Vorbereitung von menschlichem Gewebe, eingebettet in die optimale Schnitttemperaturmischung für die massenspektrometrische Analyse

Summary

Sphingolipide sind bioaktive Metaboliten mit einer gut etablierten Rolle bei menschlichen Erkrankungen. Die Charakterisierung von Veränderungen in Geweben mit Massenspektrometrie kann Rollen in der Krankheitsätiologie aufdecken oder therapeutische Ziele identifizieren. Die OCT-Verbindung, die für die Kryokonservierung in Biorepositorien verwendet wird, stört jedoch die Massenspektrometrie. Wir skizzieren Methoden zur Analyse von Sphingolipiden in menschlichen Geweben, die in OCT mit LC-ESI-MS/MS eingebettet sind.

Abstract

Sphingolipide sind zelluläre Komponenten, die eine gut etablierte Rolle im menschlichen Stoffwechsel und bei Krankheiten spielen. Die Massenspektrometrie kann verwendet werden, um festzustellen, ob Sphingolipide bei einer Krankheit verändert sind, und um zu untersuchen, ob Sphingolipide klinisch gezielt eingesetzt werden können. Richtig durchgeführte prospektive Studien, die Gewebe direkt aus dem OP-Bereich gewinnen, können jedoch zeitaufwendig und technisch, logistisch und administrativ herausfordernd sein. Im Gegensatz dazu können retrospektive Studien die Vorteile kryokonservierter menschlicher Proben nutzen, die bereits in großer Anzahl in Gewebebiorepositorien verfügbar sind. Weitere Vorteile der Beschaffung von Geweben aus Biorepositorien sind der Zugang zu Informationen, die mit den Gewebeproben verbunden sind, einschließlich Histologie, Pathologie und in einigen Fällen klinisch-pathologischen Variablen, die alle verwendet werden können, um Korrelationen mit Lipidomics-Daten zu untersuchen. Technische Einschränkungen im Zusammenhang mit der Inkompatibilität der optimalen Schnitttemperaturverbindung (OCT), die in der Kryokonservierung und Massenspektrometrie verwendet wird, stellen jedoch eine technische Barriere für die Analyse von Lipiden dar. Wir haben jedoch bereits gezeigt, dass OCT leicht aus menschlichen Biorepository-Proben durch Wasch- und Zentrifugationszyklen entfernt werden kann, ohne ihren Sphingolipidgehalt zu verändern. Wir haben auch zuvor festgestellt, dass Sphingolipide in menschlichen Geweben, die in OCT kryokonserviert werden, bis zu 16 Jahre stabil sind. In diesem Bericht beschreiben wir die Schritte und den Workflow zur Analyse von Sphingolipiden in menschlichen Gewebeproben, die in OCT eingebettet sind, einschließlich Waschtücher, Wiegen von Geweben zur Datennormalisierung, Extraktion von Lipiden, Vorbereitung von Proben für die Analyse durch Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS / MS), Massenspektrometrie-Datenintegration, Datennormalisierung und Datenanalyse.

Introduction

Sphingolipide sind bioaktive Metaboliten, die für ihre Rolle im menschlichen Stoffwechsel und bei Krankheiten bekannt^{sind 1,2}. Sie regulieren komplexe zelluläre Prozesse wie Zellmigration, Zellüberleben und -tod, Zellbewegung, vesikulären Transport, Zellinvasion und Metastasierung, Angiogenese und die Produktion von Zytokinen 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defekte in der Regulation des Sphingolipidstoffwechsels tragen zur Entstehung und Progression von Krebserkrankungen bei, bestimmen, wie aggressiv Krebserkrankungen sind und wie Krebserkrankungen auf die Therapie ansprechen und Resistenzen gegen diese entwickeln ^3,10. Aufgrund dieser breiten Auswirkungen auf die Ätiologie von Krankheiten sind daher analytische Methoden, die krankheitsspezifische Sphingolipidveränderungen präzise feststellen können, wichtige Werkzeuge. Die Massenspektrometrie (MS) ist die genaueste und zuverlässigste Methode zur Analyse von Sphingolipidveränderungen.

Humanproben, die für die Analyse von Sphingolipidveränderungen verwendet werden können, können prospektiv aus dem OP-Bereich oder retrospektiv aus Gewebe-Biorepositorien gewonnen werden. Frischgewebe aus der Chirurgie sind vorteilhaft, da sie direkt mittels MS oder anderen Analysemethoden analysiert werden können. Der prospektive Erwerb von Geweben birgt jedoch administrative, technische und logistische Hürden, und das Sammeln ausreichender Proben, um statistische Aussagekraft zu erreichen, kann eine Herausforderung sein. Die Gewinnung von Geweben aus Biorepositorien ist vorteilhaft, da sie retrospektiv in großer Zahl erworben werden können und Biorepositorien Histologie und Pathologie bestätigen, Standardarbeitsanweisungen verwenden, um Gewebe kryogen zu konservieren und zu lagern, und klinisch-pathologische Daten liefern können, die für Korrelationsanalysen verwendet werden können. Um jedoch molekulare und strukturelle Merkmale zu erhalten, können Biorepositorien Gewebe kryokonservieren, indem sie sie in eine optimale Schnitttemperatur (OCT) -Verbindung einbetten, was nachweislich die Datennormalisierungsassays und die Quantifizierung von Sphingolipiden durch Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) ^stört11 . Es wurde auch gezeigt, dass Polyvinylalkohol und Polyethylenglykol, die Hauptkomponenten in OCT-Verbindungen, zu einer Ionenunterdrückung in anderen MS-Analyseplattformen^{führen 12,13,14,15}. Daher muss die OCT-Verbindung vor der sphingolipidomischen Analyse durch MS aus dem Gewebe entfernt werden.

In einem früheren Bericht haben wir ein Protokoll für die Entfernung von OCT-Verbindungen aus menschlichen Proben für die LC-ESI-MS/MS-Analyse 11 und die Methodik zum Wiegen von Geweben zur Datennormalisierung¹¹ validiert. Hier beschreiben wir die Schritte des sphingolipidomischen OCT-Compound-Removal Protocol (sOCTrP) und zeigen repräsentative Daten von menschlichen Lungenadenokarzinomtumoren und normalen benachbarten unbeteiligten Geweben.

Protocol

De-identifiziertes menschliches Lungengewebe wurde vom Tissue and Data Acquisition and Analysis Core der Virginia Commonwealth University (VCU) im Rahmen eines vom internen Prüfungsausschuss (IRB) genehmigten Protokolls (#HM2471) gewonnen. Die Verwendung von Mäusen für die Forschung und Ernte von Mäusegeweben wurde vom VCU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.

1. Vorbereitung der Materialien

HINWEIS: Diese Schritte sollten einen Tag vor dem Waschen des Taschentuchs durchgeführt werden.

