Summary
SAMHD1 er en deoksynukleosidtrifosfattrifosfohydrolase med kritiske roller i menneskers helse og sykdom. Her presenterer vi en allsidig enzymkoblet SAMHD1-aktivitetsanalyse, distribuert i et 384-brønns mikroplateformat, som muliggjør evaluering av små molekyler og nukleotidanaloger som SAMHD1-substrater, aktivatorer og hemmere.
Abstract
Sterilt alfamotiv og HS-domeneholdig protein 1 (SAMHD1) er en sentral regulator av intracellulære deoksynukleosidtrifosfat (dNTP) bassenger, da dette enzymet kan hydrolysere dNTP i deres tilsvarende nukleosider og uorganiske trifosfater. På grunn av sin kritiske rolle i nukleotidmetabolismen, dens tilknytning til flere patologier og dens rolle i terapiresistens, utføres intens forskning for tiden for en bedre forståelse av både reguleringen og cellulær funksjon av dette enzymet. Av denne grunn er utvikling av enkle og rimelige høykapasitets mottagelige metoder for å undersøke småmolekylær interaksjon med SAMHD1, for eksempel allosteriske regulatorer, substrater eller hemmere, avgjørende. Til dette formål er den enzymkoblede malakittgrønne analysen en enkel og robust kolorimetrisk analyse som kan distribueres i et 384-mikrobrønnplateformat som tillater indirekte måling av SAMHD1-aktivitet. Da SAMHD1 frigjør trifosfatgruppen fra nukleotidsubstrater, kan vi koble en pyrofosfataseaktivitet til denne reaksjonen, og derved produsere uorganisk fosfat, som kan kvantifiseres av malakittgrøntreagenset gjennom dannelsen av et fosfolybdatomalakittgrønt kompleks. Her viser vi anvendelsen av denne metoden for å karakterisere kjente hemmere av SAMHD1 og å dechiffrere mekanismene involvert i SAMHD1-katalyse av ikke-kanoniske substrater og regulering av allosteriske aktivatorer, eksemplifisert ved nukleosidbaserte kreftmedisiner. Dermed er den enzymkoblede malakittgrønne analysen et kraftig verktøy for å studere SAMHD1, og dessuten kan den også brukes i studien av flere enzymer som frigjør fosfatarter.
Introduction
Sterilt alfamotiv og histidin-aspartat domeneholdig protein 1 (SAMHD1) er en sentral regulator av nukleotidhomeostase i pattedyrceller1 med mange roller i menneskers helse og sykdom2. Dette enzymet er i stand til å hydrolysere deoksynukleosidtrifosfater (dNTP) i deres kognitive deoksynukleosid og uorganiske trifosfatmolekyler 3,4, med denne aktiviteten allosterisk regulert av (d) NTP-overflod (gjennomgått i referanse5). Hver SAMHD1-monomer inneholder to allosteriske steder (AS1 og AS2) og ett katalytisk sted, og dannelsen av det aktive enzymet krever bestilt montering av en homotetramer ved (d) NTP-binding. Dimerisering av SAMHD1-monomerer utløses først gjennom binding av et guanintrifosfat (GTP eller dGTP) til AS1, og etterfølgende tetramerisering oppnås når et ekstra dNTP-molekyl binder seg til AS2, noe som muliggjør substrattilgang til katalytisk sted og påfølgende hydrolyse.
SAMHD1-substrater inkluderer de fire kanoniske dNTP-ene 3,4 sammen med noen base- og sukkermodifiserte nukleotider, inkludert trifosfatmetabolitter av flere nukleosidbaserte legemidler som brukes til behandling av virusinfeksjoner og kreft, hvorav flere også kan tjene som allosteriske aktivatorer 6,7,8,9,10,11. Som en konsekvens modulerer SAMHD1 effekten av mange av disse forbindelsene i sykdomsmodeller 7,8,9,10,11,12,13,14,15, og videre, når det gjelder deoksycytidinanalogen cytarabin (ara-C), som har vært standardbehandling for akutt myelogen leukemi (AML) i flere tiår, dikterer faktisk Behandlingseffekt ved denne sykdommen 7,8,16. SAMHD1 er dermed en potensiell biomarkør og terapeutisk mål for å forbedre effekten av nukleosidbaserte terapier17, og følgelig har vi og andre forsøkt å identifisere strategier for å inaktivere SAMHD1 i celler. Vi foreslo bruk av viralt protein X (Vpx) som en biologisk inhibitor for å målrette SAMHD1 for nedbrytning i kreftceller7, men denne tilnærmingen har en rekke begrensninger (diskutert i referanse12), og vi rapporterte også nylig en indirekte tilnærming til å undertrykke SAMHD1-aktivitet via inhibering av ribonukleotidreduktase som vi demonstrerte i forskjellige modeller av AML18. En rekke studier har forsøkt å identifisere små molekyler som er i stand til direkte å hemme SAMHD1, og til dags dato har flere slike molekyler blitt rapportert, men bare dokumentert hemming in vitro 6,9,19,20,21,22. Følgelig understreker mangel på små molekyler som potent hemmer SAMHD1-aktivitet i celler kombinert med de komplekse mekanismene for SAMHD1-katalyse av nukleosidbaserte terapier, behovet for videre undersøkelse. Derfor er robuste og ideelt gjennomstrømningsvennlige metoder for å undersøke småmolekylær interaksjon med SAMHD1 ideelle for å identifisere substrater, allosteriske regulatorer og hemmere av dette klinisk relevante enzymet.
Flere metoder er tilgjengelige som direkte måler dNTPase-aktiviteten til SAMHD1, for eksempel tynnsjiktskromatografi (TLC) 9,20,23 og høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) 9,21, men disse er ikke lett mottagelige for oppsett med høy gjennomstrømning. Et unntak er analysen rapportert av Mauney et al., som utnytter SAMHD1s evne til å hydrolysere bis (4-nitrofenyl) fosfat (b4NPP) til p-nitrofenol og p-nitrofenylfosfat når Mn2+ brukes som aktiverende kation, noe som resulterer i en kolorimetrisk forandring som lett kan måles i en mikrobrønnplate21. Denne analysen har blitt brukt til identifisering og karakterisering av SAMHD1-hemmere, men det bør bemerkes at hydrolyse forekommer i fravær av (d) NTP-aktivatorer og i nærvær av en sannsynlig ikke-fysiologisk aktiverende kation, begge er viktige advarsler å vurdere. Dette gjør også denne analysen mindre anvendelig for studier og identifisering av allosteriske regulatorer av SAMHD1.
