El artículo describe la diferenciación dirigida paso a paso de células madre pluripotentes inducidas a organoides pulmonares enteros tridimensionales que contienen células pulmonares epiteliales proximales y distales junto con mesénquima.
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Artículo de método
Generación de organoides pulmonares enteros en 3D a partir de células madre pluripotentes inducidas para modelar la biología y la enfermedad del desarrollo pulmonar
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo y la enfermedad pulmonar humana han sido difíciles de estudiar debido a la falta de sistemas modelo in vitro biológicamente relevantes. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) se pueden diferenciar paso a paso en organoides pulmonares multicelulares 3D, formados por poblaciones de células epiteliales y mesenquimales. Recapitulamos las señales del desarrollo embrionario introduciendo temporalmente una variedad de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para generar eficientemente el endodermo definitivo, el endodermo del intestino anterior y, posteriormente, las células progenitoras pulmonares. Estas células se incrustan en el medio de matriz de membrana basal reducida por factor de crecimiento (GFR), lo que les permite desarrollarse espontáneamente en organoides pulmonares 3D en respuesta a factores de crecimiento externos. Estos organoides pulmonares completos (WLO) se someten a etapas tempranas del desarrollo pulmonar, incluida la morfogénesis ramificada y la maduración después de la exposición a dexametasona, AMP cíclico e isobutilxantina. Los WLO poseen células epiteliales de las vías respiratorias que expresan los marcadores KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) y MUC5AC (cáliz), así como células epiteliales alveolares que expresan HOPX (alveolar tipo I) y SP-C (alveolar tipo II). Las células mesenquimales también están presentes, incluida la actina del músculo liso (AME) y el receptor A del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα). Los WLO derivados de iPSC se pueden mantener en condiciones de cultivo 3D durante muchos meses y se pueden clasificar para marcadores de superficie para purificar una población celular específica. Los WLO derivados de iPSC también se pueden utilizar para estudiar el desarrollo pulmonar humano, incluida la señalización entre el epitelio pulmonar y el mesénquima, para modelar mutaciones genéticas en la función y el desarrollo de las células pulmonares humanas, y para determinar la citotoxicidad de los agentes infecciosos.
Introducción
El pulmón es un órgano complicado, heterogéneo y dinámico que se desarrolla en seis estadios distintos: maduración embrionaria, pseudoglandular, canalicular, saccular, alveolar y microvascular1,2. Las dos últimas fases ocurren pre y postnatalmente en el desarrollo humano, mientras que las primeras cuatro etapas ocurren exclusivamente durante el desarrollo fetal, a menos que ocurra el parto prematuro3. La fase embrionaria comienza en la capa germinal endodérmica y concluye con la brotación de la tráquea y las yemas pulmonares. El desarrollo pulmonar ocurre en parte a través de la señalización entre las células epiteliales y mesenquimales4. Estas interacciones dan como resultado la ramificación pulmonar, la proliferación, la determinación del destino celular y la diferenciación celular del pulmón en desarrollo. El pulmón se divide en zonas conductoras (tráquea a los bronquiolos terminales) y zonas respiratorias (bronquiolos respiratorios a los alvéolos). Cada zona contiene tipos únicos de células epiteliales; incluyendo células basales, secretoras, ciliadas, de cepillo, neuroendocrinas e ionocitos en la vía aérea conductora5, seguidas de células alveolares tipo I y II en el epitelio respiratorio6. Todavía se desconoce mucho sobre el desarrollo y la respuesta a la lesión de los diversos tipos de células. Los modelos organoides pulmonares derivados de iPSC permiten el estudio de los mecanismos que impulsan el desarrollo pulmonar humano, los efectos de las mutaciones genéticas en la función pulmonar y la respuesta tanto del epitelio como del mesénquima a los agentes infecciosos sin la necesidad de tejido pulmonar humano primario.