1. Voretikettieren und wiegen Sie 1,5 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit prägnanten, aber klaren Identifikationscodes für jede Probe, die am nächsten Tag verarbeitet wird. Verwenden Sie einen chemisch beständigen Permanentmarker (siehe Materialtabelle), der bei wiederholter Rohrhandhabung nicht verblasst.
2. Öffnen Sie eine elektronische Tabelle, und kennzeichnen Sie aufeinanderfolgende Spalten mit den folgenden Spaltenüberschriften: Tubenkennung (ID), Röhre allein, Röhre mit Gewebe und Gesamtgewebe. Geben Sie die Tube-IDs, die verarbeitet werden, in die Spalte mit der Bezeichnung Tube-ID ein.
3. Kalibrieren Sie eine analytische Skala vor und stellen Sie sie auf Null. Legen Sie einen sauberen 10-ml-Erlenmeyerkolben in die Mitte der Balanceplatte (der Kolben fungiert als Schlauchhalter). Schließen Sie die Tür der Wägekammer und tarnen Sie die Waage mit dem Kolben.
4. Wiegen Sie 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Legen Sie das Röhrchen vorsichtig in den Kolben und schließen Sie die Tür der Wägekammer. Lassen Sie das Gewicht stabilisieren und notieren Sie das Gewicht allein in der mit der Säule beschrifteten Röhre.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, den 10-ml-Erlenmeyerkolben beim Wiegen von Röhrchen zu bewegen. Wenn der Kolben bewegt wird, zentrieren Sie den Kolben neu und drehen Sie das Gleichgewicht wieder auf. Legen Sie die geschlossenen Röhrchen in ein Gestell und lagern Sie sie, bis sie benötigt werden.
5. 13 x 100 mm Glasröhren und -kappen mit Schraubverschluss mit den Identifikatorcodes voretikettieren und mit 2 ml Methanol der LC-MS-Qualität befüllen. Legen Sie sie in ein Schlauchgestell, verschließen Sie die Röhrchen und bewahren Sie sie bis zum Gebrauch in einem Kühlschrank (4 °C) auf.
   HINWEIS: Verwenden Sie einen Lösungsmittelspender mit Flaschenverschluss (siehe Materialtabelle). Wenn keine verfügbar ist, verwenden Sie Glaspipetten, um die Verwendung von Kunststoffen bei der Abgabe organischer Lösungsmittel zu vermeiden.
6. Voretikettierung von 13 x 100 mm Glasreagenzgläsern. Decken Sie die Reagenzgläser ab und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
7. Voretikettierung von Autoinjektor-Fläschchen mit Identifikationscodes. Decken Sie die Autoinjektor-Durchstechflaschen ab und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei Raumtemperatur.
8. Tuchtrocknende Dochte vorbereiten.
   1. Beginnen Sie mit der Reinigung der chirurgischen Schere, indem Sie sie 5 Minuten lang in Methanol der LC-MS-Qualität tauchen und dann mit einem sauberen Laborgewebe abwischen.
   2. Mit puderfreien Handschuhen das Ende eines Laborgewebes (siehe Materialtabelle) drehen, bis ein fein konischer 30-40 mm Docht gebildet ist.
   3. Schneiden Sie den Docht am dicken Ende mit einer mit Methanol gereinigten Schere ab. Dochte in einen sauberen Karton geben. Machen Sie doppelt so viele Dochte, wie zur Verarbeitung aller Proben erforderlich ist.
9. Bereiten Sie verkürzte 1-ml-Pipettenspitzen vor. Schneiden Sie mit einer mit Methanol gereinigten chirurgischen Schere 4-5 mm von der Spitze einer 1-ml-Pipettenspitze ab und legen Sie die Spitze wieder in den Spitzenhalter. Bereiten Sie doppelt so viele Spitzen vor wie zu verarbeitende Proben.
   HINWEIS: Diese werden bei der Entnahme von gewaschenem Gewebe aus Röhrchen verwendet. Berühren Sie nicht das Ende der Spitze.
10. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in molekularbiologischer Qualität auf 4 °C (0,5 L ist ausreichend) vorkühlen. Dies wird verwendet, um Proben zu entnehmen. Für jede zu verarbeitende Probe 60 ml hochreines entionisiertes Wasser vorkühlen (4 °C).
11. Bereiten Sie interne Standards für die Massenspektrometrie vor. Folgende Lipide werden in Ethanol:Methanol:Wasser (7:2:1; v/v/v) in einer Konzentration von 25 nmol/ml gelöst: d17:1-Sphingosin, (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-en-1,3-diol; d17:1-Sphingosin-1-phosphat, Heptadecasphing-4-enin-1-phosphat; C12-Ceramid (d18:1/C12:0), N-(Dodecanoyl)-sphing-4-enin; C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(Dodecanoyl)-sphing-4-enin-1-phosphocholin; C12-Glucosylceramid (d18:1/C12:0), N-(Dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-ein; C12-Lactosylceramid (d18:1/C12:0), N-(Dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-en.

2. Taschentuchwäsche

HINWEIS: Wenn Sie alle Schritte in Abschnitt 1 einen Tag vorher ausführen, kann ein erfahrener Forscher bis zu 40 Proben pro Tag und Anfänger ~ 10-15 Proben pro Tag verarbeiten. Beginnen Sie früh am Morgen und hören Sie nicht auf, bis alle Schritte in den Abschnitten 2.1-3.8 abgeschlossen sind.

1. Bereiten Sie an dem Tag, an dem das Gewebe verarbeitet wird, den Arbeitsbereich der Biosicherheitswerkbank vor, indem Sie ihn mit einem Wirbel, einem voll geladenen serologischen Pipettor und einer Eisschale ausstatten. Tragen Sie für alle Schritte in diesem Abschnitt geeignete PSA, einschließlich eines Laborkittels, einer doppelten Handschuhschicht und einer Schutzbrille. ACHTUNG: Menschliche Gewebe und Flüssigkeiten sollten als biogefährliche Stoffe betrachtet und behandelt werden.
2. Vorkühlen (4 °C) einer schwenkbaren Eimerzentrifuge, aller Adapter zur Aufnahme von 15-ml-konischen Zentrifugenröhrchen und Zentrifugen-Biocontainment-Deckeln. Pre-Chill (4 °C) eine Zentrifuge mit festem Winkel, die 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen aufnehmen kann.
3. Wenn Gewebe nicht in 15-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen aliquotiert sind, verwenden Sie einen mit Methanol gereinigten Spatel (sauber für jede neue Gewebeprobe), um sie in vormarkierte 15-ml-Polypropylenröhrchen zu übertragen. Beschriften Sie auch die 15-ml-Verschlüsse.
   1. Stellen Sie ein Schlauchgestell, das 15-ml-Zentrifugenröhrchen aufnehmen kann, in eine Eisschale und füllen Sie die Schale mit Eis. Gewebe, das an diesem Tag verarbeitet wird, auftauen, indem Sie es auf Eis in das Gestell legen.
      HINWEIS: Mindestens 3-4 mg Gewebe sollten vom Biolager für die Verarbeitung angefordert werden, da bereits gezeigt wurde, dass die Protokolle zum Waschen und Wiegen von Gewebe bei diesen Gewichten genau und zuverlässig sind¹¹.
4. Bringen Sie die Eisschale mit den Proben in die Biosicherheitswerkbank.
5. Führen Sie drei sOCTrP-Zyklen¹¹ durch, wie unten beschrieben (d. h. führen Sie die Schritte 2.5.1-2.5.5 dreimal aus).
   1. Fügen Sie jedem Röhrchen 10 ml eiskaltes, hochreines entionisiertes Wasser hinzu und verschließen Sie es fest. Lassen Sie die Röhrchen 10 min inkubieren.
   2. Wirbeln Sie jedes Röhrchen kräftig für 10-20 s oder bis das gesamte an den Wänden des Röhrchens abgelagerte Gewebe oder ein Gewebepellet vollständig resuspendiert ist.
      HINWEIS: In den sOCTrP-Zyklen 2-3 ist es wichtig, dass das Pellet resuspendiert wird, damit alle OCT im Pellet in die Waschlösung verdünnt wird.
   3. Die Röhrchen werden in die vorgekühlte (4 °C) schwingende Schaufelzentrifuge überführt. Zentrifugieren Sie Proben bei 4.000-5.000 x g für 10 min bei 4 °C.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Entstehung von und die Exposition gegenüber biogefährlichen Aerosolen, die während der Zentrifugation entstehen, indem Sie die Zentrifugenträger mit einem Biocontainment-Deckel verschließen (siehe Materialtabelle).
   4. Proben aus der Zentrifuge entnehmen und in die Eisschale überführen. Legen Sie das Tablett in einen Biosicherheitsschrank und öffnen Sie die Röhrchen. Speichern Sie die Kappen.
   5. Die Waschlösung vorsichtig absaugen. Vermeiden Sie es, das Gewebematerial im Pellet anzusaugen, indem Sie ~ 0,5 ml des Überstands in der Röhre belassen. Verschließen Sie die Röhrchen und vermeiden Sie Kreuzkontaminationen, indem Sie beschriftete Kappen mit Röhrchen kombinieren.
      HINWEIS: Die Waschlösung (der Überstand) in Schritt 2.5.5 ist ein biogefährliches Material; Handhabung und Entsorgung gemäß den für Proben menschlichen Ursprungs geeigneten biologischen Sicherheitsrichtlinien.

