Este protocolo describe los pasos para la creación de un modelo de conejo con dos aneurismas digeridos por elastasa con diferente hemodinámica (muñón y constelación de bifurcación). Esto permite probar nuevos dispositivos endovasculares en aneurismas con diferentes condiciones angioarquitectónicas y hemodinámicas dentro de un solo animal.
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Artículo de método
Creación de dos aneurismas digeridos por elastasa sacular con diferente hemodinámica en un conejo
En este artículo
Resumen
Resumen
Los modelos animales preclínicos con características hemodinámicas, morfológicas e histológicas cercanas a los aneurismas intracraneales humanos desempeñan un papel clave en la comprensión de los procesos fisiopatológicos y en el desarrollo y prueba de nuevas estrategias terapéuticas. Este estudio tiene como objetivo describir un nuevo modelo de aneurisma de conejo que permite la creación de dos aneurismas saculares digeridos por elastasa con diferentes condiciones hemodinámicas dentro del mismo animal.
Cinco conejos blancos hembras de Nueva Zelanda con un peso medio de 4,0 (± 0,3) kg y una edad media de 25 (±5) semanas se sometieron a la creación de un muñón microquirúrgico y un aneurisma de bifurcación. Un aneurisma (muñón) fue creado por la exposición a la arteria carótida común derecha (CCA) en su origen en el tronco braquiocefálico. Se aplicó un clip temporal en el origen CCA y otro, 2 cm por encima. Este segmento fue tratado con una inyección local de 100 U de elastasa durante 20 min. Se creó un segundo aneurisma (bifurcación) mediante la sutura de una bolsa arterial tratada con elastasa en la anastomosis de extremo a lado del CCA derecho al CCA izquierdo. La permeabilidad se controló mediante angiografía de fluorescencia inmediatamente después de la creación.
La duración promedio de la cirugía fue de 221 min. La creación de dos aneurismas en el mismo animal fue exitosa en todos los conejos sin complicaciones. Todos los aneurismas fueron patentes inmediatamente después de la cirugía, excepto un aneurisma de bifurcación, que mostró una reacción tisular extrema debido a la incubación de elastasa y una trombosis intraluminal inmediata. No se observó mortalidad durante la cirugía y hasta un mes de seguimiento. La morbilidad se limitó a un síndrome vestibular transitorio (un conejo), que se recuperó espontáneamente en un día.
Aquí se demuestra por primera vez la viabilidad de crear un modelo de conejo de dos aneurismas con características hemodinámicas de muñón y bifurcación y condiciones de pared altamente degeneradas. Este modelo permite el estudio del curso natural y las posibles estrategias de tratamiento sobre la base de la biología del aneurisma en diferentes condiciones de flujo.
Introducción
El aneurisma intracraneal es una afección grave con una tasa de mortalidad después de la rotura que alcanza el 50% y discapacidad a largo plazo en el 10-20% de los pacientes1. La última década ha visto un rápido desarrollo de las opciones de tratamiento endovascular pero, al mismo tiempo, también una tasa creciente de recurrencia con hasta un 33% de recanalización del aneurisma después de enrollar 2,3. Para comprender mejor la fisiopatología subyacente a la oclusión y recanalización del aneurisma, así como para el desarrollo y prueba de nuevos dispositivos endovasculares, actualmente existe la necesidad de modelos preclínicos confiables cuyas características hemodinámicas, morfológicas e histológicas imiten las de los aneurismas intracraneales humanos 4,5,6 . A partir de hoy, no existe un modelo definido como estándar para el ensayo preclínico, y una amplia gama de especies y técnicas están disponibles para los investigadores 7,8.
Sin embargo, el conejo es una especie de particular interés debido al tamaño y las similitudes hemodinámicas entre sus arterias del cuello y los vasos cerebrales humanos, así como sus perfiles similares de coagulación y trombólisis. Varios modelos con aneurismas saculares digeridos por elastasa en las arterias carótidas comunes (CCA) han mostrado similitudes cualitativas y cuantitativas con los aneurismas intracraneales humanos en términos de condiciones de flujo, características geométricas y características de la pared 9,10,11,12. Este estudio tiene como objetivo describir una técnica para crear un nuevo modelo de aneurisma de conejo con aneurismas digeridos por elastasa de muñón y bifurcación en el mismo animal. Las técnicas quirúrgicas están inspiradas en las de Hoh et al.13 y Wanderer et al.14 con ligeras modificaciones para proporcionar una buena estandarización y reproducibilidad y asegurar una baja mortalidad y morbilidad.