Los marcadores correspondientes a las diversas etapas de la diferenciación embrionaria incluyen CXCR4, cKit, FOXA2 y SOX17 para el endodermo definitivo (DE)7, FOXA2, TBX1 y SOX2 para el endodermo del intestino anterior (AFE)8, y NKX2-1 para las células progenitoras pulmonares tempranas9. En el desarrollo pulmonar embrionario, el intestino anterior se divide en el esófago dorsal y la tráquea ventral. Las yemas de los pulmones derecho e izquierdo aparecen como dos bolsas externas independientes alrededor de la yema traqueal10. Durante la morfogénesis ramificada, el mesénquima que rodea el epitelio produce tejido elástico, músculo liso, cartílago y vasculatura11. La interacción entre el epitelio y el mesénquima es esencial para el desarrollo pulmonar normal. Esto incluye la secreción de FGF1012 por el mesénquima y SHH13 producida por el epitelio.
Aquí, describimos un protocolo para la diferenciación dirigida de hiPSCs en organoides pulmonares enteros tridimensionales (3D) (WLO). Si bien existen enfoques similares que incorporan el aislamiento de células progenitoras pulmonares a través de la clasificación en la etapa LPC para hacer organoides similares a los alveolares14,15 (distales) u organoides de las vías respiratorias16 (proximales), o generar esferoides del intestino anterior ventral-anterior para hacer organoides pulmonares humanos que expresan marcadores de células alveolares y mesenquimales y organoides progenitores de punta de yema17 , la fuerza de este método es la inclusión de los tipos de células epiteliales y mesenquimales pulmonares para modelar y orquestar la morfogénesis, maduración y expansión de la ramificación pulmonar in vitro.
Este protocolo utiliza moléculas pequeñas y factores de crecimiento para dirigir la diferenciación de las células madre pluripotentes a través del endodermo definitivo, el endodermo del intestino anterior y las células progenitoras pulmonares. Estas células se inducen a organoides pulmonares enteros en 3D a través de importantes pasos de desarrollo, incluida la ramificación y la maduración. El resumen del protocolo de diferenciación se muestra en la Figura 1a con imágenes representativas de campo brillante de diferenciación endodérmica y organoide que se muestran en la Figura 1b. La Figura 1c,d muestra los detalles de la expresión génica de la diferenciación endodérmica, así como la expresión génica de las poblaciones proximal y distal de las células epiteliales pulmonares después de completar la diferenciación.
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Protocolo
Este protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Programa de Protecciones de Investigación Humana de UCSD (181180).
1. Inducción definitiva del endodermo a partir de células madre pluripotentes inducidas (Día 1 - 3)
- Descongele lentamente el medio de matriz de membrana basal reducida (GFR) sobre hielo 30 minutos antes de su uso. En dmEM/F12 frío, mezclar, diluir el medio de matriz BM GFR 1:1 de tal manera que constituya el 50% de este medio. Coloque las puntas de pipeta P1000 en el congelador para enfriarlas antes de usarlas.
- Cubra cada pocillo de una placa de 12 pocillos con 500 μL de medio de matriz de membrana basal GFR al 50% preparado en DMEM/F12 helado. Una vez que se haya recubierto el número deseado de pocillos, retire cualquier exceso de mezcla media y / o burbujas de los pozos y coloque la placa sobre hielo o refrigerador a 4 ° C durante 20 minutos para que cuaje. Luego, mueva la placa a la incubadora a 37 ° C durante la noche para gelificar y secar.
- Una vez que las hiPSC alcancen el 70-90% de confluencia, agregue 10 μM de inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632 una hora antes de la disociación. Aspire el medio y lave una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Disociar las hiPSCs añadiendo medio de desprendimiento celular (0,5 mL/pocillo de una placa de 12 pocillos) e incubar durante 20 min a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5%.
- Retire las placas de la incubadora y agregue 0,5 ml/12 pocillos de medio de paso de células madre (Tabla 1) a los pocillos; triturar suavemente las células usando una punta P1000 para obtener la suspensión de una sola célula. Transferir células disociadas a un tubo centrífugo cónico de 15 ml; centrífuga durante 5 min a 300 x g.