I denne sammenheng kan en enzymkoblet tilnærming kombinert med malakittgrøntreagenset, som beskrevet i denne rapporten, være en allsidig metode for indirekte å måle dNTPase-aktiviteten til SAMHD1 og dessuten undersøke virkningen av forskjellige små molekyler på den. Malakittgrønnanalysen er en robust og pålitelig kolorimetrisk teknikk for påvisning av fritt uorganisk fosfat (Pi), basert på dannelsen av et molybdofosforsyrekompleks som fører til en kolorimetrisk forandring målt ved 620 nm24. Da SAMHD1-hydrolyse frigjør trifosfatgruppen fra nukleotidsubstrater, er det derfor nødvendig å koble denne reaksjonen med en (pyro) fosfataseaktivitet, som vil generere fritt uorganisk fosfat, før tilsetning av malakittgrøntreagenset. Malakittgrønnanalysen er følsom og kostnadseffektiv og har blitt mye brukt til identifisering og karakterisering av inhibitorer og substrater for enzymer som frigjør uorganiske fosfatgrupper enten i deres reaksjoner eller i nærvær av et koblingsenzym. Det har blitt mye brukt i karakterisering av ATPase-aktivitetene til helikaser 25,26,27, eller studiet av CD73-enzymatisk aktivitet, som medierer nedbrytningen av AMP til adenosin og uorganisk fosfat 28. I tillegg, når det er koblet, har det blitt brukt i oppdagelsen av antibiotika rettet mot UDP-2,3-diacylglukosamin pyrofosfatase LpxH, et essensielt enzym i de fleste gramnegative patogener29. Når det gjelder kreftforskning, har den enzymkoblede tilnærmingen blitt omfattende brukt mot NUDIX-hydrolaser, en familie av nukleotidmetaboliserende enzymer, både i karakterisering av substrater 30,31,32 og i identifisering og utvikling av legemidler og kjemiske prober 33,34,35,36.
Når det gjelder dNTPase SAMHD1, har denne tilnærmingen blitt brukt i flere rapporter. Ved bruk av eksopolyfosfatase Ppx1 fra Saccharomyces cerevisia e som koblingsenzymble denne analysen brukt til å teste flere nukleotidanaloger som enten substrater, aktivatorer eller hemmere av SAMHD1, og resulterte i identifisering av trifosfatmetabolitten til det antileukemiske legemidlet klofarabin som aktivator og substrat6. I tillegg, med uorganisk pyrofosfatase fra Escherichia coli som koblingsenzym, har det blitt brukt i screening av et bibliotek av klinisk godkjente forbindelser mot SAMHD1 for å identifisere hemmere20. I vår forskning benyttet vi denne tilnærmingen for å vise at ara-CTP, den aktive metabolitten av ara-C, er et SAMHD1-substrat, men ikke allosterisk aktivator7 og brukte deretter denne analysen for å vise at flere små molekyler som kunne sensibilisere AML-modeller til ara-C på en SAMHD1-avhengig måte, faktisk ikke direkte hemmet SAMHD118. I denne rapporten vil vi detaljere denne allsidige metoden og demonstrere dens anvendelighet, i et fullt gjennomstrømningsoppsett, for identifisering av hemmere, aktivatorer og substrater av SAMHD1.
Protocol
En skjematisk oversikt over metodene nedenfor er vist i figur 1 , og en detaljert liste over materialer og reagenser er tilgjengelig i materialfortegnelsen.
1. Forberedelse av analysebuffere.
- Forberedelse av lagerbuffere.
MERK: Siden analysen er følsom for påvisning av fosfater, som kan være vanlig, skyll glassvarer tre ganger med ultrarent eller dobbeltdestillert vann for å unngå forurensning. Alle buffere kan lagres ved romtemperatur (RT).- Klargjør 1 l SAMHD1 reaksjonsbuffer (RB) stamløsning (25 mM Tris-Acetat pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2) ved å oppløse 4,5 g Trisacetat, 2,3 g NaCl og 0,2 g MgCl2, i ca. 800 ml vann før justering til pH 8 og endelig volum.
- Klargjør 5 ml 0,1 M TCEP stamoppløsning ved å fortynne 1 ml 0,5 M TCEP til 4 ml vann.
- Klargjør 50 ml 11 % mellom-20 stamløsning ved å fortynne 5 ml 100 % mellom 20 ml i 44,5 ml vann.
MERK: Tween-20 er lysfølsom. - Klargjør 50 ml 0,5 M EDTA-stoppoppløsning ved å løse opp 9,3 g EDTA i ca. 40 ml vann før justering til pH 8 og endelig volum.
- Forbered Malachite Green (MG) stamløsning (3,2 mM malakittgrønn i H2SO4) ved sakte å tilsette 60 ml konsentrert svovelsyre til 300 ml vann i en brun glassflaske. Avkjøl løsningen til RT og oppløs 0,44 g malakittgrønn.
FORSIKTIGHET: Reaksjonen av svovelsyre med vann er eksoterm og så flasken kan varme opp forårsaker en oppbygging av trykk; Sørg for at dette trykket frigjøres ofte.
MERK: Den resulterende oransje løsningen er lysfølsom (derav brun flaske) og stabil i minst 1 år ved RT. Bunnfall kan dannes over tid, sørg for at bare supernatanten brukes. - Klargjør 50 ml 7% ammoniummolybdatstamløsning ved å løse opp 3,75 g ammoniummolybdat i 50 ml vann.
MERK: Bunnfall kan dannes over tid, sørg for at bare supernatanten brukes.
- Klargjøring av komplette analysebuffere
MERK: Dette bør gjøres på dagen for eksperimentet- Forbered komplett SAMHD1 RB (25 mM Tris-Acetate pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,3 mM TCEP, 0,005% Tween-20). Bruk tidligere tilberedte 11 % Tween-20 og 0,1 M TCEP-lagre for å legge til disse komponentene i en endelig konsentrasjon på 0,005 % for Tween-20 og 0,3 mM for TCEP til SAMHD1 RB-aksjen.
- Forbered EDTA-stoppløsning (25 mM Tris-Acetate pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,3 mM TCEP, 0,005% Tween-20, 7,9 mM EDTA). For å fullføre SAMHD1 RB, bruk 0,5 M EDTA-stamløsning for å tilsette EDTA til en endelig konsentrasjon på 7,9 mM.
- Forbered MG arbeidsløsning (2,5 mM malakittgrønn, 1,4% ammoniummolybdat, 0,18% Tween-20) ved å blande 10 deler MG stamløsning med 2,5 deler 7% ammoniummolybdat og 0,2 deler 11% Tween-20.
2. SAMHD1-hemmingsanalyse og bestemmelse av forbindelse IC50
MERK: Endelige analysebetingelser er vist i tabell 1.