3. Gewebewiegen (zur Datennormalisierung)

1. Nach dem letzten sOCTrP-Waschgang den größten Teil der Waschlösung vorsichtig absaugen, aber das Pellet nicht stören. Lassen Sie ~0,5 ml der Waschlösung in der Tube.
2. Nehmen Sie mit den verkürzten Pipettenspitzen (vorbereitet in Schritt 1.9) 500 μL eiskaltes PBS auf und geben Sie es in das Röhrchen.
   1. Verwenden Sie die gleiche Spitze, resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig und entnehmen Sie das gesamte Gewebe. Vermeiden Sie turbulentes Pipettieren, um den Gewebeverlust durch die Haftung an den Wänden der Röhrchen- und Pipettenspitze zu verringern.
3. Geben Sie das resuspendierte Gewebe in das entsprechende vormarkierte und vorgewogene 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Gewebe im Datensatz.
4. Die 1,5 ml Röhrchen in eine vorgekühlte Zentrifuge geben und das Gewebe bei 7.000 x g für 5-7 min und 4 °C pelletieren.
   1. Holen Sie Röhrchen und saugen Sie vorsichtig so viel PBS wie möglich ab, ohne das Pellet zu stören. Legen Sie das Röhrchen wieder auf Eis.
5. Zentrifugenröhrchen für weitere 3 Minuten bei 7.000 x g, um sicherzustellen, dass das Gewebe gut pelletiert wird. Übertragen Sie die Röhrchen auf Eis.
   HINWEIS: Der zusätzliche Zentrifugationsschritt ist wichtig, um Gewebeverlust beim Entfernen der gesamten Waschlösung und des Dochtes zu verhindern. Wenn Sie mehr als fünf Proben verarbeiten, wiederholen Sie den 3-minütigen, 7.000 x g Zentrifugationsschritt, nachdem jede fünfte Probe verarbeitet wurde, um sicherzustellen, dass das Gewebe pelletiert bleibt.
6. Entfernen Sie mit den in Schritt 1.8 vorbereiteten Dochten vorsichtig die restliche Waschlösung. Verwenden Sie für jede Probe einen sauberen Docht. Es ist akzeptabel, das Gewebe vorsichtig mit dem Docht abzutupfen, was hilft, den größten Teil der Waschlösung zu entfernen, aber den Verlust von Gewebe durch Anhaften am Docht zu vermeiden. Schließen Sie die Röhre und legen Sie sie auf Eis.
7. Wiegen Sie jedes Röhrchen in der kürzlich kalibrierten, tarierten und genullten Analysenwaage.
   1. Jedes Röhrchen in den Erlenmeyerkolben des Glases geben und die Kammertür schließen. Wenn sich das Gewicht stabilisiert hat, notieren Sie es in der elektronischen Tabellenspalte mit der Bezeichnung Tube w / Tissue.
   2. Stellen Sie das Röhrchen nach dem Wiegen wieder auf Eis.
8. Fügen Sie 300 μL eiskaltes PBS hinzu. Entnehmen Sie vorsichtig das gesamte Gewebe mit einer verkürzten Pipettenspitze (Schritt 1.9) und legen Sie es in ein vorbeschriftetes Glasröhrchen mit Schraubverschluss (hergestellt in Schritt 1.5), das 2 ml eiskaltes Methanol der LC-MS-Qualität enthält (fügen Sie das Gewebe dem Methanol hinzu, nicht an der Seite des Röhrchens).
9. Berechnen Sie die Menge an Gewebe, die gewaschen wurde, indem Sie den Schlauch allein vom Schlauch mit Gewebewert subtrahieren. Notieren Sie diese Zahl in der gesamten Gewebespalte. Der Gesamtwert des Gewebes wird verwendet, um die Daten der Massenspektrometrie in Schritt 6.12 zu normalisieren.
10. Lagern Sie die Proben bei -80 °C, bis sie für die Schritte 4.1-4.15 bereit sind.
    HINWEIS: Dies ist ein guter Haltepunkt, und die Proben können für einige Wochen bei -80 ° C sicher gelagert werden. Für andere Gewebenormalisierungsmethoden, wie Proteinkonzentration oder Lipidphosphatgehalt, siehe Rohrbach et ^al.11.

4. Lipidextraktion

HINWEIS: Es ist wichtig, diese Schritte am Morgen zu beginnen, insbesondere wenn viele Proben verarbeitet werden. Vor dem Start ein Wasserbad oder einen Inkubator auf 48 °C vorheizen.

