Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

Quentin Kimmerlin; Manuela Tavian; Christian Gachet; François Lanza; Nathalie Brouard

doi:10.3791/62498

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Artículo de método

Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

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DOI:

10.3791/62498

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20 de mayo de 2021

Quentin Kimmerlin¹ , Manuela Tavian² , Christian Gachet¹ , François Lanza¹ , Nathalie Brouard¹

¹Université de Strasbourg, INSERM UMR S1255, EFS Grand-EST, ²UMR-S1113 –IRFAC, Université de Strasbourg

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Resumen

Este método describe la purificación por citometría de flujo de MEP y MKp de fémures, tibias y huesos pélvicos de ratones.

Resumen

Los megacariocitos de la médula ósea son células poliploides grandes que aseguran la producción de plaquetas sanguíneas. Surgen de las células madre hematopoyéticas a través de la megacariopoyesis. Las etapas finales de este proceso son complejas y clásicamente involucran a los progenitores bipotentes de megacariocitos-eritrocitos (MEP) y los progenitores de megacariocitos unipotentes (MKp). Estas poblaciones preceden a la formación de megacariocitos de buena fe y, como tales, su aislamiento y caracterización podrían permitir el análisis robusto e imparcial de la formación de megacariocitos. Este protocolo presenta en detalle el procedimiento para recolectar células hematopoyéticas de la médula ósea de ratón, el enriquecimiento de progenitores hematopoyéticos a través del agotamiento magnético y, finalmente, una estrategia de clasificación celular que produce poblaciones MEP y MKp altamente purificadas. Primero, las células de la médula ósea se recolectan del fémur, la tibia y también la cresta ilíaca, un hueso que contiene un alto número de progenitores hematopoyéticos. El uso de huesos de la cresta ilíaca aumenta drásticamente el número total de células obtenidas por ratón y, por lo tanto, contribuye a un uso más ético de los animales. Se optimizó un agotamiento del linaje magnético utilizando perlas magnéticas de 450 nm que permiten una clasificación celular muy eficiente por citometría de flujo. Finalmente, el protocolo presenta la estrategia de etiquetado y gating para la clasificación de las dos poblaciones progenitoras de megacariocitos altamente purificadas: MEP (Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^dim)y MKp (Lin^- Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^brillante) ). Esta técnica es fácil de implementar y proporciona suficiente material celular para realizar i) caracterización molecular para un conocimiento más profundo de su identidad y biología, ii) ensayos de diferenciación in vitro, que proporcionarán una mejor comprensión de los mecanismos de maduración de los megacariocitos, o iii) modelos in vitro de interacción con su microambiente.

Introducción

Las plaquetas sanguíneas son producidas por los megacariocitos. Estas grandes células poliploides se localizan en la médula ósea y como para todas las células sanguíneas se derivan de las Células Madre Hematopoyéticas (HSC)¹. La vía clásica de producción de megacariocitos en la médula ósea se origina a partir de HSC e implica la generación de diferentes progenitores que restringen progresivamente su potencial de diferenciación². El primer progenitor que firma el compromiso con el linaje megacariocítico es el Progenitor Megacariocito-Eritrocito (MEP), un progenitor bipotente capaz de producir tanto células eritroides como....