- Fremstilling av forbindelser i analyseplate
MERK: Forbindelser med liten molekylvekt oppløses vanligvis i 100% DMSO og nukleotidanaloger i vann. Stamkonsentrasjonen varierer fra 10 til 100 mM og påvirkes av styrken og løseligheten av forbindelsene, sammen med DMSO-toleransen til analysen. Kontroller at den endelige DMSO-konsentrasjonen i reaksjonen ikke overstiger 1 % for å sikre at enzymaktiviteten ikke påvirkes av dette løsningsmidlet. Det er god praksis å teste toleransen til analysen til løsningsmidlet før forsøket.- Forbered serielt fortynnede testforbindelser ved 100x endelig konsentrasjon i det relevante løsningsmidlet (f.eks. 100% DMSO for små molekyler eller vann for nukleotidanaloger) i en klar rundbunnet polypropylen 96-brønnplate ved bruk av enten en flerkanals pipette eller automatisert væskehåndteringsutstyr.
MERK: Avhengig av sammensatt stabilitet kan fortynningsplater tilberedes på forhånd, forsegles og oppbevares ved -20 °C. La platene balansere til RT før du fortsetter protokollen. - Bruk fullstendig SAMHD1 RB, fortynn forbindelser til 25x endelig konsentrasjon (for å opprettholde den endelige løsningsmiddelkonsentrasjonen under 1%) og overfør 5 μL til passende brønner i en klar 384-brønns flatbunnet analyseplate. Gjenta prosedyren med kontrollprøver med kun løsemiddel.
- Forbered serielt fortynnede testforbindelser ved 100x endelig konsentrasjon i det relevante løsningsmidlet (f.eks. 100% DMSO for små molekyler eller vann for nukleotidanaloger) i en klar rundbunnet polypropylen 96-brønnplate ved bruk av enten en flerkanals pipette eller automatisert væskehåndteringsutstyr.
- Fremstilling av reaksjonskomponenter
MERK: Dette bør gjøres på analysedagen. Rekombinante humane SAMHD1- og E. coli-pyrofosfatase (PPase)-alikoter lagres langtids ved -80 °C fortynnet ved henholdsvis 9,1 mg/ml og 23,0 mg/ml i lagringsbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10 % glyserol, 2 mM TCEP). Etter opptining lagres alikotene kortvarig ved -20 °C.- Klargjør enzym (SAMHD1 / PPase) masterblanding ved å fortynne rekombinant humant SAMHD1-protein og rekombinant PPase i komplett SAMHD1 RB til 4x ønsket sluttkonsentrasjon, og dermed 1,4 μM SAMHD1 og 50 U / ml PPase.
- Forbered aktivator/substrat dGTP ved å fortynne dGTP-lager (vanligvis 10 eller 100 mM i vann) i fullstendig SAMHD1 RB til 2x endelig konsentrasjon, og dermed 50 μM dGTP.
- Utfør analysen
MERK: Alle analysekomponenter skal likevektes til RT. Væsketilsetninger kan utføres med enten en flerkanals pipette eller en væskedispenser for bulkreagens.- Til 384-brønns analyseplate som inneholder sammensatte fortynninger og bare oppløsningsmiddelkontroller, dispenser 5 mikrol SAMHD1 / PPase-masterblanding. Til ingen enzymkontrollbrønner, dispenser 5 μL komplett SAMHD1 RB. Pre-inkubere enzym og forbindelser i 10 min ved RT.
- Til alle brønner, dispenser 10 μL 2x dGTP-løsning for å starte reaksjonen.
- Inkuber reaksjonen i 20 min ved RT.
- Stopp reaksjonen ved å dispensere 20 μL EDTA stoppoppløsning til alle brønner.
MERK: Eksperimentet kan settes på pause her om ønskelig. - Tilsett 10 μL MG arbeidsløsning til alle brønner.
FORSIKTIGHET: MG arbeidsløsning inneholder svovelsyre. - Sørg for blanding av brønninnhold ved hjelp av en orbital mikrobrønnplaterister og sentrifugering ved 1000 x g i 1 min.
- Inkuber platen i 20 min ved RT.
- Les av absorpsjonen ved 630 nm bølgelengde i en mikrobrønnplateleser.
- Datavisualisering og analyse
- Beregn gjennomsnitt og standardavvik for de positive og negative kontrollbrønnene (positiv, fullstendig reaksjon med løsningsmiddel; negativ, dGTP alene med løsningsmiddel). Beregn Z-faktor37 som indikator på analysekvalitet.
- Normaliser hver absorbansverdi til middelverdiene for de positive og negative kontrollene, og sett den positive kontrollen som 100% SAMHD1-aktivitet og den negative kontrollen som 0% SAMHD1-aktivitet.
- Plott SAMHD1-aktivitet (%) som en funksjon av forbindelseskonsentrasjon og passer til en fire-parameter variabel skråningsdose-responskurve, som tillater bestemmelse av forbindelse IC50.
3. SAMHD1 aktivator og underlagsskjerm
MERK: Endelige analysebetingelser er vist i tabell 2. Rekombinante SAMHD1- og PPase-alikoter lagres langtids ved -80 °C fortynnet ved henholdsvis 9,1 mg/ml og 23,0 mg/ml i lagringsbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10 % glyserol, 2 mM TCEP) ved -80 °C. Etter opptining lagres alikotene kortvarig ved -20 °C.
- Fremstilling av nukleotidanaloger i analyseplate
- Fortynn nukleotidanaloge stambestander (typisk 10 eller 100 mM i vann) til 4x endelig konsentrasjon i komplett SAMHD1 RB, i vårt tilfelle 800 μM nukleotidanalog, og overfør 5 μL til passende brønner på en 384-brønns analyseplate.
- Fremstilling av reaksjonskomponenter
MERK: Dette bør gjøres på dagen for analysen- Forbered enzym (SAMHD1 / PPase) masterblanding ved å fortynne rekombinant humant SAMHD1-protein og rekombinant E. coli PPase i fullstendig SAMHD1 RB til 2x ønsket sluttkonsentrasjon, og dermed 0,7 μM SAMHD1 og 25 U / ml PPase.
- Tilbered PPase aleneoppløsning ved å fortynne rekombinant E. coli PPase i komplett SAMHD1 RB til 2x ønsket sluttkonsentrasjon, og dermed 25 U / ml PPase.
- Forbered aktivatorene GTP (AS1) og dGTPαS (AS1 og AS2) fortynningsmasse (vanligvis 10 eller 100 mM i vann) i komplett SAMHD1 RB til 4x endelig konsentrasjon, dermed 50 μM GTP eller dGTPαS.