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Protocolo
NOTA: El experimento fue aprobado por el Comité Local para el Cuidado de los Animales del Cantón de Berna, Suiza (Número de solicitud BE108/16), y todos los cuidados y procedimientos de los animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales y los principios 3R15,16. Los datos se informan de acuerdo con las directrices ARRIVE. El manejo perioperatorio fue realizado por un anestesiólogo veterinario certificado por la junta. Para el estudio, las hembras de conejos blancos de Nueva Zelanda, con un peso medio de 4,0 (± 0,3) kg y una edad media de 25 (±5) semanas, se alojaron a una temperatura ambiente de 22-24 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso gratuito a agua, pellets y heno.
1. Fase prequirúrgica y anestesia
- Realizar un examen clínico según lo recomendado por la Asociación de Anestesistas veterinarios y el Colegio Europeo y Americano de Anestesia Veterinaria y analgesia para confirmar que los conejos están sanos pesando cada animal, evaluando la membrana mucosa, documentando el tiempo de llenado capilar y la calidad del pulso, y realizando una auscultación pulmonar y cardíaca, así como una palpación abdominal.
- Con base en el hallazgo clínico, atribuir una clasificación de la Sociedad Americana de Anestesiólogos (ASA) a cada conejo17. Realizar la cirugía solo en animales con una puntuación ASA I.
- Afeite ambos oídos externos y aplique crema de prilocaína-lidocaína en las arterias y venas auriculares. Logre una sedación profunda con una combinación de ketamina 20 mg/kg, dexmedetomidina 0,1 mg/kg y metadona 0,3 mg/kg inyectada por vía subcutánea (SC). Deje a los animales tranquilos durante 15 minutos. Administre oxigenación suplementaria (3 L/min) a través de una mascarilla aflojada y monitoree con un oxímetro de pulso.
- Coloque una cánula de 22 G en la arteria central auricular izquierda, así como en una vena auricular. Inducir anestesia general con propofol 1-2 mg/kg intravenoso (IV) hasta el efecto (pérdida del reflejo de deglución). Proceder a la intubación endotraqueal mediante un tubo de silicona (3 mm de diámetro interno).
- Afeite la frente para colocar los sensores electroencefalográficos (EEG) pediátricos. Afeitar el campo quirúrgico e inyectar clorhidrato de ropivacaína al 0,75 % por vía intradérmica.
- Coloque el conejo en la mesa de operaciones en decúbito dorsal, instale un monitoreo completo y conecte el tubo endotraqueal a un sistema de círculo pediátrico de baja resistencia. Mantener la anestesia con la administración de isoflurano en oxígeno, apuntando a una concentración marea final máxima (Et) del 1,3 %.
- Proporcionar una infusión continua de lactato de timbre 5 mL/kg/h a través del acceso venoso. Asegurar el seguimiento clínico e instrumental hasta la extubación mediante oximetría de pulso, doppler y presión arterial invasiva, electrocardiograma de 3 derivaciones, EEG, temperatura rectal y gases inhalados y exhalados.
- Desinfecte el campo quirúrgico con povidona yodada desde el manubrio esterni hasta los ángulos de la mandíbula y aplique el drapeado estéril. Durante la cirugía, proporcionar analgesia con lidocaína (infusión de velocidad constante [CRI] de 50 μg/kg/min) y fentanilo (CRI de 3-10 μg/kg/h). Realizar ventilación espontánea o asistida. Permitir la hipercapnia permisiva.
- Realizar al menos un análisis de gases en sangre arterial durante la cirugía. En caso de hipotensión (presión arterial media por debajo de 60 mmHg), trátela con noradrenalina, ajustada hasta que surta efecto. Utilice una almohadilla térmica o un sistema de calentamiento de aire forzado para evitar la hipotermia (objetivo: temperatura rectal 37.5-38.5 ° C).
NOTA: Como la presión arterial invasiva se mide en la arteria del oído izquierdo, el recorte del CCA izquierdo detendrá el flujo sanguíneo y suprimirá la curva. La presión arterial debe medirse con la técnica Doppler hasta la reapertura del vaso.
2. Cirugía
- Acercarse
- Haga una incisión mediana en la piel desde el hueso hioides hasta un punto caudal de 1,5 cm hasta el manubrio esterni con un bisturí. Prepare el tejido subcutáneo y graso de la incisión medial mientras realiza una hemostasia meticulosa.
- Libere el músculo esternocéfalo del tejido conectivo adherente y aplique lidocaína tópicamente (2-4 mg / kg, prefiera lidocaína 1%) para evitar el mioclono. Exponga el CCA derecho medialmente del músculo esternocéfalo y manténgalo húmedo con hisopos húmedos.
