Aquí, presentamos un protocolo para analizar la ultraestructura de los megacariocitos in situ utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las médulas óseas murinas se recogen, se fijan, se incrustan en resina epoxi y se cortan en secciones ultrafinas. Después de la tinción por contraste, la médula ósea se observa bajo un microscopio TEM a 120 kV.
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Artículo de método
In situ Exploración de la megacariopoyesis murina mediante microscopía electrónica de transmisión
En este artículo
Resumen
Resumen
La diferenciación y maduración de los megacariocitos se producen en estrecha asociación con los componentes celulares y extracelulares de la médula ósea. Estos procesos se caracterizan por la aparición gradual de estructuras esenciales en el citoplasma de megacariocitos, como un núcleo poliploide y polilobulado, una red de membrana interna llamada sistema de membrana de demarcación (DMS) y los gránulos densos y alfa que se encontrarán en las plaquetas circulantes. En este artículo, describimos un protocolo estandarizado para el estudio ultraestructural in situ de megacariocitos murinos utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM), que permite la identificación de características clave que definen su etapa de maduración y densidad celular en la médula ósea. Las médulas óseas se enjuagan, se fijan, se deshidratan en etanol, se incrustan en resina plástica y se montan para generar secciones transversales. Las secciones semidelgado y delgado se preparan para observaciones histológicas y TEM, respectivamente. Este método se puede utilizar para cualquier célula de la médula ósea, en cualquier instalación de EM y tiene la ventaja de utilizar tamaños de muestra pequeños que permiten la combinación de varios enfoques de imagen en el mismo ratón.
Introducción
Los megacariocitos son células poliploides grandes especializadas, localizadas en la médula ósea, responsables de la producciónplaquetaria 1. Se originan a partir de células madre hematopoyéticas a través de un intrincado proceso de maduración, durante el cual los precursores de megacariocitos aumentan progresivamente de tamaño, mientras sufren extensos cambios morfológicos concomitantes en el citoplasma y el núcleo2. Durante la maduración, los megacariocitos desarrollan una serie de elementos estructurales distinguibles que incluyen: un núcleo polilobulado, invaginaciones de la membrana superficial que forman el sistema....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas europeas 2010/63/EU y el Comité CREMEAS sobre la Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). El protocolo se muestra esquemáticamente en la Figura 1.
1. Recolección y fijación de médula ósea ( Figura 1A)
PRECAUCIÓN: Este procedimiento incluye sustancias cancerígenas, mutagénicas y / o tóxicas y se realiza bajo una campana de extracción química. Use el equipo de protección adecua....
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Resultados
Histología de la médula ósea
La observación de la histología azul de toluidina de la médula ósea bajo un microscopio de luz es clave para analizar rápidamente la arquitectura general del tejido en términos de, por ejemplo, la compacidad del tejido, la continuidad del microvaso y el tamaño y la forma de los megacariocitos (Figura 1D). Se realiza antes de secciones ultrafinas para determinar la necesidad de cortar más profundamente en el bloqueo de la médul.......
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Discusión
El examen directo de los megacariocitos en su entorno nativo es esencial para comprender la megacaripoyesis y la formación de plaquetas. En este manuscrito, proporcionamos un método de microscopía electrónica de transmisión que combina el lavado de la médula ósea y la fijación por inmersión, lo que permite diseccionar in situ las características morfológicas de todo el proceso de morfogénesis de megacariocitos que tiene lugar en la médula ósea.
El lavado de la médula ósea es un paso c.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), la Unión Europea a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y por la Subvención ANR-17-CE14-0001-01 a H.d.S.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2,4,6-Tri(dimetilaminometil)fenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, EE. UU. | 21310 | |
| punto de fusión LM-3 de agarosa | la microscopía electrónica, EE. UU. | 1670-B | |
| CaCl2 Cloruro de calcio hexahidratado | Merck, Alemania | 2083 | |
| Rejillas de cobre 200 malla delgada Instrumento | Oxford, Agar Scientifics, Inglaterra | T200-CU | |
| Ácido dimetilarsínico sal sódica trihidrato | Merck, Alemania | 8.20670.0250 | |
| Anhídrido succínico de dodecenil (DDSA) | Ladd Research Industries, EE. UU. | 21340 | |
| Hoja de afeitar de acero inoxidable de doble filo | Microscopía electrónica Sciences-EMS, EE. UU | EM-72000 | |
| Etanol absolut | VWR International, Francia | 20821296 | |
| Filtro papel, 90 mm de diámetro | Whatman, Inglaterra | 512-0326 | |
| Molde de silicona de incrustación plana | Oxford Instrument, Agar Scientific, Inglaterra | G3533 | |
| Glutaraldehído 25% | Microscopía electrónica Sciences-EMS, EE. UU | 16210 | |
| Placa de calor Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Cuchillo de diamante Histo 45° | Diatomea, Suiza | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus Microscopio TEM | JEOL, JAPÓN | EM-21001BU | |
| Citrato de plomo - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| Resina LX-112 | Ladd Research Industries, EE. UU. | 21310 | |
| MgCl2 Cloruro de magnesio hexahidratado | Sigma, Francia | M2393-100g | |
| Medio de montaje - Poli(metacrilato de butilo-co-metacrilato de metilo) | Microscopía electrónica Sciences-EMS, EE. UU | . 15320 | |
| Anhídrido de metilo nádico (NMA) | Ladd Research Industries, EE. UU | 21350 | |
| Tetróxido de osmio 2% | Merck, Alemania | 19172 | |
| Óxido de propileno (1.2-epoxipropano) | Sigma, Francia | 82320-250ML | |
| Solución salina inyectable 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, Francia | MA 575 420 6 | |
| Bisturí Hoja de acero quirúrgico | Swann-Morton, | Inglaterra.0508 | |
| Tetraborato de sodio - Bórax | Sigma, Francia | B-9876 | |
| Sacarosa | Merck, Alemania | 84100-1KG | |
| Filtro de jeringa 0.2µ m | Pall Corporation, EE. UU. | 514-4126 | |
| Azul de toluidina | Ladd Research Industries, EE. UU. | N10-70975 | |
| Recortadora EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrótomo Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Acetato de uranilo | Ladd Research Industries, EE. UU | 23620 |
Referencias
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C.
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Reimpresiones y permisos
