Dinámica de formación de proplatlets de explantes de médula ósea fresca de ratón

Resumen

Aquí, detallamos el método de explante de médula ósea, desde la preparación de muestras hasta el análisis microscópico de diapositivas, para evaluar la capacidad de los megacariocitos que se han diferenciado en su entorno fisiológico para formar proplatlets.

Resumen

La última etapa de la megacaropoyesis conduce a extensiones citoplasmáticas de megacariocitos maduros, los llamados proplatlets. Mucho se ha aprendido sobre la formación de proplatlet utilizando megacariocitosdiferenciados in vitro; sin embargo, existe una creciente evidencia de que los sistemas de cultivo convencionales no recapitulan fielmente el proceso de diferenciación/maduración que tiene lugar dentro de la médula ósea. En este manuscrito, presentamos un método de explante descrito inicialmente en 1956 por Thiéry y Bessis para visualizar megacariocitos que han madurado en su entorno nativo, evitando así posibles artefactos y malas interpretaciones. Las médulas óseas frescas se recogen enjuagando los fémures de los ratones, se cortan en secciones transversales de 0,5 mm y se colocan en una cámara de incubación a 37 ° C que contiene un tampón fisiológico. Los megacariocitos se hacen gradualmente visibles en la periferia del explante y se observan hasta 6 horas bajo un microscopio invertido acoplado a una cámara de video. Con el tiempo, los megacariocitos cambian su forma, con algunas células que tienen una forma esférica y otras que desarrollan extensiones gruesas o extienden muchos proplatelets delgados con ramificaciones extensas. Se llevan a cabo investigaciones cualitativas y cuantitativas. Este método tiene la ventaja de ser simple, reproducible y rápido, ya que numerosos megacariocitos están presentes, y clásicamente la mitad de ellos forman proplalets en 6 horas en comparación con 4 días para los megacariocitos de ratón cultivados. Además del estudio de ratones mutantes, una aplicación interesante de este método es la evaluación directa de los agentes farmacológicos en el proceso de extensión del proplatelet, sin interferir con el proceso de diferenciación que puede ocurrir en los cultivos.

Introducción

La técnica de explante de médula ósea fue desarrollada por primera vez por Thiéry y Bessis en 1956 para describir la formación de extensiones citoplasmáticas de megacariocitos de rata como un evento inicial en la formación de plaquetas¹. Utilizando contraste de fase y técnicas cinematográficas, estos autores caracterizaron la transformación de megacariocitos redondos maduros en células trombocitogénicas "parecidas a calamares" con extensiones citoplasmáticas que muestran movimientos dinámicos de elongación y contracción. Estos brazos se vuelven progresivamente más delgados hasta que se vuelven filiformes con pequeñas hinchazones a lo largo de l....

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas europeas 2010/63/EU y el Comité CREMEAS sobre la Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).

1. Preparación de reactivos

1. Preparar reactivos como se describe en la Tabla 1.
   1. Para el Stock I, disuelva cada polvo por separado. Asegúrese de que la osmolaridad de la preparación sea superior a 295 mOsm/L. Esta solución se puede almacenar a 4 °C durante un año.
   2. Para la preparación del tampón de Tyrode, haga la solución como s....

Resultados

Resultados cualitativos. Al comienzo del experimento, todas las células se compactan en la sección de médula ósea. Las células tardan 30 minutos en hacerse claramente visibles en la periferia de los explantes. Los megacariocitos son entonces reconocibles por su gran tamaño y su evolución puede ser estudiada a lo largo del tiempo (tamaño, forma, dinámica, extensión proplatelet y liberación plaquetaria)(Figura 2A). Los megacariocitos pequeños tienen un diámetro entre 20 y 30 μ.......

Discusión

Aquí describimos un método in vitro simple y de bajo costo para evaluar la eficiencia de los megacariocitos para extender los proplatlets que han crecido en la médula ósea. El modelo de explante de médula ósea para ratón tiene cuatro ventajas principales. En primer lugar, no se requieren habilidades técnicas avanzadas. En segundo lugar, el tiempo necesario para obtener proplatlets extensibles de megacariocitos es bastante corto, solo 6 horas para el método de explante, en comparación con un mínimo de 4 días para.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringas de 5 mL	Terumo	SS+05S1
Agujas de calibre 21	BD Microlance	301155
CaCl2.6H2O	Sigma	21108
Cámaras de incubación Coverwall	Microscopy Sciences	70324-02	Profundidad : 0,2 mm
HEPES	Sigma	H-3375	pH ajustado hasta 7.5
Albúmina sérica humana	Medicamento autorizado VIALEBEX	: n° 3400956446995	20% (200mg/mL -100mL)
KCl	Sigma	P9333
MgCl2.6H2O	Sigma	BVBW8448
Micro Cover Glass	Microscopía de Microscopía Ciencias	72200-40 Microscopio	mm x 55 mm
	Leica Microsystems SA, Westlar, Alemania	DMI8 - Cámara	lente de aire
	514341 Leica Microsystems SA, Westlar, Alemania	K5 CMS GmbH -14401137	resolución de imagen : 4,2 megapíxeles
Suero de ratón	BioWest	S2160-010
NaCl	Sigma	S7653
NaH2PO4. H2O	Sigma	S9638
NaHCO3	Sigma	S5761
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10.000 unidades/mL de penicilina, 10.000 μ g/mL de estreptomicina y 29,2 mg/mL de glutamina
Hoja de afeitar	Microscopía Electrónica Sciences	72000
Sacarosa D (+)	Sigma	G8270

de 22 microscópica con