El artículo describe la diferenciación dirigida paso a paso de células madre pluripotentes inducidas a organoides pulmonares enteros tridimensionales que contienen células pulmonares epiteliales proximales y distales junto con mesénquima.
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Artículo de método
Generación de organoides pulmonares enteros en 3D a partir de células madre pluripotentes inducidas para modelar la biología y la enfermedad del desarrollo pulmonar
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo y la enfermedad pulmonar humana han sido difíciles de estudiar debido a la falta de sistemas modelo in vitro biológicamente relevantes. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) se pueden diferenciar paso a paso en organoides pulmonares multicelulares 3D, formados por poblaciones de células epiteliales y mesenquimales. Recapitulamos las señales del desarrollo embrionario introduciendo temporalmente una variedad de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para generar eficientemente el endodermo definitivo, el endodermo del intestino anterior y, posteriormente, las células progenitoras pulmonares. Estas células se incrustan en el medio de matriz de membrana basal reducida por factor de crecimiento (GFR), lo que les permite desarrollarse espontáneamente en organoides pulmonares 3D en respuesta a factores de crecimiento externos. Estos organoides pulmonares completos (WLO) se someten a etapas tempranas del desarrollo pulmonar, incluida la morfogénesis ramificada y la maduración después de la exposición a dexametasona, AMP cíclico e isobutilxantina. Los WLO poseen células epiteliales de las vías respiratorias que expresan los marcadores KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) y MUC5AC (cáliz), así como células epiteliales alveolares que expresan HOPX (alveolar tipo I) y SP-C (alveolar tipo II). Las células mesenquimales también están presentes, incluida la actina del músculo liso (AME) y el receptor A del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα). Los WLO derivados de iPSC se pueden mantener en condiciones de cultivo 3D durante muchos meses y se pueden clasificar para marcadores de superficie para purificar una población celular específica. Los WLO derivados de iPSC también se pueden utilizar para estudiar el desarrollo pulmonar humano, incluida la señalización entre el epitelio pulmonar y el mesénquima, para modelar mutaciones genéticas en la función y el desarrollo de las células pulmonares humanas, y para determinar la citotoxicidad de los agentes infecciosos.
Introducción
El pulmón es un órgano complicado, heterogéneo y dinámico que se desarrolla en seis estadios distintos: maduración embrionaria, pseudoglandular, canalicular, saccular, alveolar y microvascular1,2. Las dos últimas fases ocurren pre y postnatalmente en el desarrollo humano, mientras que las primeras cuatro etapas ocurren exclusivamente durante el desarrollo fetal, a menos que ocurra el parto prematuro3. La fase embrionaria comienza en la capa germinal endodérmica y concluye con la brotación de la tráquea y las yemas pulmonares. El desarrollo pulmonar ocurre en parte a través de la señaliz....
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Protocolo
Este protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Programa de Protecciones de Investigación Humana de UCSD (181180).
1. Inducción definitiva del endodermo a partir de células madre pluripotentes inducidas (Día 1 - 3)
- Descongele lentamente el medio de matriz de membrana basal reducida (GFR) sobre hielo 30 minutos antes de su uso. En dmEM/F12 frío, mezclar, diluir el medio de matriz BM GFR 1:1 de tal manera que constituya el 50% de este medio. Coloque las puntas de pipeta P1000 en el congelador para enfriarlas antes de usarlas.
- Cubra cada pocillo de una placa de 12 pocillos con 500 μL de med....
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Resultados
24 horas después del emplatado, día 1, las iPSC deben ser 50% -90% confluentes. En el día 2, el DE debe ser 90%-95% confluente. Durante la inducción de DE, es común observar una muerte celular significativa en el día 4, pero las células unidas conservarán una morfología de adoquines compacta (Figura 2b). Suspenda la diferenciación si la mayoría de las células adherentes se desprenden y considera acortar la exposición a los medios DE con activina A en 6-12 h. Durante la inducción de AFE, la m.......
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Discusión
La diferenciación exitosa de organoides pulmonares enteros (WLO) en 3D se basa en un protocolo de 6 semanas de varios pasos con atención al detalle, incluido el tiempo de exposición a factores de crecimiento y moléculas pequeñas, densidad celular después del pasaje y la calidad de las hiPSC. Para solucionar problemas, consulte la Tabla 2. Las hiPSC deben ser aproximadamente 70%-80% confluentes, con menos del 5% de diferenciación espontánea antes de la disociación. Este protocolo requiere el medio "mTeSR .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cell Culture | |||
| 12 pocillos | Insertos Corning | 3512 | |
| de 12 pocillos, 0,4um, translúcido | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ácido ascórbico | Sigma | A4544 | |
| B27 sin ácido retinoico | ThermoFisher | 12587010 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) Fracción V, solución al 7,5% | Gibco | 15260-037 | |
| Dispasa | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Tecnologías | 35050061 | |
| Jamón' s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove' s Dulbecco modificado' s Medio (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monotioglicerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/caja) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pluma/estreptococo | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 RPMI1640 | |
| + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Inhibidor de rocas) | R& D Systems | 1254/1 | |
| Factores de crecimiento/Moléculas pequeñas | |||
| Activina A R | & D Systems | 338-AC | |
| Ácido retinoico (RA) totalmente trans) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R& D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R& D Systems | 3093 | |
| EGF | R& D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R& D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R& D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R& D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R& D Systems | 297-VP/CF | |
| fuerte>Anticuerpos primarios | Tasa de dilución | ||
| CXCR4-PE | R& D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.1805555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.1458333333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.1805555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R& D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (maduro) | 7 Colinas | 48604 | 1:1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (maduro) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
Referencias
- Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M.
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Reimpresiones y permisos