- Aspire el medio y resuspenda el pellet celular con 1 ml de medio mTeSR Plus suplementado con un inhibidor de ROCK de 10 μM (Y-27632). Realice un recuento de celdas. Agregue 2.0 x 105 hiPSCs en 1 ml de mTeSR suplementado con el inhibidor de ROCK Y-27632 por pocillo de una placa recubierta de media membrana basal GFR de 12 pocillos. Incubar a 37 °C durante la noche.
NOTA: El número de siembra de celdas debe optimizarse por línea celular. 24 h después del revestimiento, los pocillos deben ser 50% -70% confluentes. - El día 1, aspire el mTeSR Plus y agregue medios de inducción de Endoderm Definitivo (DE) (Tabla 1) suplementados con 100 ng/ml de activina A humana y 5 μM de inhibidor de GSK3β/activador Wnt CHIR99021.
NOTA: Los medios DE con inhibidor de GSK3β/activador de Wnt CHIR99021 deben retirarse dentro de las 20-24 h de la inducción del día 1 DE para una diferenciación exitosa. - El día 2 y el día 3, cambie a medios de inducción DE suplementados con 100 ng / ml de activina A solamente.
NOTA: La diferenciación de DE no debe exceder un total de 72 h, o la eficacia disminuirá. En el día 4, si se observa una muerte de células grandes, disminuya el tiempo total de exposición a los medios de DE en 6-12 h. - Para analizar la eficiencia de DE, confirme una expresión superior al 90% de CXCR4 y/o cKit mediante citometría de flujo o análisis de inmunofluorescencia de FOXA2 y/o SOX17 (Figura 2a).
2. Inducción del endodermo del intestino anterior (AFE) (Día 4 - 6)
- El día 4, cambie el medio a medio basal libre sérico (SFBM) (Tabla 1) suplementado con 10 μM SB431542 y 2 μM de dorsomorfina para la inducción de AFE. Cambie los medios de AFE diariamente durante 3 días (día 4, día 5 y día 6).
- Para analizar la eficiencia de AFE, confirme la expresión robusta de SOX2, TBX1 y FOXA2 a través de la tinción por inmunofluorescencia (Figura 2b).
3. Diferenciación de células progenitoras pulmonares (LPC) (Día 7 - 16)
- El día 7, descongele el medio de matriz de membrana basal GFR en hielo. Aspire fuera del medio AFE y lave bien con 1x PBS. Añadir 1 ml de solución de desprendimiento celular e incubar durante 10 min a 37 °C.
- Añadir 1 ml de medio de enfriamiento (2% FBS en DMEM/F12) a los pocillos que contienen solución de desprendimiento celular. Mantenga las celdas como agregados mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo suavemente. Asegúrese de que todas las células se desalojen y se transfieran a un tubo de centrífuga cónica de 15 ml. Centrífuga durante 5 min a 300 x g.
- Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en medio de enfriamiento suplementado con 10 ng/mL de proteína morfogénica ósea recombinante humana-4 (BMP4), 0,1 μM de ácido retinoico trans (AR), 3 μM de inhibidor de GSK3β/activador de Wnt CHIR99021 y 10 μM de inhibidor de roca Y-27632.
- Realice un recuento de celdas. Agregue 2.5 x 105 células a 100 μL de medio de matriz de membrana basal GFR fría, mezcle bien y coloque gotas en un pozo de una placa de 12 pocillos. Incubar la placa a 37 °C durante 30-60 min para permitir que el medio polimerice. Agregue 1 ml de medio LPC suplementado con 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632 por pozo, asegurando que la gota media esté completamente sumergida e incube a 37 ° C durante la noche.
- El día 8, 24 h después de la inducción de LPC, cambie el medio lpC para eliminar el inhibidor de ROCK Y-27632. Cambie el medio LPC cada dos días durante un total de 9-11 días.
NOTA: Si el medio se vuelve amarillo dentro de las 24 h, cambie de medio todos los días. - Para analizar la eficiencia de LPC, confirmar la expresión robusta del factor de transcripción intracelular NKX2-1 o realizar citometría de flujo para marcadores de superficie CD47hi/CD26low15 o CPM18 (Figura 2c). Grossly, los esferoides LPC deben ser redondos y transparentes (Figura 2c).
NOTA: No proceda con la diferenciación organoide pulmonar si la eficiencia de NKX2-1 es inferior al 30%.