- Utfør analysen
MERK: Alle analysekomponenter skal likevektes til RT. Væsketilsetninger kan utføres med enten en flerkanals pipette eller en væskedispenser for bulkreagens.- Til 384-brønnanalyseplate som inneholder nukleotidanaloger, dispenser 5 μL av aktivatoren (enten GTP eller dGTPαS) eller fullfør SAMHD1 RB til de aktuelle brønnene.
- Start reaksjonen ved å dispensere 10 μL SAMHD1/PPase-masterblanding, PPase alene, eller fullfør SAMHD1 RB til passende brønner.
- Inkuber reaksjonen i 20 min ved RT.
- Stopp reaksjonen ved å dispensere 20 μL EDTA stoppoppløsning til alle brønnene.
MERK: Eksperimentet kan settes på pause her om ønskelig. - Tilsett 10 μL MG arbeidsløsning til alle brønnene.
FORSIKTIGHET: MG arbeidsløsning inneholder svovelsyre. - Sørg for blanding av brønninnhold ved hjelp av en orbital mikrobrønnplaterister og sentrifugering ved 1000 x g i 1 min.
- Inkuber platen i 20 min ved RT.
- Les av absorpsjonen ved 630 nm bølgelengde i en mikrobrønnplateleser.
- Datavisualisering og analyse
- Beregn gjennomsnittlige absorbansverdier for PPase-reaksjonsbrønnene (negativ kontroll eller bakgrunnssignal).
MERK: Som en positiv kontroll av en SAMHD1 allosterisk aktivator og substrat, kan dGTP inkluderes i platen. I dette tilfellet kan du bruke denne betingelsen til å beregne Z-faktor som en indikator på analysekvalitet. - Trekk bakgrunnsverdien fra de tilsvarende brønnene i SAMHD1/PPase-reaksjonene.
- Plot korrigerte absorbansverdier for hver nukleotidanalog med buffer-, GTP- og dGTPαS-betingelser.
- Beregn gjennomsnittlige absorbansverdier for PPase-reaksjonsbrønnene (negativ kontroll eller bakgrunnssignal).
Representative Results
Protokollen som er skissert i figur 1 beskriver den grunnleggende arbeidsflyten for å utnytte den enzymkoblede malakittgrønne analysen for å undersøke samspillet mellom små molekyler med dNTPase SAMHD1 og kan tilpasses på en rekke måter for å forhøre forskjellige biokjemiske spørsmål. I de representative resultatene som er diskutert i avsnittene nedenfor, illustrerer vi eksempler på bruk av denne analysen for å bestemme de hemmende egenskapene til små molekyler mot SAMHD1 og for å teste om forskjellige nukleotidanaloger er substrater og / eller aktivatorer av dette enzymet.
Resultatene vist i figur 2 illustrerer flere kjerneprinsipper for denne analysen. Malakittgrøntreagenset tillater kolorimetrisk deteksjon av uorganisk fosfat gjennom dannelsen av et fosfolybdatmalakittgrønt kompleks, og følgelig kan denne tilnærmingen brukes til studiet av enzymatiske reaksjoner hvis produkt er fosfat. For å demonstrere følsomheten til denne metoden for å oppdage fritt uorganisk fosfat, viser figur 2A absorbansverdiene oppnådd med økende konsentrasjoner av Na3PO4 etter en 20 minutters inkubasjon med malakittgrønt reagens. Mens signalet når metning ved 0,25 mM Na3PO4, er det lineære deteksjonsområdet for fosfat synlig fra 0,004 til 0,03 mM (figur 2A, høyre panel), i samsvar med andre studier som rapporterte et fosfat lineært område opp til 10-20 μM ved bruk av malakittgrønn analyse38.
SAMHD1 er en dNTPase som frigjør uorganisk trifosfat ved hydrolysering av et dNTP-molekyl, og for å generere fritt uorganisk fosfat for påvisning av malakittgrønt, er det nødvendig med et koblingsenzym. Uorganisk pyrofosfatase (PPase) fra E. coli har vist seg nyttig for dette formålet, både med hensyn til SAMHD1 7,20, men også andre nukleotidmetaboliserende enzymer 30,33,35. I tillegg er SAMHD1 en aktiv dNTPase når den er homotetramer, og dette krever allosterisk aktivering av (d) NTP, spesielt et guanintrifosfat (GTP eller dGTP) ved AS1 og eventuell dNTP ved AS2. Deretter blir det katalytiske stedet tilgjengelig for substratbinding og den enzymatiske reaksjonen finner sted. Siden dGTP oppfyller kravene til binding til AS1 og AS2, og er et substrat, forenkler bruk av dette nukleotidet i inhiberingsanalysen arbeidsflyten sterkt. Figur 2B illustrerer behovet for de ulike analysekomponentene for å oppnå målbar SAMHD1-aktivitet indikert ved en økning i absorbans ved 630 nm. Verken SAMHD1 eller PPase alene er i stand til å generere uorganisk fosfat i nærvær av dGTP, i samsvar med de dokumenterte aktivitetene til disse enzymene. Imidlertid, i den tilstanden der alle analysekomponentene er til stede (SAMHD1, PPase og dGTP-aktivatoren / substratet), observerer vi en økning i signalet. Z-faktoren37 i eksemplet vist her (tar ingen enzymer + dGTP som en negativ kontroll og SAMHD1 / PPase + dGTP som en positiv kontroll) var 0,74, noe som indikerer en robust analyse.