1. Entnehmen Sie die in Schritt 3.8 vorbereiteten Proben und die MS-Lipidstandards (vorbereitet in Schritt 1.11) aus dem Gefrierschrank. Lassen Sie sie für 20 min auf Raumtemperatur ausgleichen.
2. Wirbeln und tauchen Sie die interne Standardlösung in ein Ultraschall-Wasserbad (siehe Materialtabelle) für 2-3 min oder bis die MS-Lipidstandards vor der Abgabe in Proben vollständig aufgelöst sind. Dadurch werden Fehler bei der Datennormalisierung vermieden.
3. Unter Verwendung einer Repetierpipette werden 250 pmol (10 μL aus der in Schritt 1.11 hergestellten 25 nmol/ml Lösung) interner Massenspektrometriestandards zu jedem Röhrchen hinzugefügt. Verschließen Sie die Röhrchen leicht.
4. Um die Homogenisierung zu erleichtern, stellen Sie das Methanolvolumen auf 2 ml ein. Verwenden Sie nur Methanol der Klasse LC-MS/MS.
5. Verwenden Sie einen Homogenisator, um das Gewebe zu trituieren, bis keine Klumpen mehr sichtbar sind (typischerweise 5-20 s). Bewegen Sie die Homogenisatorspitze in kreisenden Bewegungen und drücken Sie vorsichtig gegen die Rohrwand, um die Verreibung zu unterstützen. Verschließen Sie das Röhrchen erneut.
   HINWEIS: Wenn Sie sicherstellen, dass alle Gewebe fein verreibt sind, wird die Lipidextraktion maximiert. Fügen Sie den Proben vor der Homogenisierung kein Chloroform hinzu, da die Einweg-Homogenisatorspitzen aus Kunststoff bestehen, der sich in chloroformhaltigen Lösungen auflöst.
6. Tauchen Sie das Rohr in einem Winkel von 45° in ein Ultraschall-Wasserbad für 5-10 s.
   1. Wenn sich beim Eintauchen in das Ultraschallbad keine Gewebeklumpen bilden, verschließen Sie es und gehen Sie zum nächsten Röhrchen über.
   2. Wenn sich beim Eintauchen des Röhrchens in das Ultraschallbad Gewebeklumpen bilden, homogenisieren Sie sie erneut und zielen Sie auf die Klumpen ab.
   3. Wiederholen Sie diesen Vorgang (Homogenisierung/Eintauchen in ein Ultraschallbad) iterativ, bis alle großen Gewebeklumpen aufgebrochen sind.
7. Fügen Sie in einem Abzug LC-MS-Chloroform und Methanol zu jedem Röhrchen hinzu (verwenden Sie einen Flaschenspender), um ein Verhältnis von 2:1:0,1 Methanol:Chloroform:Wasser zu erreichen. Verschließen Sie die Tuben mit sauberen Kappen fest und lassen Sie sie bis zum Ende des Tages auf dem Tisch.
   1. Verwenden Sie für Gewebe mit einem Gewicht von 50 mg oder weniger ein Gesamtextraktionsvolumen von 4 ml und stellen Sie dieses Verhältnis (50 mg:4 ml Extraktionslösung) für größere Proben ein.
8. Bevor Sie an diesem Abend gehen, legen Sie die dicht verschlossenen Röhrchen in ein 48 °C warmes Wasserbad oder einen Inkubator und inkubieren Sie sie über Nacht.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Röhrchen fest verschlossen sind, damit sich die Lösungsmittelverhältnisse nicht durch Verdampfung ändern.
9. Am nächsten Morgen werden die Proben aus dem 48 °C warmen Wasserbad entnommen und lösungsmittelunlösliche Ablagerungen durch Zentrifugieren bei 4.000-5.000 x g bei 4 °C für 20 min pelletiert.
10. In einem Abzug wird der Überstand vorsichtig in die vorbeschrifteten 13 x 100 mm Borosilikatglas-Reagenzgläser dekantiert. Neigen Sie das 13 x 100 mm Rohr in einem Winkel von 30-45°, um das Dekantieren zu erleichtern.
    HINWEIS: Wenn Sie mehr als 12 Proben verarbeiten, lassen Sie die zentrifugierten Röhrchen nicht für längere Zeit sitzen, da die Pellets weich werden und unlösliche Ablagerungen übertragen werden, wenn Schritt 4.10 durchgeführt wird. Um dies zu vermeiden, nehmen Sie nur 12 Röhrchen gleichzeitig aus der Zentrifuge und zentrifugieren Sie die anderen Röhrchen weiter, bis Sie bereit sind, sie zu dekantieren.
11. Übertragen Sie die Rohre auf einen Vakuumkonzentrator, der 13 x 100 mm Rohre aufnehmen kann. Alle Lösungsmittel mit einem anfänglichen 1 h Heizschritt (40 °C) verdampfen und unter maximalem Vakuum laufen lassen.
12. Entfernen Sie die Röhrchen aus dem Vakuumkonzentrator und fügen Sie jedem Röhrchen 500 μl Methanol der LC-MS-Qualität (verwenden Sie einen Flaschenaufsatzspender) hinzu.
13. Resuspendieren Sie die getrockneten Lipidextrakte durch Wirbeln für 5-10 s, gefolgt von Tauchröhrchen in einem 45°-Winkel in einem Ultraschall-Wasserbad für 2 min unter Drehen des Röhrchens. Re-Vortex für 5 s und tauchen Sie für eine zusätzliche Minute in das Ultraschall-Wasserbad.
    HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt, um die maximale Rückgewinnung der extrahierten Lipide sicherzustellen. Fahren Sie nicht fort, bis das gesamte getrocknete Material an der Wand des Röhrchens resuspendiert wurde.
14. Die 13 x 100 mm großen Röhrchen in eine vorgekühlte (4 °C) Zentrifuge geben und unlösliche Ablagerungen durch Zentrifugieren bei 4.000-5.000 x g bei 4 °C für 20-30 min entfernen.
15. Dekantieren Sie den geklärten Überstand vorsichtig in eine vormarkierte Autoinjektordurchstechflasche. Das Kippen des Autoinjektorfläschchens in einem Winkel von 30-45° erleichtert das Dekantieren. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Inhalt des 13 x 100 mm großen Röhrchens in die Durchstechflasche des Autoloaders umgefüllt ist.
16. Verschließen Sie die Röhrchen fest und lagern Sie die Röhrchen bei -80 °C bis zur Analyse durch LC-ESI-MS/MS.

5. LC-ESI-MS/MS-Analyse

HINWEIS: Das folgende Verfahren verwendet ein binäres Pumpensystem, das mit einem Autoinjektor, einem Entgaser und einem LC-MS/MS-System gekoppelt ist, das in einem Triple-Quadrupol-Modus arbeitet. Die Säulentemperatur wurde mit einem Säulenofen gehalten. Siehe Materialtabelle für Details zu den verwendeten Geräten.