4.3D inducción organoide pulmonar (Día 16 - 22)
- El día 17, descongele el medio de matriz de membrana basal GFR en hielo. Aspirar el medio de inducción LPC. Luego agregue 2 μg / ml de dispasa (1 ml) al pozo y vuelva a suspender la mezcla de medio / dispasa con una pipeta P1000. Incubar a 37 °C durante 15 min. Triturar la mezcla de nuevo e incubar a 37 °C durante otros 15 min.
- Transfiera la dispasa y las células a un tubo centrífugo cónico de 15 ml. Use PBS refrigerado (2-3 ml) para lavar el pozo y volver a suspender la mezcla de dispasa/célula. Centrífuga durante 5 min a 400 x g. Retire manualmente el sobrenadante, teniendo cuidado de no distusar la capa de gránulos del medio/célula. Repita el lavado de PBS refrigerado y centrífique el tubo de centrífuga cónica durante otros 5 minutos a 400 x g.
- Retire manualmente el sobrenadante y luego agregue 2 ml de solución de disociación a base de tripsina al tubo de centrífuga cónica. Incubar a 37 °C durante 12 min.
- Después de la incubación, resuspenda las células con una punta de pipeta P1000. A continuación, agregue un volumen igual de medios de enfriamiento al tubo cónico de la centrífuga y gire hacia abajo a 400 x g durante 5 minutos. Aspirar las células sobrenadantes y resuspendidas en medio de enfriamiento + 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632.
NOTA: La inducción organoide pulmonar exitosa ocurre cuando las células se incrustan como agregados, no como células individuales, ajuste el pipeteo en consecuencia. - Realice un recuento de celdas. Calcule el volumen necesario para obtener 5.0-8.0 x 104 células por pozo. Alícuota la célula LPC se agrega en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y centrífuga durante 5 minutos a 400 x g. Retire el exceso de sobrenadante, teniendo cuidado de no agitar la bolita celular. Deje solo 10 μL de medios residuales.
- Vuelva a suspender el pellet celular en 200 μL de medio de matriz de membrana basal GFR fría y agréguelo a los insertos de membrana de cultivo celular (6,5 mm de diámetro, poro de 0,4 μm, membrana de poliéster). Incubar la placa a 37 °C durante 30-60 min para permitir que el medio de matriz de membrana basal GFR se polimerice.
- Añadir 1 ml de medio de inducción organoide 3D (Tabla 1) suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos-7 (FGF7) (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inhibidor de GSK3β/activador de Wnt CHIR (3 μM), factor de crecimiento epidérmico (EGF) (10 ng/mL) y 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632 a la cámara basolateral del inserto de membrana. Cambie el medio cada dos días durante 6 días.
5.3D Ramificación organoidea pulmonar (Día 23 - 28)
- El día 23 cambio a medio de ramificación 3D (Tabla 1) suplementado con FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inhibidor de GSK3β/activador de Wnt CHIR99021 (3 μM), AR (0,1 μM), EGF (10 ng/mL) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) / factor de crecimiento placentario (PlGF) (10 ng/mL). Cambie el medio cada dos días durante 6 días.
NOTA: En el día 6 de la diferenciación de ramificación 3D, debe haber múltiples organoides ramificados (Figura 2).
6.3D maduración organoide pulmonar (Día 29 - 34)
- En el día 29, cambie a medio de maduración 3D (Tabla 1), que es el mismo que el medio de ramificación 3D pero con la adición de dexametasona (50 nM), cAMP (100 μM) y 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), un inhibidor de la fosfodiesterasa también denominado isobutilxantina (100 μM). Cambie el medio cada dos días durante 6 días.
NOTA: Dentro de las 24 h posteriores a la maduración 3D, los organoides ramificados deben expandirse y transformarse en esferas transparentes.
7.3D Inmunocitoquímica organoide pulmonar
- Para el análisis organoide 3D de todo el pulmón, fije el medio de matriz de membrana basal GFR en los insertos de membrana con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 1 h a 4 °C. Incruste en cera de parafina y monte en diapositivas según los protocolos estándar publicados.