En av de potensielle anvendelsene av den enzymkoblede SAMHD1-aktivitetsanalysen er identifisering av inhibitorer gjennom høy gjennomstrømningsscreening (HTS). I denne rapporten validerer vi derfor påvisningen av SAMHD1-hemming i denne analysen ved hjelp av et mangfoldig sett med forbindelser som allerede er beskrevet i litteraturen. Seamon et al. evaluerte den doseavhengige inhiberingen av kanoniske nukleosider mot SAMHD1 ved hjelp av en lignende analyse som vist her, og fant at deoksyguanosin (dGuo) var det eneste kanoniske nukleosid som kunne hemme SAMHD1 signifikant, med en IC50-verdi på 488 μM20. En HTS av FDA-godkjente legemidler utført med den direkte b4NPP-analysen avslørte flere treff som hemmet SAMHD1-aktivitet ved mikromolære konsentrasjoner, hvorfra lomofungin var molekylet som mest potent hemmet SAMHD1 dNTPase-aktivitet in vitro, som viste en IC50 på 20,1 μM når den ble bestemt i nærvær av dGTP som et substrat21. I tillegg har de fire α,β-imido-dNTP-analogene også blitt identifisert som konkurrerende hemmere av SAMHD1 ved bruk av MDCC-PBP-sensoren og SAMHD1 koblet til Ppx-aktivitet, noe som viste at de hemmende konstantene til dNMPNPP-analogene var i det lave mikromolære / høye nanomolære området 6,22. For å demonstrere at den enzymkoblede SAMHD1-aktivitetsanalysen kan brukes til å identifisere SAMHD1-hemmere, ble dGuo, lomofungin og 2'-deoksytymidin-5'-[(α,β)-imido]trifosfat (dTMPNPP) brukt til å validere teknikken. Figur 3A illustrerer dose-responskurvene oppnådd for disse forbindelsene, og viser at økende konsentrasjoner effektivt hemmer SAMHD1-aktivitet. De gjennomsnittlige IC50-verdiene oppnådd for disse molekylene fra tre uavhengige eksperimenter (± standardavvik) var som følger: dGuo = 361,9 ± 72,8 μM, lomofungin 6,78 ± 3,9 μM og dTMPNPP = 2,10 ± 0,9 μM. Som et eksempel på et negativt resultat ble også virkningen av hydroksyurea (HU) på SAMHD1-aktivitet bestemt. HU er en inhibitor av ribonukleotidreduktase, og selv om den begrenser SAMHD1 ara-CTPase-aktivitet i forskjellige AML-modeller, ble effekten av HU på SAMHD1 vist å være indirekte og stole på forstyrrelser den allosteriske reguleringen av SAMHD118. Doseresponskurven for HU er vist i figur 3B, og ingen endringer i SAMHD1-aktivitet ble observert med økende HU-doser, noe som viser at HU ikke hemmer SAMHD1-aktivitet in vitro.
En annen bruk av enzymkoblet SAMHD1-aktivitetsanalyse er å undersøke om nukleotider og deres analoger er substrater og/eller allosteriske aktivatorer av dette enzymet, som er illustrert i figur 4. I dette eksperimentet ble kanoniske nukleotider, så vel som de aktive metabolittene av flere anti-kreft nukleosidanaloger, slik som cytarabin (ara-CTP), klofarabin (Cl-F-ara-ATP) og gemcitabin (dF-dCTP), testet som SAMHD1-substrater og aktivatorer. På grunn av den komplekse allosteriske reguleringen av SAMHD1 utføres reaksjonen i nærvær av GTP som en AS1-aktivator eller den ikke-hydrolyserbare dGTP-analogen 2'-deoksyguanosin-5'-(α-thio)-trifosfat (dGTPαS), som kan oppta AS1 og AS2. SAMHD1-aktivitet i nærvær av den testede nukleotidanalogen og GTP indikerer at nukleotidet er i stand til å binde seg til det sekundære allosteriske stedet og katalytiske stedet (dvs. AS2-aktivator og substrat), mens SAMHD1-aktivitet med nukleotidanalogen og dGTPαS indikerer at nukleotidet bare kan okkupere det katalytiske stedet (dvs. bare et substrat). Hvis nukleotidet er i stand til å binde seg til både AS1 og AS2 allosteriske steder og til katalytisk sted, vil SAMHD1 være aktiv i nærvær av nukleotidet alene, som vist i tilfelle av dGTP. Resultatene viser at alle kanoniske dNTP-er er i stand til å binde seg til AS2-stedet og til det katalytiske stedet. I tilfelle av nukleotidanaloger er klofarabintrifosfat en AS2-aktivator og et substrat, mens cytarabintrifosfat bare er i stand til å okkupere det katalytiske stedet. På den annen side ble det ikke observert aktivitet med gemcitabintrifosfat, noe som tyder på at gemcitabintrifosfat under de testede betingelsene ikke er i stand til å virke som allosterisk effektor eller substrat. Selv om dette resultatet er i samsvar med tidligere spådommer9, viste senere krystallisasjons- og kinetiske studier10 at gemcitabintrifosfat er i stand til å binde SAMHD1-katalytisk lomme, og at det faktisk er et substrat av enzymet. I sistnevnte studie10 viser imidlertid forfatterne at hydrolysehastigheten er betydelig lavere sammenlignet med andre rapporterte substrater, som cytarabintrifosfat, og forklarer dermed hvorfor vi ikke kunne observere dette med dette screeningoppsettet.
Samlet validerer disse representative resultatene bruken av enzymkoblet SAMHD1-aktivitetsanalyse som en robust teknikk for identifisering og karakterisering av SAMHD1-hemmere, allosteriske regulatorer og substrater. Imidlertid, i likhet med alle eksperimentelle tilnærminger, har denne metoden sine forbehold, og derfor bør ortogonale analyser (f.eks. Ved bruk av en annen analyseteknologi) brukes til å validere funnene ytterligere.
Figur 1: Skjematisk oversikt over protokollen beskrevet i denne artikkelen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Enzymkoblet SAMHD1-aktivitetsanalyse. (A) Na3PO4 standardkurve i malakittgrønn analyse. Na3PO4 seriell fortynning (2 ganger) ble fremstilt fra 1 mM til 0,004 mM i triplikat og inkubert med malakittgrønt reagens i 20 minutter. Rå absorbansverdier over hele spekteret av testede konsentrasjoner er vist i venstre panel og det lineære området i høyre panel. Representant for to uavhengige eksperimenter vist. (B) Validering av enzymkoblet aktivitetsanalyse. SAMHD1 (0,35 μM) og/eller PPase (12,5 U/ml) i nærvær eller fravær av aktivator/substrat dGTP (25 μM) ble inkubert i 20 minutter i den enzymkoblede aktivitetsanalysen. Firedobler fra en representant for to uavhengige eksperimenter vist med rå absorbansverdier plottet, stolper og feilfelt indikerer gjennomsnitt og SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Evaluering av forbindelser for SAMHD1-hemming i enzymkoblet aktivitetsanalyse. Doserespons av lomofungin (0,78-100 μM), 2'-deoksytymidin-5'-[(α,β)-imido]trifosfat (dTMPNPP, 0,01-100 μM) og deoksyguanosin (dGuo, 10-1,500 μM) (A) eller hydroksyurea (HU) (0,78-100 μM) (B) i enzymkoblet SAMHD1-aktivitetsanalyse med dGTP (25 μM) som aktivator/substrat. Prosentvis aktivitet i forhold til reaksjonskontroller fra individuelle replikater plottet (DMSO + SAMHD1 / PPase + dGTP = 100% aktivitet, DMSO + dGTP = 0% aktivitet) med en representant for tre eksperimenter vist. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Evaluering av nukleotidanaloger som SAMHD1 allosteriske aktivatorer og substrater i den enzymkoblede aktivitetsanalysen. Kanoniske nukleotider og utvalgte trifosfatmetabolitter av kreftmedisinene cytarabin (ara-CTP), klofarabin (Cl-F-ara-ATP) og gemcitabin (dF-dCTP) ble testet ved 200 μM i enzymkoblet SAMHD1-aktivitetsanalyse i nærvær eller fravær av GTP eller ikke-hydrolyserbar dGTP-analog dGTPαS (12,5 μM). Normaliserte absorbansverdier fra individuelle eksperimentelle replikater plottet, gjennomsnitt og SD er indikert. Representativ for to uavhengige eksperimenter vist, tilpasset fra vår tidligere studie7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Skritt | Reagent | Volum dispensert (μL) | Endelig reaksjonsvolum (μL) | Konsentrasjon utlevert | Fold fortynning i reaksjon | Endelig konsentrasjon i reaksjon |
| 1 | Inhibitor | 5 | 20 | 0,4 mM | 4 | 0,1 mM |
| 2 | SAMHD1+PPase-blanding | 5 | 1,4 μM SAMHD1, 50 U/ml PPase | 4 | 0,35 μM SAMHD1, 12,5 E/ml ppase | |
| 3 | dGTP | 10 | 50 μM | 2 | 25 μM | |
| 4 | Inkubasjon i 20 minutter | |||||
| 5 | EDTA-løsning | 20 | 40 | 7,9 mM | 2 | 3,95 mM |
| 6 | MG-reagens | 10 | 50 | 2,5 mM Malakitt grønn, 64,4 mM Ammoniummolybdate, 0,18% Tween-20 | 5 | 0,5 mM Malakittgrønn, 12,9 mM Ammoniummolybdate, 0,036% Tween-20 |
| 7 | Inkubasjon i 20 minutter | |||||
| 8 | Les @ 630 nm | |||||
Tabell 1: Sammendrag av de endelige betingelsene i den enzymkoblede analysen for inhibitorscreening.
