Este protocolo describe la preparación de cultivos organotípicos de cortes (OTSC). Esta técnica facilita el cultivo ex vivo de tejido multicelular intacto. Las OTSC se pueden utilizar inmediatamente para probar su respectiva respuesta a los fármacos en un entorno multicelular.
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Artículo de método
Cultivos de cortes organotípicos como modelos preclínicos del microambiente tumoral en cáncer de páncreas primario y metástasis
En este artículo
Resumen
Resumen
Se necesitan urgentemente modelos preclínicos realistas de cáncer de páncreas primario y metástasis para probar la respuesta terapéutica ex vivo y facilitar el tratamiento personalizado del paciente. Sin embargo, la ausencia de microambiente específico del tumor en los modelos utilizados actualmente, por ejemplo, las líneas celulares derivadas del paciente y los xenoinjertos, solo permite obtener información predictiva limitada. Los cultivos de cortes organotípicos (OTSC) comprenden tejido multicelular intacto, que se puede utilizar rápidamente para las pruebas de respuesta a fármacos resueltas espacialmente.
Este protocolo describe la generación y el cultivo de cortes tumorales viables de cáncer de páncreas y su metástasis. Brevemente, el tejido se funde en agarosa de bajo punto de fusión y se almacena en tampón isotónico frío. A continuación, se generan cortes de tejido de 300 μm de grosor con un vibrátomo. Después de la preparación, las rodajas se cultivan en una interfaz aire-líquido utilizando insertos de cultivo celular y un medio de cultivo adecuado. Durante el cultivo, se pueden controlar los cambios en la diferenciación celular y la viabilidad. Además, esta técnica permite la aplicación del tratamiento a tejido tumoral humano viable ex vivo y análisis posteriores, como el perfil del transcriptoma y el proteoma.
Las OTSC brindan una oportunidad única para probar la respuesta individual al tratamiento ex vivo e identificar perfiles transcriptómicos y proteómicos individuales asociados con la respuesta respectiva de distintos cortes de un tumor. Las OTSC se pueden explorar más a fondo para identificar estrategias terapéuticas que permitan personalizar el tratamiento del cáncer de páncreas primario y la metástasis.
Introducción
Los modelos preclínicos existentes de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) y sus respectivas metástasis son malos predictores de la respuesta al tratamiento en los pacientes, lo que supone un inconveniente importante en el desarrollo de fármacos y en la identificación de biomarcadores predictivos1. Aunque modelos como los organoides derivados de pacientes y los xenoinjertos derivados de pacientes son prometedores, su uso sigue siendo limitado2. Las principales limitaciones de estos modelos in vitro son la falta de microambiente tumoral y el xenoinjerto en especies inmunocomprometidas no humanas. Especialment....
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Protocolo
Las muestras de tejido fueron recolectadas y procesadas después de la aprobación del comité de ética local de la Universidad de Lübeck (# 16-281).
1. Recolección y manipulación de tejidos frescos
NOTA: Cada muestra de tejido humano no fijada debe manipularse con precaución para evitar el riesgo de infección por patógenos transmitidos por la sangre. Todos los pacientes deben ser examinados para dar negativo en las pruebas de VIH, VHB y VHC antes del procesamiento de los tejidos. Use una capa protectora y manipule las muestras de tejido humano con guantes.
- Recoja muestras de tejido PDAC frescas, no fijada....
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Resultados
En la Figura 1 se proporciona una descripción general del flujo de trabajo para cultivar OTSC a partir de tejido tumoral fresco y no congelado. Los especímenes de PDAC primarios y metástasis se recolectaron directamente después de la resección quirúrgica y se almacenaron durante la noche en hielo húmedo a 4 °C en la solución de almacenamiento de tejido. Los especímenes se procesaron y las rodajas se cultivaron como se describe en el protocolo. La morfología macroscópica de cada OTSC no cambi.......
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Discusión
Las OTSC de muestras tumorales frescas son una aproximación cercana del tumor in situ. Mantienen su morfología basal, actividad proliferativa y microambiente durante el cultivo durante un período definido y dependiente del tejido 11,12,13. Esta técnica permite la aplicación inmediata del tratamiento al tejido tumoral humano viable ex vivo y los análisis posteriores, como el perfil del transcriptoma y el proteom.......