- Realizar la recuperación de antígenos antes de la tinción. Los marcadores de las vías respiratorias incluyen KRT5, MUC5AC y SCGB3A2. Los marcadores alveolares incluyen SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 y HOPX (Figura 3).
8. Extracción de organoides pulmonares enteros del medio de matriz de membrana basal TFG para paso, FACS o criopreservación
- Para disociar los organoides del medio de matriz de membrana basal TFG, retire los medios de la cámara basal y agregue 2 μg / ml de dispasa (1 ml) en la cámara apical.
- Triture suavemente la mezcla de medio / dispase con una pipeta P1000 y colóquela en la incubadora durante 15 min. Tritura suavemente la mezcla de nuevo e incuba durante otros 15 minutos.
- Añadir 1 ml de PBS refrigerado (4 °C) y transferir organoides con el medio de matriz a un tubo centrífugo cónico de 15 ml. Girar a 400 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante con cuidado, para no molestar la bolita celular.
- Lavar una vez más con 1 ml de PBS refrigerado y girar a 400 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante con cuidado, para no perturbar la mezcla de medio/célula.
- Agregue 1 ml de solución de desprendimiento celular al tubo de centrífuga cónica, triture suavemente resuspend el medio de matriz de membrana basal GFR/mezcla celular. Colocar en la incubadora durante 12 min para las células de paso como agregados o para la criopreservación), o 20 min para la suspensión de una sola célula.
- Agregue el mismo volumen de medios de enfriamiento y gire hacia abajo a 400 x g durante 5 minutos. Resuspend en medio de enfriamiento + 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632.
NOTA: En este paso, no se debe ver ningún medio residual de membrana basal en el tubo. Si queda medio residual, repita los pasos 8.5 y 8.6. - Realice un recuento de celdas. Calcule el volumen necesario para las aplicaciones posteriores.
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Resultados
24 horas después del emplatado, día 1, las iPSC deben ser 50% -90% confluentes. En el día 2, el DE debe ser 90%-95% confluente. Durante la inducción de DE, es común observar una muerte celular significativa en el día 4, pero las células unidas conservarán una morfología de adoquines compacta (Figura 2b). Suspenda la diferenciación si la mayoría de las células adherentes se desprenden y considera acortar la exposición a los medios DE con activina A en 6-12 h. Durante la inducción de AFE, la m...
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Discusión
La diferenciación exitosa de organoides pulmonares enteros (WLO) en 3D se basa en un protocolo de 6 semanas de varios pasos con atención al detalle, incluido el tiempo de exposición a factores de crecimiento y moléculas pequeñas, densidad celular después del pasaje y la calidad de las hiPSC. Para solucionar problemas, consulte la Tabla 2. Las hiPSC deben ser aproximadamente 70%-80% confluentes, con menos del 5% de diferenciación espontánea antes de la disociación. Este protocolo requiere el medio "mTeSR ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cell Culture | |||
| 12 pocillos | Insertos Corning | 3512 | |
| de 12 pocillos, 0,4um, translúcido | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ácido ascórbico | Sigma | A4544 | |
| B27 sin ácido retinoico | ThermoFisher | 12587010 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) Fracción V, solución al 7,5% | Gibco | 15260-037 | |
| Dispasa | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Tecnologías | 35050061 | |
| Jamón' s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove' s Dulbecco modificado' s Medio (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monotioglicerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/caja) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pluma/estreptococo | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 RPMI1640 | |
| + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Inhibidor de rocas) | R& D Systems | 1254/1 | |
| Factores de crecimiento/Moléculas pequeñas | |||
| Activina A R | & D Systems | 338-AC | |
| Ácido retinoico (RA) totalmente trans) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R& D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R& D Systems | 3093 | |
| EGF | R& D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R& D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R& D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R& D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R& D Systems | 297-VP/CF | |
| fuerte>Anticuerpos primarios | Tasa de dilución | ||
| CXCR4-PE | R& D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.1805555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.1458333333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.1805555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R& D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (maduro) | 7 Colinas | 48604 | 1:1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (maduro) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
Referencias
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