| Skritt | Reagent | Volum dispensert (μL) | Endelig reaksjonsvolum (μL) | Konsentrasjon utlevert | Fold fortynning i reaksjon | Endelig konsentrasjon i reaksjon |
| 1 | Allosterisk regulator | 5 | 20 | 800 μM | 4 | 200 μM |
| 2 | GTP eller dGTPαS | 5 | 50 μM | 4 | 12,5 μM | |
| 3 | SAMHD1 og/eller PPase | 10 | 0,7 mikroM SAMHD1, 25 E/ml PPase | 2 | 0,35 μM SAMHD1, 12,5 E/ml PPase | |
| 4 | Inkubasjon i 20 minutter | |||||
| 5 | EDTA-løsning | 20 | 40 | 7,9 mM | 2 | 3,95 mM |
| 6 | MG-reagens | 10 | 50 | 2,5 mM Malakitt grønn, 64,4 mM Ammoniummolybdate, 0,18% Tween-20 | 5 | 0,5 mM Malakittgrønn, 12,9 mM Ammoniummolybdate, 0,036% Tween-20 |
| 7 | Inkubasjon i 20 minutter | |||||
| 8 | Les @ 630 nm | |||||
Tabell 2: Sammendrag av de endelige betingelsene i enzymkoblet analyse for screening av allosteriske regulatorer
Discussion
Den enzymkoblede aktivitetsanalysen som er beskrevet her, er en høy gjennomstrømnings-akseptabel kolorimetrisk analyse som tillater indirekte måling av dNTP-hydrolyse av SAMHD1. Denne metoden utnytter evnen til uorganisk PPase fra E. coli, som når den inngår i overskudd i reaksjonsblandingen, omdanner hvert uorganisk trifosfat generert av SAMHD1 til tre individuelle frie fosfater som kan kvantifiseres ved hjelp av det enkle og økonomiske malakittgrønne reagenset. Vi tilbyr denne analysen i et 384 microwell plateformat, som er ideelt for screening av sammensatte biblioteker, og demonstrerer anvendeligheten og allsidigheten til denne teknikken ved identifisering og karakterisering av SAMHD1-hemmere, aktivatorer og substrater.
Som med alle in vitro biokjemiske screeninganalyser, er det en rekke kritiske trinn og viktige hensyn, og mange av disse er diskutert grundig i den fritt tilgjengelige Assay Guidance Manual39. Integriteten til de rensede rekombinante enzymene, både SAMHD1 og det koblede enzymet uorganisk PPase, er ekstremt viktig, og bør bekreftes før analysen etableres. Og følgelig bør hver ny rensing av disse enzymene være gjenstand for et visst nivå av batchtesting, da batch-til-batch-variasjoner kan introdusere inkonsekvenser i resultatene. Ideelt sett bør bruk av en ortogonal direkte analyse, slik som HPLC, som tillater deteksjon av både substratet og reaksjonsproduktet, brukes til å verifisere dNTP-trifosfohydrolaseaktiviteten til den rensede rekombinante SAMHD1 som brukes.
Når det gjelder begrensninger i denne analysen, er prinsippet at den måler dNTPase-aktiviteten til SAMHD1 på en indirekte måte, og utnytter aktiviteten til uorganisk PPase, som har en rekke implikasjoner. Det er viktig å bekrefte at PPase har liten eller ingen aktivitet mot nukleotider som brukes i analysen, og på samme måte at hemmende små molekyler identifisert ikke har noen aktivitet mot PPase. Således, med hensyn til screening, kan en motskjerm mot PPase være et viktig hensyn. Tilstedeværelsen av PPase i reaksjonen gjør det også kritisk å bruke en ortogonal analyse for å bekrefte funn. Når det gjelder direkte aktivitetsanalyser, har en rekke av dem blitt rapportert til dags dato, inkludert TLC 9,20,23 og HPLC 9,21, som nøyaktig oppdager substratutmattelse og produktdannelse. I tillegg kan b4NPP-analysen21, som også er høy gjennomstrømning, brukes til å teste potensielle hemmere; Det er imidlertid ikke ideelt å teste substrater eller allosteriske aktivatorer. Biofysiske analyser, som differensiell skanningsfluorimetri (DSF), som vi tidligere har rapportert med SAMHD118, kan også være spesielt kraftige for å identifisere og karakterisere ligander. En annen begrensning av analysen, spesielt som vist i oppsettet her for å identifisere substrater og aktivatorer, er bruken av den ikke-hydrolyserbare dGTP analoge dGTPαS som en AS1- og AS2-aktivator. Selv om dette tillater aktivering av SAMHD1 uten observerbar aktivitet i analysen, er dGTPαS en konkurransedyktig hemmer av SAMHD1, og dermed vil bruk av høye konsentrasjoner inaktivere enzymet. Etter hvert som vår forståelse av SAMHD1 utvikler seg, kan fremtidige studier bruke molekyler som utelukkende opptar hvert sted av SAMHD1, og dermed dette potensielle problemet.