1. Vorbereitung der mobilen Phase A1 (CH 3 OH:H₂O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, mit 5 mM Ammoniumformiat) und der mobilen Phase B1 (CH₃OH:HCOOH, 99:1, v:v, mit 5 mM Ammoniumformiat). Verwenden Sie nur Lösungsmittel, Wasser und Reagenzien der LC-MS-Qualität.
2. Bereiten Sie für jeden Probensatz vier Blank-Autoloader-Fläschchen vor, die 500 μL Methanol der LC-MS-Qualität enthalten.
3. Bereiten Sie für jeden Probensatz zwei interne Standard-Autoloader-Fläschchen (als IS-Etikett bezeichnet) vor, indem 10 μL (insgesamt 250 pmol pro Standard) der in Schritt 1.11 hergestellten internen Standardlösung in 500 μL Methanol der LC-MS-Qualität verdünnt werden.
4. Stellen Sie die Temperatur des Säulenofens auf 60 °C und die Temperatur der Ionenquelle auf 500 °C ein.
5. Verwenden Sie für die MS/MS-Analyse den Triple-Quadrupol-Modus des Spektrometers. Stellen Sie den ersten Quadrupol (Q1) so ein, dass er Vorläuferionen passiert, während der dritte Quadrupol (Q3) molekular unterschiedliche Produktionen (oder einen Scan über mehrere m / z in Q1 oder Q3) mit N2 passiert, um Kollisionsdissoziationen in Quadrupol 2 (Q2) zu induzieren, der von Q1 um 30-120 eV versetzt ist.
6. Stellen Sie das MRM-Erkennungsfenster (Multiple Reaction Monitoring Pairs) auf 120 s mit einer Zielscanzeit von 1,0 s ein. In Tabelle 1 finden Sie eine Liste der MRM-Paare, Ionisationsenergien und Kollisionsenergien.
7. Verwenden Sie die folgenden Parameter, um Sphingolipide im LC-Schritt aufzulösen: Bei einer Flussrate von 0,7 ml/min eine 2,1 (i.d) x 50 mm C18 Umkehrphasensäule für 0,5 min mit einer Lösungsmittelmischung aus 95% mobiler Phase A1 und 5% mobiler Phase B1 ausgleichen.
   1. Nach der Probeninjektion wird das Verhältnis der mobilen Phase A1/B1 bei 95/5 für 2,25 min gehalten, gefolgt von einem linearen Gradienten zu 100% B1 über 1,5 min, der dann bei 100% B1 für 5,5 min gehalten wird, gefolgt von einer 0,5-minütigen Gradientenrückkehr zu 95/5 A1/B1.
   2. Nach dem Lauf die Säule mit einer Mischung aus 95/5 A1/B1 für 0,5 min wieder ausgleichen.
8. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für den Proben-Autoloader: Spülvolumen, 500 μL; Nadelhub, 52 mm (dies sollte je nach Größe und Volumen der Durchstechflasche in jeder Durchstechflasche angepasst werden); Spülgeschwindigkeit, 35 μL/s; Abtastgeschwindigkeit, 5,0 μL/s; Spülzeit, 2 s; Spülmodus, vor und nach der Aspiration; Spülzeit,2 s.
9. Legen Sie die in Schritt 4.15 vorbereiteten Proben in der folgenden Reihenfolge auf eine Autoloader-Schale: Leer; IST; Leer; In Schritt 4.15 vorbereitete Proben; Leer, IS, Leer.
10. Analysieren Sie 5-10 μL jeder Probe mit LC-ESI-MS/MS. Analysieren Sie das gleiche Volumen für alle Proben im Datensatz.

6. Datenverarbeitung, Integration und Normalisierung

HINWEIS: Obwohl die folgenden Schritte ein Verfahren für bestimmte Software skizzieren (siehe Materialtabelle), können ähnliche Verfahren auf äquivalenten LC-MS-Geräten und Software verwendet werden, um MRM-Paare für die analysierten Lipidklassen und entsprechende interne Standards zu integrieren.

1. Öffnen Sie die Quantifizierungssoftware. Doppelklicken Sie auf der Registerkarte Quantitieren auf den Quantitationsassistenten. Navigieren Sie im Popup-Fenster im ganz linken Arbeitsbereich zum richtigen Datensatz und klicken Sie mit der linken Maustaste darauf. Die verfügbaren Beispiele werden im mittleren Arbeitsbereich angezeigt.
2. Markieren Sie die zu analysierenden Proben und klicken Sie dann auf den Rechtspfeil, um Proben zum Arbeitsbereich Ausgewählte Proben hinzuzufügen. Klicken Sie auf Weiter , um zu den Einstellungen und dem Abfragebildschirm zu navigieren, in dem normalerweise die Standardeinstellungen verwendet werden.
3. Klicken Sie auf Weiter , um zum Auswahlbildschirm der Integrationsmethode zu navigieren. Wählen Sie eine geeignete Integrationsmethode aus, die MRM-Übergangspaare für die zu analysierenden Lipide enthält. MRM-Übergangspaare finden Sie in Tabelle 1 . Klicken Sie auf Fertig stellen.
   HINWEIS: Die Aufbewahrungszeiten variieren je nach Instrumentierung und individuellen Einstellungen und müssen daher für jedes einzelne Setup überprüft werden.
4. Klicken Sie in der Navigationsleiste auf den Bereich Peak Review , damit MRM-Paare überprüft werden können. Um die Überprüfung zu erleichtern, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Bereich Spitzenüberprüfung , ändern Sie das automatische Zoomen auf 100 % des größten Gipfels und ein Zoomfenster von 1,00 - 2,00 Minuten.
5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Fenster Quantifizierungsanzeige und wählen Sie Analyt und das gewünschte zu untersuchende Sphingolipid aus. Stellen Sie sicher, dass in den Leerproben keine Spitzenwerte enthalten sind und dass der richtige Peak in die IS-Proben integriert wurde.
6. Beginnen Sie mit der Integration unbekannter Beispiele. Arbeiten Sie jeweils eine Sphingolipidklasse und untersuchen Sie die Retentionszeit für das MRM-Paar des internen Standards (d. h. C12:0 Ceramid) und stellen Sie sicher, dass die Software den richtigen Peak integriert hat.
7. Fahren Sie mit den Analyten derselben Lipidklasse fort (d. h. C14:0 Ceramid, C16:0-Ceramid usw.), beginnend mit dem kürzesten kettenlangen Lipid der Klasse. Überprüfen Sie für jedes Kettenlängenlipid, ob die Softwareroutine den richtigen MRM-Paarpeak integriert hat.
8. Wenn alle Analyten integriert sind, erstellen Sie eine elektronische Tabelle für jede analysierte Sphingolipidspezies (z. B. Ceramide, Sphingomyeline usw.). Beschriften Sie Spaltenüberschriften so, dass sie der Reihenfolge der Analyten und Kettenlängen in der LC-MS/MS-Quantifizierungssoftware entsprechen. Fügen Sie auch eine Spaltenüberschrift für die Stichproben-ID und die in Schritt 3.9 ermittelten Stichprobennormalisierungsgewichte hinzu.
   HINWEIS: Wie bereits¹¹ beschrieben, umfassen andere gängige Normalisierungsmaße den Gesamtlipidphosphatgehalt oder die Proteinmenge.
9. Exportieren oder kopieren Sie die Spitzenbereiche für alle Analyten und internen Standards in die elektronische Tabelle.
10. Normalisieren Sie Daten, indem Sie die integrierte Peakfläche jeder Kettenlängenspezies für eine gegebene Sphingolipidklasse durch die Peakfläche des entsprechenden internen Standards dividieren. Beispiel: C14:0 Ceramid, C16:0 Ceramid, C18:1 Ceramid usw. sollten jeweils durch C12:0 dividiert werden Ceramid interner Standard-Peakbereich.
11. Die Peakfläche wird in Mol gewonnenes Lipid umgerechnet, indem die normalisierte Peakfläche (berechnet in Schritt 6.10) mit der Menge des internen Standards in Pikomolen multipliziert wird, die der Probe in Schritt 4.3 hinzugefügt wurde. In diesem Protokoll beträgt diese Menge 250 pmol.
12. Um die relative Lipidmenge in jeder Probe zu erhalten, dividieren Sie die Picomolen jeder Lipidkettenlänge durch das in Schritt 3.9 bestimmte Gewebegewicht. Dies ergibt Einheiten von Picomolen von Lipid pro mg Gewebe.

