento para mejorar significativamente la eficiencia y la repetibilidad de la inducción retiniana. Con este método, todas las principales células de la retina aparecen secuencialmente y recapitulan los principales pasos del desarrollo de la retina. Facilitará las aplicaciones posteriores, como el modelado de enfermedades y la terapia celular.

Introducción

Las enfermedades degenerativas de la retina (PR), como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y la retinosis pigmentaria (RP), se caracterizan por la disfunción y la muerte de las células fotorreceptoras y, por lo general, conducen a una pérdida irreversible de la visión sin formas efectivas de curar¹. El mecanismo subyacente a estas enfermedades es en gran parte desconocido en parte debido a la falta de modelos de enfermedades humanas². En las últimas décadas, se han logrado avances significativos en la medicina regenerativa a través de la tecnología de células madre. Muchos investigadores, incluyéndonos....

Protocolo

1. Cultura y expansión de las hPSCs

1. Cultura HPSC
   1. Recubrimiento de dos pozos de una placa de 6 pozos con matriz extracelular (ECM, matriz calificada hESC). Preparar 50 ml de una solución de ECM que contenga 8-12 μg/mL de ECM en el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco. En 49 ml de DMEM, agregue 1 ml de la solución de material ECM descongelada (50x). Agregue 1 ml de la solución de ECM a cada pozo de una placa de 6 pozos. Incubarlo durante 1 h en una incubadora a 37 °C y 5% CO_2.
   2. Prepare el medio de mantenimiento hPSC (MM) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   3. Precalentación de MM a t....

Resultados

El proceso de inducción de la retina en este protocolo imita el desarrollo de la retina fetal humana. Para iniciar la diferenciación retiniana, las hPSC se disociaron en pequeños grupos y se cultivaron en suspensión para inducir la formación de EBs. En D1, se formaron los agregados celulares uniformados o EBs(Figura 1C). El medio de cultivo se transformó gradualmente en NIM. En D5, los EBs se colocaron en los platos de cultivo recubiertos de ECM. Las células migraron gradualmente fuera de lo.......

Discusión

En este protocolo de inducción retiniana de varios pasos, las hPSC se guiaron paso a paso para obtener el destino de la retina y se autoorganizaron en organoides retinianas que contenían NR y RPE laminados. Durante la diferenciación, las hPSC recapitularon todos los pasos principales del desarrollo de la retina humana in vivo,desde EF, OV y RPE, hasta la laminación retiniana, generando todos los subtipos de células retinianas, incluidas las células ganglionares de la retina, las células amacrinas, las células bi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(&menos;)-Blebbistatina	Sigma	B0560-5mg	ROCK-inhibidor 1
ml puntas	Kirgen	KG1313	1 ml
10 ml Pipeta	Sorfa	3141001
100 mm Cultivo de tejidos	BIOFIL	TCD000100	100 mm Placa de Petri
100 mm Cultivo de tejidos	Falcon	353003	100 mm Placa de Petri
15 ml Tubos de centrífuga	BIOFIL	CFT011150	Tubos de centrífuga de
35 mm Placas de cultivo de tejidos	Falcon	353001	de 35 mm Placa de Petri
Pipeta de 5 ml	Sorfa	313000
Pipeta de 50 ml Tubos de centrífuga	BIOFIL	CFT011500	Tubos de centrífuga
6 pocillos Placas de cultivo de tejidos	Costar	3516	Placas de cultivo
Anti-AP2α Anticuerpo	DSHB	3b5	Primario  anticuerpo
ANTIBIÓTICO ANTIMICÓTICO 100X	Gibco	15240062	Antibiótico-Antimicótico
Anti-ISL1 Anticuerpo	Boster	BM4446	Primario  anticuerpo
Anti-Ki67 Anticuerpo	Abcam	ab15580	Primario  anticuerpo
Anti-L/M opsina Regalo de anticuerpos	del Dr. jeremy	/	Primary  anticuerpo
Anti-PAX6 Anticuerpo	DSHB	pax6	Primario  anticuerpo
Anti-conejo 555	Invitrogen	A31572	Burro anti-Conejo IgG (H+L) Anticuerpo Secundario, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverina Anticuerpo	Millipore	ab5585	Primario  anticuerpo
Anti-rodopsina Anticuerpo	Abcam	ab5417	Primario  anticuerpo
Anti-ovejas 555	Invitrogen	A21436	Burro anti-ovejas IgG (H+L) Anticuerpo Secundario, Alexa Fluor 555
Anticuerpo Anti-SOX9	Abclonal	A19710	Primario  anticuerpo
Anti-VSX2 Anticuerpo	Millipore	ab9016	Primario  anticuerpo
B-27 suplemento W/O VIT A (50X)	Gibco	12587010	Suplemento
Cryotube	vial Thermo scientific-NUNC		375418 1,8 ml
DAPI	DOJINDO	D532	4',6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato; múltiples proveedores
Sulfóxido de dimetilo (DMSO) Hybri-max	Sigma	D2650-100ML	Múltiples proveedores
DMEM	Gibco	C11995500BT	Medio
DMEM /F12	Gibco	C11330500BT	Medio
EDTA	Invitrogen	15575-020	0.5 M PH 8.0
FBS	NATOCOR	SFBE
Filtro de Suero	Millipore	SLGP033RB	0.22μ m, filtro Millex estéril
GlutaMax, 100X	Gibco	35050061	L-alanil-L-glutamina
Heparina	Sigma	H3149	2 mg/ml en PBS para usar
Matrigel, 100x	Corning	354277	Matriz extracelular (ECM)
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)	Gibco	11140050	MEM NEAA
mTeSR1	STEM CELL	85850	hPSCs medio de mantenimiento (MM)
Suplemento de N2	Gibco		17502048 Suplemento
Tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS)	GNM	GNM10010	Sin Ca+,Mg+,PH7.2± 0.1 0.1M
Taurina	Sigma	T0625	Suplemento
Placas de cultivo de fijación ultra baja Placa de Petri de 100 mm, placa de	Petri Corning	CLS3262-20EA

de fijación baja