Som vi har vist her, er denne metoden allsidig og kan brukes til å løse en rekke biokjemiske spørsmål. Vi har beskrevet to variasjoner av denne analysen, en for identifisering av allosteriske regulatorer og substrater av SAMHD1, og en annen for karakterisering av inhibitorer, men ytterligere tilpasninger kan gjøres. Med hensyn til potensielle inhibitorer, gjør denne analysen, som er mikrobrønnplatebasert, den godt egnet for nedstrøms virkningsmekanismestudier39,40. På samme måte, for ytterligere karakterisering av substrater og allosteriske regulatorer, kan denne teknikken brukes til å bestemme kinetiske parametere for katalyse, slik vi utførte for den aktive metabolitten av cytarabin og klofarabin7. En ulempe er imidlertid at den enzymkoblede analysen rapportert her er en endepunktsanalyse, og selv om den er godt egnet for screening, vil en kontinuerlig analyse være bedre egnet for noen mekanistiske studier. Arnold et al. rapporterte en kontinuerlig enzymkoblet analyse som benytter biosensoren MDCC-PBP6, som er avhengig av bruk av det periplasmatiske fosfatbindende proteinet (PBP) merket med kumarinmaleimid (MDCC) fluorofor som kan binde seg til en fri fosfatgruppe. MDCC-PBP er svært følsom og muliggjør kvantifisering av svært lave fosfatkonsentrasjoner, med sensorens responstid i millisekund til andre tidsskala.
SAMHD1 spiller en rekke viktige funksjoner i menneskers helse og sykdom2 , hvorav mange kan knyttes til sin sentrale rolle i opprettholdelsen av intracellulære dNTP-nivåer1. Dermed vil identifisering av en kjemisk sonde av høy kvalitet mot dNTPase-aktiviteten til SAMHD1 være et kraftig verktøy for å definere disse koblingene, og den enzymkoblede analysen som er rapportert her, kan lett brukes til å identifisere slike prober. Videre, som nukleosidbaserte legemidler, hvorav mange er modulert av SAMHD1, er en mangfoldig og viktig gruppe terapeutisk41; kjemiske sonder kan videreutvikles til legemidler for å målrette SAMHD1 i den kliniske settingen, med sikte på å øke effekten av disse terapiene. Det er også viktig å forstå det fulle omfanget av samspillet mellom disse nukleosidbaserte forbindelsene og SAMHD1, et spørsmål som også kan tas opp ved hjelp av denne enzymkoblede analysen. Samlet sett er den enzymkoblede SAMHD1-aktivitetsanalysen som rapportert her, en billig, allsidig, høy gjennomstrømningsanalyse som kan brukes til å fremme vår forståelse av dette viktige enzymet.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Thomas Lundbäck og medlemmer av Thomas Helledays laboratorium for råd og støtte. En del av dette arbeidet ble tilrettelagt av Protein Science Facility ved Karolinska Institutet / SciLifeLab (http://ki.se/psf), og vi anerkjenner National Cancer Institute (NCI), Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD) og Developmental Therapeutics Program (DTP) (http://dtp.cancer.gov) for å gi en forbindelse. Finansieringen ble gitt av tilskudd tildelt SGR fra Vetenskapsrådet (2018-02114), Kreftforeningen (19-0056-JIA, 20-0879-PJ), Barncancerfondet (PR2019-0014) og Karolinska Institutet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate (dATP) | Jena bioscience | NU-1001 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| 2'-deoxycytidine-5'-triphosphate (dCTP) | Jena bioscience | NU-1002 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| 2'-Deoxyguanosine-5'-(α-thio)-triphosphate (dGTPαS) | Jena bioscience | NU-424 | Non-hydrolyzable dGTP analogue for SAMHD1 activator/substrate assay |
| 2'-deoxyguanosine-5'-triphosphate (dGTP) | GE Healthcare | 27-1870-04 | SAMHD1 allosteric activator and substrate used in inhibition assay and activator/substrate assay |
| 2'-Deoxythymidine-5'-[(α,β)-imido]triphosphate (dTMPNPP) | Jena bioscience | NU-907-1 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
| 2'-deoxythymidine-5'-triphosphate (dTTP) | Jena bioscience | NU-1004 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| 2'Deoxyguanosine mohohydrate (dGuo) | Sigma-Aldrich | D0901 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
| 384 well clear flat-bottom microplate | Thermo Fisher Scientific | 262160 | Assay plate |
| 96 well clear U-bottom polypropylene microplate | Thermo Fisher Scientific | 267245 | Compound dilution plate |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A1343 | Reagent required for malachite green working reagent |
| ara-Cytidine-5'-triphosphate (ara-CTP) | Jena bioscience | NU-1170 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| Clofarabine-5'-triphosphate (Cl-F-ara-ATP) | Jena bioscience | NU-874 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | VWR | 23486.297 | Solvent |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | EDTA stop solution component |
| Gemcitabine-5'-triphosphate (dF-dCTP) | Jena bioscience | NU-1607 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Data analysis and visualisation |
| Guanosine 5′-triphosphate (GTP) sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | Allosteric activator for SAMHD1 activator/substrate assay |
| His-tagged E. coli inorganic pyrophosphatase (PPase) | Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet | - | Recombinant PPase protein, hydrolises inorganic triphosphate and pyrophosphate to orthophosphate so it can form complex with malachite green |
| His-tagged human SAMHD1 | Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet | - | Recombinant SAMHD1 protein, hydrolizes dNTPs into its corresponding nucleoside and inorganic triphosphate |
| Hydroxyurea | Sigma-Aldrich | H8627 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
| Lomofungin | National Cancer Institute (NCI)/Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD)/Developmental Therapeutics Program (DTP) | NSC106995 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
| Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Malachite green Carbinol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 213020 | Malachite green stock component |
| Microplate Reader | Hidex | Hidex Sense Microplate reader | Data acquisition, absorption read at 630 nm wavelength |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 567530 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Sodium phosphate (Na3PO4) | Sigma-Aldrich | 342483 | Required for phosphate standard curve |
| Sulphuric acid 95-97% | Sigma-Aldrich | 84720 | Malachite green stock component |
| Tris-Acetate salt | Sigma-Aldrich | T1258 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | SAMHD1 reaction buffer and malachite green working reagent component |
References
- Franzolin, E., et al. The deoxynucleotide triphosphohydrolase SAMHD1 is a major regulator of DNA precursor pools in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14272-14277 (2013).
- Coggins, S. A., Mahboubi, B., Schinazi, R. F., Kim, B. SAMHD1 functions and human diseases. Viruses. 12 (4), 382 (2020).