Representative Results

In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert eine Methode zur Entfernung von OCT aus kryokonservierten menschlichen Geweben und wiegen die Gewebe für die Analyse durch LC-ESI-MS/MS. Die für dieses Verfahren erforderlichen Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. In Abbildung 1 sind die Ergebnisse eines typischen Experiments dargestellt, bei dem 10 menschliche Lungenadenokarzinom-Tumoren und 10 normale benachbarte Gewebe gewaschen wurden, um OCT zu entfernen und mit LC-ESI-MS / MS analysiert wurden. Wichtig ist, wie wir bereits gezeigt haben¹¹, dass es verschiedene kettenlange Arten von Ceramiden (Abbildung 1A) und Monohexosylceramiden (Abbildung 1B) gibt, die in Lungenadenokarzinomtumoren im Vergleich zu normalen benachbarten unbeteiligten Geweben signifikant erhöht sind.

In Kontrollexperimenten zur Beurteilung der Wirkung von OCT auf die in Abschnitt 4 beschriebenen Lipidextraktionsschritte wurden 200 mg Mäuseleber (C57BL6; männlich; 14-16 Wochen alt) in 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert und homogenisiert, bis sie fein verrieben waren. Die resultierende feine Lebersuspension wurde dann ausgiebig mit einem Sondenbeschaller beschallt (drei Runden à 1 min Beschallung auf Eis, 1 min Ruhe auf Eis, 60% Leistung; Mikrospitze). Aus dieser Lösung wurden sechs 300 μL Leberhomogenat-Replikate hergestellt. Zu drei Replikaten wurden 200 mg OCT hinzugefügt (durchschnittliche Menge, die in Biorepository-Proben¹¹ gefunden wurde), und 200 μL Wasser wurden zu den anderen drei hinzugefügt. Die Proben wurden dann parallel nach den in Abschnitt 4 beschriebenen Schritten verarbeitet. Wichtig ist, dass nach dem Zentrifugieren der einphasigen Bligh-Dryer-Lösung OCT-haltige Proben trüb waren, während die Kontrollproben, die Wasser enthielten, klar waren (Abbildung 2A). Die Trübung in der einphasigen Lipidextraktionslösung blieb auch nach erhöhter Zentrifugation und umfangreicher Beschallung bestehen (nicht gezeigt). Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wiesen OCT-haltige Proben große Pellets auf (Abbildung 2B), die selbst unter starkem Wirbel und ausgedehnter Beschallung nicht in Methanol rekonstituiert werden konnten. Proben, die OCT enthielten, zeigten auch einen großen Signalverlust für interne Standards aller analysierten Spezies (Abbildung 3A-G). Wir haben auch zuvor gezeigt, dass Proben, die OCT enthielten, Signalverlust für viele der analysierten Sphingolipide zeigten¹¹.

Typischerweise wird erwartet, dass die Sphingolipidstandards sequentiell eluieren, wie in Abbildung 4 in der folgenden Reihenfolge gezeigt: d17:1 Sphingosin, d17:1 Sphingosin-1-phosphat, C12:0 Lactosyl-Ceramid, C12:0 Monohexosylceramid, C12:0 Sphingomyelin und C12:0 Ceramid. Für jede dieser Sphingolipidspezies ergibt sich unter Verwendung der in Abschnitt 5 und zuvor 11 beschriebenen Gradienten- und Instrumentierungseinstellungen eine Verschiebung der Retentionszeit von etwa +^0,15 min für jede 2-Kohlenstoff-Zunahme der Kettenlänge. Wie in Abbildung 5 gezeigt, eluiert beispielsweise C14:0-Ceramid (Abbildung 5B) etwa +0,15 min später als C12:0-Ceramid (Abbildung 5A). Eine Doppelbindung in der Fettsäure führt oft zu einer Verschiebung der Retentionszeit um -0,15, so dass C16:0-Ceramid (Abbildung 5C) eine ähnliche Retentionszeit wie C18:1-Ceramid aufweist (Abbildung 5D). Längere Kettenlipide (d. h. C24:0, C26:0) können jedoch größere Retentionszeitverschiebungen aufweisen (Abbildung 5I,K).

Abbildung 1: Sphingolipidprofile von Lungenadenokarzinomen und angrenzenden unbeteiligten Lungengeweben. Gewebe wurden kryogen in OCT gelagert, aufgetaut, mit drei sOCTrP-Zyklen verarbeitet, gewogen und mittels LC-ESI-MS/MS analysiert. Die angegebenen Acylkettenlängenspezies Ceramid (A), Monohexosylceramid (B), Sphingomyelin (C), Lactosylceramid (D) und Sphingosin (E; Sph), Sphingosin-1-phopshat (F; S1P), Dihydro-Sph (E) und Dihydro-S1P (F) wurden quantifiziert. n = 10 Tumoren und n = 10 benachbarte unbeteiligte Gewebe. Boxplots zeigen Mediane (schwarze Linie) und Schnurrhaare von min bis max. ns, nicht signifikant; , S≤0.005; , p ≤ 0,0005. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Repräsentative Bilder von extrahierten Proben mit und ohne OCT. Mausleber wurden homogenisiert und beschallt, aufgeteilt in sechs identische Proben: 200 mg OCT wurden zu drei Proben und Wasser zu den anderen drei hinzugefügt. (A) Nachdem Methanol und Chloroform zugegeben wurden, um ein Verhältnis von 2:1:0,1 Methanol:Chloroform:Wasser (v:v:v) zu erreichen, Inkubation über Nacht bei 48 °C, gefolgt von Zentrifugation, waren die Überstände von Proben, die OCT enthielten, trüb und konnten nicht durch Beschallung, Wirbeln oder Zentrifugieren geklärt werden. (B) Nach der Lösungsmittelverdampfung wurde ein großes Pellet aus OCT-haltigen Proben gewonnen, die nach umfangreicher Beschallung und Wirbelbildung nicht vollständig in 0,5 ml Methanol rekonstituiert werden konnten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: LC-ESI-MS/MS-Quantifizierung von Sphingolipidstandards bei Vorhandensein oder Fehlen von OCT. Mausleber wurden homogenisiert, beschallt und in sechs identische Proben aufgeteilt. Zu drei der sechs Proben wurden 200 mg OCT hinzugefügt, während zu den anderen drei Wasser hinzugefügt wurde. Nach Zugabe von internen Standards, Methanol und Chloroform, wurden die Proben identisch verarbeitet und extrahierte Lipide wurden mittels LC-ESI-MS/MS analysiert. Gezeigt sind mehrere Reaktionsüberwachungspaare (MRM) der angezeigten Lipide (A-F) und entsprechende integrierte Peakbereiche (G). Abkürzungen: Sph, Sphingosin; S1P, Sphingosin-1-phosphat. Schwarze Pfeile zeigen auf das richtige MRM-Paar für das angegebene Sphingolipid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Relative Retentionszeiten für LC-ESI-MS/MS Mehrfachreaktionsüberwachungspaare von Sphingolipidstandards. Mäuseleber wurden homogenisiert und beschallt; interne Standards, Methanol und Chloroform hinzugefügt; und Lipide, extrahiert und analysiert durch LC-ESI-MS/MS. Gezeigt sind Retentionszeiten mehrerer Reaktionsüberwachungspaare der angegebenen Lipide (A-F). Beachten Sie die relative Reihenfolge, in der Lipide während des Flüssigkeitschromatographiegradienten eluieren. Abkürzungen: Sph, Sphingosin; S1P, Sphingosin-1-phosphat; SM, Sphingomyelin. Die X-Achse ist die Verweilzeit des MRM-Paares in Minuten. Die Y-Achse ist die Signalintensität für die MRM-Paare. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Acylkettenlängenabhängige Verschiebung der Retentionszeit von LC-ESI-MS/MS MRM-Paaren. Mäuseleber wurden homogenisiert und beschallt; interne Standards, Methanol und Chloroform hinzugefügt; und Lipide, extrahiert und analysiert durch LC-ESI-MS/MS. Dargestellt sind Retentionszeiten und MRM-Paare der angegebenen Lipide. Beachten Sie die Verschiebung der Retentionszeit mit zunehmender Acylkettenlänge für verschiedene Lipide (A-K), die typischerweise einer +0,15-minütigen Retentionszeit pro 2-Kohlenstoff-Anstieg entspricht. Eine Doppelbindung führt zu einer Verschiebung der Retentionszeit von -0,15 min (D,H,J). Bei längerkettigen Lipiden kann die relative Erhöhung der Retentionszeit jedoch länger sein (G-K). Die X-Achse ist die Verweilzeit des MRM-Paares in Minuten. Die Y-Achse ist die Signalintensität für die MRM-Paare. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: MRM-Paare, Ionisationsparameter und Kollisionsenergien für die LC-ESI-MS/MS-Analyse. EP, Declustering-Potenzial; CE, Kollisionsenergie. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