- Ahora prepare las partes lateral y proximal del músculo esternocéfalo y retírelo medialmente con un bucle de vaso para exponer el CCA. Identifique la vena yugular externa y protéjala con un microhisopo húmedo.
- Diseccionar el tejido conectivo cuidadosamente a lo largo del CCA proximal hasta la bifurcación del tronco braquiocefálico para exponer la arteria. En presencia de pequeñas ramas provenientes de la arteria, coagularlas con el cauterizador.
NOTA: Tenga cuidado de evitar cualquier daño a los nervios.
- Creación de aneurisma de muñón y recolección de tejido para el aneurisma de bifurcación
- Antes de recortar el CCA derecho, mida el tiempo anticoagulante (ACT) y administre heparina natrial (80 EI / kg) sistémicamente a través de la vena del oído (realizada por el equipo de anestesia) para evitar eventos tromboembólicos.
- Ahora aplique 2 clips temporales: el primero en el origen del CCA y el segundo a 2 cm distal de él (Figura 1A). Coloque una almohadilla de goma debajo del recipiente y enjuague con papaverina HCL (40 mg / ml; 1: 1 disuelto en solución salina al 0.9%) para la vasodilatación.
- Retire la adventicia con cuidado usando microtijeras. Realizar una arteriotomía por debajo del clip distal con un catéter IV de 22 G e insertar el catéter caudalmente hasta el clip proximal (Figura 1A, B).
- Enjuague el segmento por vía intraluminal con NaCl heparinizado (500 U/100 ml en solución salina al 0,9%) hasta que no haya sangre visible, y finalmente fije el catéter con una ligadura (4-0). Ahora, a través del catéter, inyecte 0.1-0.2 mL de elastasa (100 UI previamente disueltas en 5 mL de Tris-Buffer) en el segmento arterial e incube durante 20 min (Figura 1B).
- Comience con la disección en el lado izquierdo para exponer el CCA izquierdo (ver sección 2.3). Después de 20 minutos de tiempo de incubación con elastasa, limpie la solución de elastasa y cambie la jeringa para enjuagar el segmento de la arteria aproximadamente 10 veces con NaCl al 0,9%.
- Aplicar 2 ligaduras (6-0): la primera 5 mm distal de clip proximal y la segunda apenas proximalmente, bajo la arteriotomía (Figura 1C). Corte el vaso ~3 mm por encima de la primera ligadura y una vez más entre la segunda ligadura y el clip distal. Mantener este injerto autólogo en una solución heparinizada (500 U/100 mL en solución salina al 0,9%) hasta la creación del aneurisma de bifurcación (Figura 1D). Finalmente, abra cuidadosamente el primer clip proximal y mida el aneurisma (longitud, anchura y profundidad).
- Creación de aneurismas por bifurcación
- Prepare el lado izquierdo diseccionando el músculo esternocéfalo medialmente para exponer ~2 cm del CCA izquierdo. Aplique lidocaína tópicamente sobre el músculo para evitar el mioclono.
- Debajo de la arteria carótida con una bola de gasa y un pequeño hisopo con un trozo de guante. Aplicar un poco de papaverina. HCl tópicamente (40 mg/ml; 1:1 disuelto en solución salina al 0,9%). Continúe trabajando bajo vista microscópica: prepare la bolsa del aneurisma y retire la adventicia. Medir la bolsa del aneurisma (longitud, anchura, profundidad).
- Enjuague la parte abierta del CCA derecho con NaCl heparinizado y, si es necesario, reemplace el clip para que tenga ~ 1 cm para permitir manipulaciones libres para la sutura. Retire la adventicia con cuidado y haga una incisión longitudinal de ~ 2 mm lateralmente en el muñón del CCA derecho.
- Ahora aplique dos clips temporales en el CCA izquierdo para delimitar un segmento de ~ 1 cm y eliminar la adventicia en el medio. Realizar una arteriotomía con una aguja de 23 G. Enjuague el segmento con NaCl heparinizado (500 U/100 ml en solución salina al 0,9%). Agrandar la arteriotomía usando microtijeras a ~4-5 mm para permitir la sutura del CCA derecho y la bolsa del aneurisma (Figura 1E). Irrigar los recipientes durante todo el procedimiento de sutura y protegerlos con micro intercambios húmedos.
- Realizar la anastomosis con sutura 9-0 no reabsorbible.
- Suturar la pared posterior proximal del romo carotídeo derecho con 5 puntos de sutura, comenzando en el borde proximal de la arteriotomía en el CCA izquierdo. Luego, suture la parte posterior de la bolsa del aneurisma con 4-5 puntos de sutura, comenzando en el borde distal de la arteriotomía en el CCA izquierdo.