- Goldstone, D. C., et al. HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase. Nature. 480 (7377), 379-382 (2011).
- Powell, R. D., Holland, P. J., Hollis, T., Perrino, F. W. Aicardi-Goutieres syndrome gene and HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a dGTP-regulated deoxynucleotide triphosphohydrolase. The Journal of Biological Chemistry. 286 (51), 43596-43600 (2011).
- Morris, E. R., Taylor, I. A. The missing link: Allostery and catalysis in the anti-viral protein SAMHD1. Biochemical Society Transactions. 47 (4), 1013-1027 (2019).
- Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2015).
- Herold, N., et al. Targeting SAMHD1 with the Vpx protein to improve cytarabine therapy for hematological malignancies. Nature Medicine. 23 (2), 256-263 (2017).
- Schneider, C., et al. SAMHD1 is a biomarker for cytarabine response and a therapeutic target in acute myeloid leukemia. Nature Medicine. 23 (2), 250-255 (2017).
- Hollenbaugh, J. A., et al.
- Knecht, K. M., et al. The structural basis for cancer drug interactions with the catalytic and allosteric sites of SAMHD1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10022-10031 (2018).
- Oellerich, T., et al. Selective inactivation of hypomethylating agents by SAMHD1 provides a rationale for therapeutic stratification in AML. Nature Communications. 10 (1), 3475 (2019).
- Herold, N., et al. SAMHD1 protects cancer cells from various nucleoside-based antimetabolites. Cell Cycle. 16 (11), 1029-1038 (2017).
- Rothenburger, T., et al. SAMHD1 is a key regulator of the lineage-specific response of acute lymphoblastic leukaemias to nelarabine. Communications Biology. 3 (1), 324 (2020).
- Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside- analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824 (2017).
- Castellví, M., et al. Pharmacological modulation of SAMHD1 activity by CDK4/6 inhibitors improves anticancer therapy. Cancers. 12 (3), 713-719 (2020).
- Rassidakis, G. Z., et al. Low-level expression of SAMHD1 in acute myeloid leukemia (AML) blasts correlates with improved outcome upon consolidation chemotherapy with high-dose cytarabine-based regimens. Blood Cancer Journal. 8 (11), 98 (2018).
- Rudd, S. G., Schaller, T., Herold, N. SAMHD1 is a barrier to antimetabolite-based cancer therapies. Molecular & Cellular Oncology. 4 (2), 1287554 (2017).
- Rudd, S. G., et al. Ribonucleotide reductase inhibitors suppress SAMHD1 ara-CTPase activity enhancing cytarabine efficacy. EMBO Molecular Medicine. 41, 10419 (2020).
- Seamon, K. J., et al. Small molecule inhibition of SAMHD1 dNTPase by tetramer destabilization. Journal of the American Chemical Society. 136 (28), 9822-9825 (2014).
- Seamon, K. J., Stivers, J. T. A high-throughput enzyme-coupled assay for SAMHD1 dNTPase. Journal of Biomolecular Screening. 20 (6), 801-809 (2015).
- Mauney, C. H., Perrino, F. W., Hollis, T. Identification of inhibitors of the dNTP triphosphohydrolase SAMHD1 using a novel and direct high-throughput assay. Biochemistry. 57 (47), 6624-6636 (2018).
- Morris, E. R., et al. Crystal structures of SAMHD1 inhibitor complexes reveal the mechanism of water-mediated dNTP hydrolysis. Nature Communications. 11 (1), 3165 (2020).
- Hansen, E. C., Seamon, K. J., Cravens, S. L., Stivers, J. T. GTP activator and dNTP substrates of HIV-1 restriction factor SAMHD1 generate a long-lived activated state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (18), 1843-1851 (2014).
- Baykov, A. A., Evtushenko, O. A., Avaeva, S. M. A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Analytical Biochemistry. 171 (2), 266-270 (1988).
- Hyun, M., Bohr, V. A., Ahn, B. Biochemical characterization of the WRN-1 RecQ helicase of Caenorhabditis elegans. Biochemistry. 47 (28), 7583-7593 (2008).
- Lin, H. -H., Huang, C. -Y. Characterization of flavonol inhibition of DnaB helicase: real-time monitoring, structural modeling, and proposed mechanism. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012 (4), 735368 (2012).
- Yang, M., Wang, G. ATPase activity measurement of DNA replicative helicase from Bacillus stearothermophilus by malachite green method. Analytical Biochemistry. 509, 46-49 (2016).
- Allard, B., Cousineau, I., Spring, K., Stagg, J. Measurement of CD73 enzymatic activity using luminescence-based and colorimetric assays. Methods in Enzymology. 629, 269-289 (2019).
- Lee, M., et al. Structure-activity relationship of sulfonyl piperazine LpxH inhibitors analyzed by an LpxE-coupled malachite green assay. ACS Infectious Diseases. 5 (4), 641-651 (2019).
- Carreras-Puigvert, J., et al. A comprehensive structural, biochemical and biological profiling of the human NUDIX hydrolase family. Nature Communications. 8 (1), 1541 (2017).
- Valerie, N. C. K., et al. NUDT15 hydrolyzes 6-thio-deoxyGTP to mediate the anticancer efficacy of 6-thioguanine. Cancer Research. 76 (18), 5501-5511 (2016).
- Carter, M., et al. Human NUDT22 Is a UDP-glucose/galactose hydrolase exhibiting a unique structural fold. Structure. 26 (2), 295-303 (2018).
- Gad, H., et al. MTH1 inhibition eradicates cancer by preventing sanitation of the dNTP pool. Nature. 508 (7495), 215-221 (2014).
- Page, B. D. G., et al. Targeted NUDT5 inhibitors block hormone signaling in breast cancer cells. Nature Communications. 9 (1), 250 (2018).
- Zhang, S. M., et al. Development of a chemical probe against NUDT15. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1120-1128 (2020).
- Michel, M., et al. In silico druggability assessment of the NUDIX hydrolase protein family as a workflow for target prioritization. Frontiers in Chemistry. 8, 443 (2020).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67 (1999).
- Baykov, A. A., Evtushenko, O. A., Avaeva, S. M. A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Analytical Biochemistry. 171 (2), 266-270 (1988).
- Markossian, S., et al.
- Holdgate, G. A., Meek, T. D., Grimley, R. L. Mechanistic enzymology in drug discovery: a fresh perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (2), 115-132 (2018).
- Tsesmetzis, N., Paulin, C. B. J., Rudd, S. G., Herold, N. Nucleobase and nucleoside analogues: resistance and re-sensitisation at the level of pharmacokinetics, pharmacodynamics and metabolism. Cancers. 10 (7), 240 (2018).