OCT ist ein gängiges Langzeit-Kryokonservierungsmittel, das in Biorepositorien verwendet wird. OCT kann jedoch zu einer Ionenunterdrückung führen, wenn Gewebe mit verschiedenen Massenspektrometrieplattformen^12,13,14,15 analysiert werden, oder zu Signalverlust^, wenn Proben mit LC-ESI-MS/MS ¹¹ analysiert werden. OCT in kryokonservierten Geweben kann auch Gewebenormalisierungsmethoden wie Wiegen und Proteinquantifizierungsassays wie Bradford und BCA¹¹ beeinträchtigen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, um OCT aus menschlichem Gewebe zu entfernen und anschließend mittels Massenspektrometrie zu analysieren. Das Protokoll kann modifiziert werden, um andere Gewebequellen zu verwenden, die nicht Lungen sind, oder von Mäusegeweben, wie wir zuvor beschrieben haben¹¹. Darüber hinaus können andere Massenspektrometrie-Datennormalisierungsstrategien verwendet werden, einschließlich derer, die wir zuvor¹¹ beschrieben haben, sowie andere validierte Methoden.

Eine wichtige Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass es für die Analyse von Geweben, die zuvor mit Formaldehyd oder einem anderen Fixiermittel fixiert wurden, nicht geeignet ist. Es ist nur für Gewebe geeignet, die nicht fixiert und in OCT kryokonserviert wurden. Darüber hinaus ist diese Methode nicht für die Verarbeitung von Geweben mit einem Gewicht von weniger als 1-2 mg geeignet, da während der sOCTrP-Schritte und -Transfers zwischen den Röhrchen immer ein gewisser Gewebeverlust auftritt. Es wird schwierig sein, solch kleine Gewebe mit einer Standardanalysewaage zu wiegen, und alle übrig gebliebenen PBS, die während der Dochtphase nicht entfernt werden, werden erheblich zum experimentellen Fehler beitragen. Im Folgenden finden Sie weitere wichtige Überlegungen beim Waschen von Taschentüchern, um OCT mit dieser Methode zu entfernen.

Um die reibungslose Durchführung dieses Protokolls zu gewährleisten, insbesondere wenn viele Proben verarbeitet werden, sollten die in Abschnitt 1 beschriebenen Schritte im Voraus durchgeführt werden, einschließlich der Voretikettierung und Vorverwiegung von 1,5-ml-Röhrchen, der Voretikettierung von 13 x 100-mm-Schraubverschlussröhrchen und -kappen, 13 x 100-mm-Kulturröhrchen und Autoinjektor-Fläschchen, der Vorbereitung aller Dochte, der Vorverkürzung von 1-ml-Pipettenspitzen. und vorkühlende Waschlösungen. Dies verhindert, dass zeitaufwändige Verfahren am Tag des Waschens des Gewebes durchgeführt werden müssen, was zu Verzögerungen führen kann. Im Allgemeinen stellen wir fest, dass, wenn viele dieser Schritte am Vortag durchgeführt werden, ein erfahrener Forscher 30-40 Proben an einem normalen Arbeitstag waschen kann. Da der erste vorgeschlagene Haltepunkt jedoch ist, nachdem alle Gewebe gewaschen, gewogen und in Methanol gelegt und bei -80 °C gelagert wurden, wirkt sich das Nicht-Vorwiegen und Etikettieren von 1,5 ml im Voraus auf die Effizienz aus und verlängert die Zeit, die zum Waschen von 30-40 Tüchern erforderlich ist.

Das Wiegen von Geweben ist einer der wichtigsten Schritte, da Fehler oder Unachtsamkeit die Datenqualität beeinträchtigen und sich auf die Datennormalisierung auswirken. Es ist wichtig, dass die für das Wägen verwendete Analysenwaage kalibriert, ordnungsgemäß auf Null gestellt und tariert wird. Dementsprechend ist es bei der Verwendung von Dochten wichtig, so viel Waschlösung wie möglich zu entfernen, insbesondere bei Taschentüchern mit einem Gewicht von weniger als 5 mg. Bei diesen Gewebegewichten macht die übrig gebliebene Waschlösung das Wägen um einen großen Prozentsatz ungenau und überträgt sich als Fehler bei der Datennormalisierung. Beim Entfernen der Waschlösung stellen wir fest, dass Gewebe mehrere Sekunden lang sanft mit dem Docht berührt werden können, um so viel Waschlösung wie möglich zu entfernen, ohne zu signifikanten Gewebeverlusten durch Anhaften am Docht zu führen. Jeder zu waschende Gewebetyp sollte jedoch auf Adhäsion an Dochten getestet werden, und diese Schritte im Protokoll sollten entsprechend angepasst werden.

Um den Workflow des Gewebewaschens zu erleichtern, wird empfohlen, Gewebespäne aus dem Biorepository in 15-ml-Polypropylenröhrchen anzufordern. Dies reduziert die Handhabung von Taschentüchern vor dem Waschen.

Wenn beim Waschen von Taschentüchern nach dem dritten sOCTrP-Zyklus ein gelartiges Material am Boden eines Röhrchens beobachtet wird, ist dies ein Hinweis darauf, dass nicht alle OCT entfernt wurden und weitere sOCTrP-Zyklen erforderlich sind. Verfolgen Sie, wie viele Zyklen benötigt werden, und führen Sie aus Gründen der Konsistenz die gleiche Anzahl von sOCTrP-Zyklen in allen Proben im Datensatz durch. Wir haben zuvor bis zu 9 sOCTrP-Zyklen ausgewertet und keine Wirkung auf den Abbau von Sphingolipiden in Geweben gefunden¹¹.

