Análisis de seguimiento de nanopartículas para la cuantificación y determinación del tamaño de vesículas extracelulares

Resumen

Demostramos cómo utilizar un nuevo instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas para estimar la distribución del tamaño y la concentración total de partículas de vesículas extracelulares aisladas de tejido adiposo perigonadal de ratón y plasma humano.

Resumen

Los roles fisiológicos y fisiopatológicos de las vesículas extracelulares (EV) se han vuelto cada vez más reconocidos, lo que hace que el campo EV sea un área de investigación en rápida evolución. Existen muchos métodos diferentes para el aislamiento de vehículos eléctricos, cada uno con ventajas y desventajas distintas que afectan el rendimiento y la pureza posteriores de los vehículos eléctricos. Por lo tanto, la caracterización de la preparación ev aislada de una fuente dada por un método elegido es importante para la interpretación de los resultados posteriores y la comparación de los resultados entre laboratorios. Existen varios métodos para determinar el tamaño y la cantidad de vehículos eléctricos, que pueden verse alterados por estados de enfermedad o en respuesta a afecciones externas. El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) es una de las tecnologías prominentes utilizadas para el análisis de alto rendimiento de vehículos eléctricos individuales. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la cuantificación y determinación del tamaño de los vehículos eléctricos aislados del tejido adiposo perigonadal de ratón y el plasma humano utilizando una tecnología innovadora para NTA que representa importantes avances en el campo. Los resultados demuestran que este método puede proporcionar datos reproducibles y válidos de concentración total de partículas y distribución de tamaño para vehículos eléctricos aislados de diferentes fuentes utilizando diferentes métodos, como lo confirma la microscopía electrónica de transmisión. La adaptación de este instrumento para NTA abordará la necesidad de estandarización en los métodos de NTA para aumentar el rigor y la reproducibilidad en la investigación de EV.

Introducción

Las vesículas extracelulares (VE) son pequeñas (0,03-2 μm) vesículas unidas a la membrana secretadas por casi todos los tipos de células¹. A menudo se les conoce como "exosomas", "microvesículas" o "cuerpos apoptóticos" dependiendo de su mecanismo de liberación y tamaño^2. Si bien inicialmente se pensó que los VEHÍCULOS eléctricos eran simplemente un medio para eliminar los desechos de la célula para mantener la homeostasis^3,ahora sabemos que también pueden participar en la comunicación intercelular a través de la transferencia de material molecular, incluido el ADN, el ARN (ARNm, microARN), los lí....

Protocolo

Todo el trabajo con estas muestras se realizó de conformidad con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y de la Junta de Revisión Institucional. En la figura 2se muestra una descripción general esquemática del método NTA.

Figura 2: Descripción general del método NTA utilizando el instrumento de seguimiento de partículas. La muestra se prepara y se inserta en el instrumento. Se abre el....

Resultados

Antes de esta demostración, la calibración del instrumento se probó por primera vez para garantizar la validez de los datos adquiridos mediante la medición de la distribución de tamaño de los estándares de perlas de poliestireno. Probamos la distribución de tamaño de cuentas de 100 nm y 400 nm utilizando los parámetros de grabación predeterminados y la configuración de procesamiento recomendada en este protocolo (Figura 8).

Para el estándar de perlas de poliestire.......

Discusión

Aquí, demostramos un protocolo para NTA de EV para medir la distribución de tamaño de una amplia gama de tamaños de partículas simultáneamente y medir la concentración total de EV en una muestra polidispersa. En este estudio, se utilizó tejido adiposo perigonadal de ratón y plasma humano como fuente de vehículos eléctricos. Sin embargo, los VEHÍCULOS eléctricos aislados de otros tejidos o fluidos biológicos como suero, orina, saliva, leche materna, líquido amniótico y sobrenadante de cultivo celular también se pueden usa.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1X dPBS	VWR	02-0119-1000	Para diluir muestras
Estándar de perlas de 100 nm	Thermo Scientific	3100A	Para probar la calibración de ViewSizer 3000
Estándar de perlas de 400 nm	Thermo Scientific	3400A	Para probar la calibración de ViewSizer 3000
Unidad de filtro centrífugo	Amicon	UFC901024	Para filtrar el diluyente de PBS
Tubos de recolección, 2 mL	Qiagen	19201	Para el aislamiento de vesículas extracelulares de plasma humano
Espolvoreador de aire comprimido	DustOff	DPSJB-12	Para limpiar cubetas
Inserto de cubeta	HORIBA		Scientific-Provisto con la compra de ViewSizer 3000
Plantilla de cubetas	HORIBA Scientific-Para		alinear la barra de agitación magnética mientras se colocan los insertos dentro de la cubeta; Provisto con la compra de ViewSizer 3000
Agua desionizada	VWR	02-0201-1000	Para limpiar cubetas
Computadora de escritorio con monitor, teclado, mouse y todos los cables necesarios		Dell-Provisto	con la compra de ViewSizer 3000
Etanol (70-100%)	Millipore Sigma-Para		limpiar cubetas
ExoQuick ULTRA	System Biosciences	EQULTRA-20A-1	Para el aislamiento de vesículas extracelulares de plasma humano
Viales de centelleo de vidrio con tapa	Thermo Scientific	B780020	Para limpiar cubetasHerramienta
"Hook"	Excelta-Provisto		con la compra de ViewSizer 3000
Paño de microfibra sin pelusa	Texwipe	TX629	Para limpiar cubetas y cubrir la superficie de trabajo
Tubos de microcentrífuga, 2 mL	Eppendorf	22363344	Para el aislamiento de vesículas extracelulares de plasma humano Barra agitadora
	Sp Scienceware	F37119-0005
Cubeta de cuarzo Suprasil con tapón	Agilent Technologies	AG1000-0544	Inicialmente suministrado con la compra de ViewSizer 3000
ViewSizer 3000	HORIBA Instrumento	seguimiento	científico-nanopartículas

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