- Continuar con la parte posterior distal a nivel de la incisión de la boca de pez para suturar con la parte posterior vertical del injerto de aneurisma con 3 puntos de sutura. Suture la parte frontal de la incisión de la boca del pez con 3 puntos de sutura, comenzando hacia arriba y moviéndose hacia abajo.
- Termine con la sutura frontal entre el CCA izquierdo y el lado frontal del injerto de aneurisma y el CCA derecho con ~6 puntos de sutura. Antes de terminar la anastomosis, enjuague los vasos con solución salina heparinizada al 0,9% por vía intraluminal.
- Antes de retirar la pinza, medir el tiempo anticoagulante (TCA) una vez más y administrar una dosis adaptada de heparina sistémicamente (objetivo: 2-3 veces la TCA basal).
- Retire el clip en el CCA derecho mientras ejerce algo de presión sobre la anastomosis con micro hisopos para la hemostasia. Luego, continúe retirando el clip distal del CCA izquierdo. Si no hay sangrado importante, continúe sacando el clip proximal en el CCA izquierdo, para permitir el flujo sanguíneo. Si hay algo de sangrado de la anastomosis, aplique algo de presión con la bola de gasa y el hisopo; Espere un par de minutos. Si persiste, reemplace los clips y realice nuevas suturas.
NOTA: Una pérdida de sangre de más de 20-30 ml puede poner en peligro la fase de recuperación.
- Control de permeabilidad y documentación
- Después de abrir todos los recipientes, documente los resultados fotográficamente y mídalos (Figura 1F y Figura 2A, B).
- Confirmar la restauración del flujo en el CCA distal a través de la curva invasiva de presión arterial (medida en la arteria del oído, una rama directa de la carótida externa), que también debe volver a la normalidad.
- Realice una angiografía de fluorescencia administrando 1 ml de fluoresceína IV, utilizando 2 filtros de paso de banda, una cámara de video y un foco de bicicleta. Ver publicaciones anteriores para la descripción de todo el procedimiento18,19.
- Clausura
- Readapte la almohadilla de grasa en la anastomosis y suture con una sutura reabsorbible 4-0. Finalmente sutura subcutis y piel con puntos individuales utilizando sutura reabsorbible 4-0.
3. Fase postquirúrgica
- Al final de la cirugía, suspender el isoflurano y la analgesia sistémica sin reversión para mantener el efecto analgésico. Asegúrese de que el control del reflejo de deglución ha regresado antes de realizar la extubación traqueal.
- Administrar meloxicam 0,5 mg/kg IV para asegurar analgesia, aspirina (ASS) 10 mg/kg IV para prevenir eventos trombóticos inmediatos, vitamina B12 100 μg SC y clamoxilo 20 mg/kg IV como profilaxis antibiótica.
- Proporcionar oxigenación suplementaria y calentamiento hasta que el conejo recupere espontáneamente la decúbito esternal. Realizar analgesia de rescate con metadona si se observa algún signo de dolor. Realizar seguimiento y cuidados postoperatorios 4 veces al día durante los primeros 3 días preoperatorios, de acuerdo con las directrices para la evaluación y manejo del dolor en roedores y conejos23,24.
- Asegurar analgesia postoperatoria con parche de fentanilo (12 μg/h) aplicado en el oído externo, meloxicam 1x/SC durante 3 días y metadona como terapia de rescate, junto con una hoja de puntuación para la evaluación del dolor (Archivo complementario).
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Resultados
La creación de un muñón y un aneurisma de bifurcación fue exitosa en los 5 conejos blancos de Nueva Zelanda sin complicaciones intraoperatorias. No se observó mortalidad durante la cirugía o durante el período de seguimiento de 24 ± 2 días. Un conejo experimentó complicaciones postoperatorias con un síndrome vestibular y ceguera del lado derecho. El animal se recuperó completa y espontáneamente después de 24 h. Esta complicación no interfirió con sus actividades normales (movimientos libres, ingesta de agua y alimentos, ...