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Divulgaciones
Los autores no revelaron posibles conflictos de intereses.
Agradecimientos
R. Braun contó con el apoyo de la Escuela de Científicos Clínicos de Lübeck (DFG #413535489) y del Programa de Financiación Junior de la Universidad de Lübeck.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM/F-12 Medio Avanzado | Gibco | 12634028 | |
| Agarosa de bajo punto de fusión | Roth | 6351.2 | 8% en solución de Ringer |
| Diluyente de anticuerpos, reductor de fondo | Dako | S3022 | |
| AquaTex | Merck | 108562 | |
| Bioetanol (99%, desnaturalizado) | CHEMSolute | 2,21,19,010 | |
| Ácido cítrico monohidrato | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Caspasa-3 escindida (Asp175) (5A1E) mAb de conejo | Tecnología de señalización | 9664 | dilución 1:400 |
| Derby Hojas de afeitar de seguridad de doble filo Derby | Tokai | ||
| Casetes de inclusión | Roth | H579.1 | |
| Eosina Y-solution 0,5% acuosa | Merck | 10,98,44,100 | |
| Eukitt Medio de montaje de endurecimiento rápido | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Suero fetal bovino | Gibco | 10270106 | |
| solución de formaldehído 4,5%, tamponado | Bü fa Chemikalien | B211101000 | |
| Hem solución de alumbre ácida ácida según Mayer | Roth | T865 | |
| EGF humano | Milteniy Biotec | 130-097-794 | |
| Hidrocortisona | Sigma Aldrich (Merck) | H0888 | |
| Peróxido de hidrógeno 30% | Merck | 1,08,59,71,000 | |
| Insulina humana | Sigma Aldrich (Merck) | 12643 | |
| Sustrato líquido DAB+ Sistema de cromógeno | Dako | K3468 | |
| MACS Solución de almacenamiento de tejidos | Milteniy Biotech | 130-100-008 | |
| Metanol | Merck | 10.600.092.500 | |
| Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Inserto de cultivo celular milicell, 30 mm, PTFE hidrófilo, 0,4 y micro; m | Millipore (Merck) | PICM0RG50 | |
| Ratón monoclonal antihumano Citoqueratina 7 (Clon OV-TL 12/30) | Dako | M7018 | dilución 1:200 |
| Ratón monoclonal antihumano Ki67 Clon MIB-1 | Dako | M7240 | Dilución 1:200 |
| Ratón monoclonal Anti-vimentina (Clon V9) | Dako | M0725 | dilución 1:200 |
| Control negativo Ratón IgG2a | Dako | X0943 | dilución 1:200 |
| Control negativo Ratón IgG1 | Dako | X093101-2 | Parafina de dilución 1:200 |
| (temperatura de fusión 56 °C - 58 °C) | Merck | 10,73,37,100 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml) | Gibco | 15140122 | |
| PBS pH 7,4 (1x) Grado de citometría de flujo | Gibco | A12860301 | |
| Sal sódica de Resazurina; 10 mg/ml en PBS | Sigma Aldrich | R7017 | dilución 1:250 |
| Solución de Ringer | Fresenius Kabi | 2610813 | |
| RPMI-1640 Medio | Sigma Aldrich (Merck) | R8758 | |
| Placa de prueba de cultivo de tejidos 6 | TPP | 92006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | |
| VECTASTAIN Elite ABC-Peroxidasa Kit | Vector Laboratories | PK-6200 | |
| Xileno (extra puro) | J.T.Baker | 8,11,85,000 | |
| Equipo | |||
| Lector de microplacas ClarioStar | BMG Labtech | ||
| Centro de incrustación de parafina E61110 | Leica | ||
| Microtomo rotativo Microm HM355S Sistema de transferencia de | Thermo Scientific | ||
| Microm STS | Thermo Scientific | ||
| VT 1200S Vibratom | Leica |
Referencias
- Nevala-Plagemann, C., Hidalgo, M., Garrido-Laguna, I. From state-of-the-art treatments to novel therapies for advanced-stage pancreatic cancer. Nature Reviews. Clinical Oncology. 17 (2), 108-123 (2020).
- Tiriac, H., et al.
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Reimpresiones y permisos