Wenn Sie Dochte verwenden, um die Waschlösung zu entfernen, wird durch sanftes Tupfen des Gewebes sichergestellt, dass die gesamte Waschlösung entfernt wird. Dies erhöht die Genauigkeit der Gewebegewichtsschätzung. Bei sehr kleinen Geweben ist jedoch große Vorsicht geboten, da diese am Docht haften bleiben und zum Verlust der Probe führen können. Es ist hilfreich, mehrere Dochte für dasselbe Röhrchen zu verwenden, um so viel Lösung wie möglich zu entfernen. Um eine Kontamination durch Kreuzproben zu vermeiden, verwenden Sie immer einen neuen und sauberen Docht für jede Probe. Verwenden Sie bei der Herstellung von Dochten Gewebe in Laborqualität (siehe Materialtabelle), da wir diese zuvor getestet haben und festgestellt haben, dass sie eine vernachlässigbare Menge an kontaminierenden Sphingolipiden^{enthalten 11}. Dochte aus anderen Materialien können verwendet werden, wenn sie wie¹¹ beschrieben getestet werden.

Bei der Entnahme von Proben aus 1,5-ml-Röhrchen nach dem Wiegen ist es wichtig, dass das gesamte Gewebe geborgen wird. Andernfalls führt dies zu Fehlern bei der Datennormalisierung. Wenn mehr PBS benötigt wird, um das gesamte Gewebe zu gewinnen, fügen Sie die äquivalente Menge an PBS zu allen anderen Röhrchen hinzu, um Unterschiede in der Extraktionseffizienz zu vermeiden, die sich aus Proben ergeben könnten, die unterschiedliche Mengen an PBS enthalten. Passen Sie die Chloroform- und Methanolmengen an, um eine Erhöhung des Wasservolumens zu berücksichtigen, um ein Verhältnis von 2:1:0,1 Methanol:Chloroform:Wasser aufrechtzuerhalten.

Beim Auftauen von Proben ist es wichtig, dass dieser Schritt auf Eis durchgeführt wird, um den Abbau von labilen Lipiden wie Sphingosin-1-phosphat zu vermeiden. Das vollständige Auftauen von Proben, bis das OCT in flüssigem Zustand ist, erleichtert auch dessen Entfernung, da es leichter in der kalten Waschlösung gelöst werden kann, anstatt während der frühen Waschschritte als Pellet zu verbleiben.

Gelegentlich, besonders beim Waschen von Lungengewebe, gibt es Fragmente, die nicht pelletieren und nach der Zentrifugation auf der Waschlösung schwimmen. Mit Vorsicht kann das Eintauchen der Ansaugspitze unter das schwimmende Gewebe, um die Waschlösung zu entfernen, den Verlust während der Aspiration verhindern.

Fügen Sie den Proben vor der Homogenisierung kein Chloroform hinzu, da die Einweg-Homogenisatorspitzen aus Kunststoff bestehen und sich in chloroformhaltigen Lösungen auflösen. Dies kann die LC-MS/MS-Quantifizierung von Lipiden in den Proben erheblich beeinflussen. Daher sollte bei der Abgabe von Chloroform und Methanol generell auf die Verwendung von Kunststoffen verzichtet werden, die nicht lösemittelbeständig sind. Diese Lösungsmittel sind ebenfalls giftig und sollten in einem geeigneten Abzug gehandhabt werden. Tragen Sie beim Umgang mit Lösungsmitteln wie Methanol und Chloroform geeignete PSA.

Menschliches Gewebe sollte in einer geeigneten Biosicherheitswerkbank (z. B. Klasse II) verarbeitet werden. Die Anwender sollten im Umgang mit biogefährlichen Stoffen und Flüssigkeiten menschlichen Ursprungs geschult werden und Sicherheitsprotokolle befolgen, wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und die Dekontaminierung von Oberflächen oder Geräten, die mit Proben in Berührung kommen. Die Benutzer sollten alle Oberflächen oder Geräte (Zentrifugen, Zentrifugenträger und -adapter, Pipettierer, Wirbel, Abzugsflächen, Waagen, Glaswaren, Eisbehälter, Computertastaturen, Computermaus usw.), die während des Waschvorgangs verwendet werden, gründlich desinfizieren (siehe Materialtabelle für empfohlene Dekontaminationsmittel). Labormitglieder sollten keine Geräte oder Hauben verwenden, die zum Waschen von Taschentüchern verwendet werden, bis sie gründlich desinfiziert wurden. Vermeiden Sie die Verwendung von Bleichmittel auf Stahloberflächen und Elektronik.

Seien Sie bei der Verarbeitung vieler Proben vorsichtig, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, indem Sie saubere Kappen bei der erneuten Verkapselung während der Lipidextraktionsschritte verwenden. Kappen können auch wiederverwendet werden, wenn sie gekennzeichnet sind. In der Praxis stellen wir jedoch fest, dass Marker auf den schwarzen Kappen schlecht hervorstechen und Klebeetiketten während der nächtlichen Inkubation von 48 °C von den Tuben abfallen.

Sphingolipide sind nachweislich wichtige Akteure in der Ätiologie von Krankheiten und menschlichen Krebserkrankungen. Daher besteht ein großes Interesse daran, die Veränderungen des Sphingolipidstoffwechsels bei diesen Erkrankungen genau zu definieren, da sie therapeutische Ziele offenbaren können. Viele der Gewebe, die für Forscher leicht zugänglich sind, werden jedoch in OCT kryokonserviert, was nicht mit der massenspektrometrischen Analyse kompatibel ist. Daher wird das hier beschriebene detaillierte Protokoll das Repertoire von Geweben erweitern, die für die quantitative sphingolipidomische Analyse geeignet sind, und so dazu beitragen, unser Verständnis der Biologie von Veränderungen des Fettstoffwechsels bei menschlichen Krankheiten und Krebs zu verbessern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL polypropylene pipette tips	NA	NA	Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes	NA	NA
10 mL Erlenmeyer flask	VWR	89091-116	Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2	Sciex	NA	Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate	Fisher Scientific	A11550	For LC mobile phases
Analytical scale	NA	NA	Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser	Sartorius	LH-723071	Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine	Avanti Polar Lipids	LM2212	Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine	Avanti Polar Lipids	LM2511	Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene	Avanti Polar Lipids	LM2512	Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	LM2312	Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L	VWR	EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids	Thermo Scientific	75007309	To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt	Decon Labs	4101	Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven	Shimadzu	NA	For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol	Avanti Polar Lipids	LM2000	Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate	Avanti Polar Lipids	LM2144	Internal standard
DGU20A5R degasser	Shimadzu	NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm	VWR	53283-800	13x100 mm screw top tubes
Heated water bath	NA	NA	For overnight lipid extraction
Homogenizer 150	Fisher Scientific	15-340-167	triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe	Fisher Scientific	15-340-177	for homogenization
Kimwipes	Kimtech	34120	Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L	VWR	EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system	Shimadzu	NA	For LC-MS
Permanent marker	VWR	52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)	VWR	89001-502	13x100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline	Thermo Scientific	10010023	To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette	Eppendorf	4987000118	To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone	VWR	89239-020	Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch	VWR	46610-724	Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector	Shimadzu	NA
SpeedVac	Thermo Scientific	SPD2030P1220	For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column	Sigma Aldrich	581300-U	For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System	Sciex	NA	For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath	Branson	Model 2800	for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer	NA	NA	For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass	VWR	47729572	13x100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS	VWR	BDH83645.400