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Discusión
La técnica más común para la creación de aneurismas implica la creación de un aneurisma de muñón en el origen del CCA derecho, ya sea a través de un método abierto o endovascular. El modelo ha sido validado para ser un aneurisma estable no creciente que permanece abierto con el tiempo20,21. La segunda técnica posible consiste en la creación microquirúrgica de un aneurisma de bifurcación arterial mediante la anastomosación del CCA derecho en el izquierdo y la sutu...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen al profesor Hans Rudolf Widmer, al Dr. Luca Remonda y al profesor Javier Fandino por su apoyo científico y contribución técnica a este trabajo. Un agradecimiento especial a Olgica Beslac por sus consejos durante los procedimientos y a Kay Nettelbeck por su ayuda. Además, agradecemos a Daniela Casoni DVM, PhD y med. vet. Luisana García, PD Dra. Alessandra Bergadano y Dra. Carlotta Detotto por su dedicado apoyo veterinario.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sutura reabsorbible 4-0 | Ethicon Inc., EE. UU. | VCP292ZH | |
| Sutura reabsorbible 4-0 | Ethicon Inc., EE. UU. | VCP304H | |
| 6-0 sutura no absorbible | B. Braun, Alemania | C0766070 | |
| 9-0 sutura no absorbible | B. Braun, Alemania | G1111140 | |
| Adrenaline | Amino AG | 1445419 | cualquier genérico |
| Amiodarone | Helvepharm AG | 5078567 | |
| máquina de anestesia | Drä ger | cualquier otra | |
| Aspirina | Sanofi-Aventis (Suisse) SA | 622693 | cualquier Atropina Genérica |
| Labatec Pharma SA | 6577083 | cualquier Filtro de paso de | |
| banda genérico azul | Thorlabs | FD1B | cualquier otro |
| Filtro de paso de banda verde | Thorlabs | FGV9 | cualquier otro |
| clip de vaso Biemer (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Suiza | FD560R | cualquier otro |
| Pinza | cualquier otro | ||
| Índice biespectral (neonatal) | cualquier otro | ||
| Manguito de presión arterial (neonatal) | cualquier otro | ||
| Bycilces spotlight | cualquier otro | ||
| Clamoxyl | GlaxoSmithKline AG | 758808 | cualquier genérico |
| Dexmedetomidina | Ever Pharma | 136740-1 | cualquier genérico |
| Elastase | Sigma Aldrich | E7885 | |
| Electrodos de | |||
| Ephedrine | Amino AG | 1435734 | |
| Esmolol | OrPha Swiss GmbH | 3284044 | |
| Fentanilo (uso intravenoso) | Janssen-Cilag AG | 98683 | |
| Fentanilo (transdérmico) | Mepha Pharma AG | 4008286 | |
| Fluoresceína | Curatis AG | 5030376 | |
| Fragmin | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 1906725 | |
| Almohadilla térmica o sistema | |||
| Solución isotónica de cloruro de sodio (0,9%) | Fresenius KABI | 336769 | |
| Ketamina | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 342261 | |
| retractor | de tapa Approach | ||
| Lidocaína | Streuli Pharma AG | 747466 | |
| Longuettes | |||
| Metacam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | Medicación |
| Metadona | Streuli Pharma AG | 1084546 | Sedaton |
| Micropinzas curvo | Ulrich Swiss, Suiza | U52-015-15 | |
| Micropinzas recto 2x | Ulrich Swiss, Suiza | U52-010-15 | |
| Microtijeras | Ulrich Swiss , Suiza | U52-327-15 | |
| Midazolam | Accord Healthcare AG | 7752484 | |
| Aguja 23 G | arteriotomía | ||
| Portaagujas | |||
| O2-Mascarilla | |||
| Microscopio de operación | Wild Heerbrugg | ||
| Papaverin | Bichsel | aplicación tópica | |
| Povidona yodada | Mundipharma Medical Company | cualquier genérico | |
| Prilocaína-lidocaína crème | Emla | ||
| Propofol | B. Braun Medical AG, Suiza | Anestesia general | |
| Oxímetro | |||
| Sonda de temperatura rectal (neonatal) | |||
| Ringer Lactate | Bioren Sintetica SA | Infusión | |
| Ropivacain | Aspen Pharma Schweiz GmbH | 1882249 | Anestesia local |
| Bisturí | Swann-Morton | 210 | |
| Afeitadora | |||
| Pinza | |||
| Separador | |||
| blandos Cuencos de esponja de | |||
| Microhisopos estériles Estetoscopio | |||
| Paño | quirúrgico | ||
| Tijeras quirúrgicas | |||
| Jeringas 1 mL, 2 mL y 5 mL | |||
| Tris-Buffer | Sigma Aldrich | 93302 | Solución de elastasa |
| Aplicador de clip vascular | B. Braun, Alemania | FT495T | |
| Catéter venoso y arterial | |||
| Enfoque | |||
| cámara de vídeo o smartphone | |||
| Vitarubin | Streuli Pharma AG | 6847559 | |
| Yasargil titan clip estándar (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Suiza | FT242T |
Referencias
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