Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הכנת רקמות אנושיות משובצות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לניתוח ספקטרומטריית מסה

Published: April 27, 2021 doi: 10.3791/62552
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2VCU Lipidomics/Metabolomics Shared Resource, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 3Massey Cancer Center

Summary

ספינגוליפידים הם מטבוליטים ביו-אקטיביים בעלי תפקידים מבוססים היטב במחלות אנושיות. אפיון שינויים ברקמות עם ספקטרומטריית מסה יכול לחשוף תפקידים באטיולוגיה של מחלות או לזהות מטרות טיפוליות. עם זאת, תרכובת ה-OCT המשמשת לשימור בהקפאה בביו-רפוזיטורים מפריעה לספקטרומטריית מסה. אנו מתארים שיטות לניתוח ספינגוליפידים ברקמות אנושיות המוטמעות ב-OCT עם LC-ESI-MS/MS.

Abstract

ספינגוליפידים הם מרכיבים תאיים שיש להם תפקידים מבוססים היטב בחילוף החומרים ובמחלות אנושיות. ניתן להשתמש בספקטרומטריית מסות כדי לקבוע אם ספינגוליפידים משתנים במחלה ולחקור אם ספינגוליפידים יכולים להיות ממוקדים קלינית. עם זאת, מחקרים פרוספקטיביים המופעלים כראוי הרוכשים רקמות ישירות מחדר הניתוח עשויים לגזול זמן רב, ומאתגרים מבחינה טכנית, לוגיסטית ומנהלית. לעומת זאת, מחקרים רטרוספקטיביים יכולים לנצל דגימות אנושיות בהקפאה שכבר זמינות, בדרך כלל במספרים גדולים, בביו-רפוזיטוריות של רקמות. יתרונות נוספים של רכישת רקמות מביו-רפוזיטוריות כוללים גישה למידע הקשור לדגימות הרקמות, כולל היסטולוגיה, פתולוגיה, ובמקרים מסוימים משתנים קליניים-פתולוגיים, שכולם יכולים לשמש לבחינת קורלציות עם נתוני ליפידומיקה. עם זאת, מגבלות טכניות הקשורות לחוסר תאימות של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) המשמשת בהקפאה ובספקטרומטריית מסה היא מחסום טכני לניתוח שומנים. עם זאת, הראינו בעבר כי OCT ניתן להסיר בקלות מדגימות biorepository אנושי באמצעות מחזורים של שטיפות וצנטריפוגות מבלי לשנות את התוכן sphingolipid שלהם. כמו כן, קבענו בעבר כי ספינגוליפידים ברקמות אנושיות המוקפאים ב-OCT יציבים עד 16 שנים. בדו"ח זה, אנו מתארים את השלבים ואת זרימת העבודה לניתוח sphingolipids בדגימות רקמות אנושיות המוטמעות ב- OCT, כולל רקמות שטיפה, שקילת רקמות לנורמליזציה של נתונים, מיצוי שומנים, הכנת דגימות לניתוח על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אלקטרוספריי יינון טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-MS/MS), אינטגרציה של נתוני ספקטרומטריית מסה, נורמליזציה של נתונים וניתוח נתונים.

Introduction

ספינגוליפידים הם מטבוליטים ביו-אקטיביים הידועים בתפקידם בחילוף החומרים האנושי ובמחלות 1,2. הם מווסתים תהליכים תאיים מורכבים כגון נדידת תאים, הישרדות תאים ומוות, תנועת תאים, סחר בשלפוחית, פלישה תאית וגרורות, אנגיוגנזה וייצור ציטוקינים 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . פגמים בוויסות חילוף החומרים של ספינגוליפידים תורמים לייזום והתקדמות של סרטן, קובעים עד כמה סוגי סרטן אגרסיביים, וכיצד סוגי סרטן מגיבים ומפתחים עמידות לטיפול 3,10. לכן, בגלל ההשפעות הרחבות הללו על האטיולוגיה של המחלה, שיטות אנליטיות שיכולות לקבוע במדויק שינויים sphingolipid ספציפיים למחלה הם כלים חשובים. ספקטרומטריית מסות (MS) היא השיטה המדויקת והאמינה ביותר לניתוח שינויים ספינגוליפידים.

דגימות אנושיות שניתן להשתמש בהן לניתוח של שינויים sphingolipid ניתן להשיג באופן פרוספקטיבי מן הסוויטה כירורגית או בדיעבד מן biorepositories רקמות. רקמות טריות מניתוח הן יתרון מכיוון שניתן לנתח אותן ישירות על ידי טרשת נפוצה או שיטות אנליטיות אחרות. עם זאת, רכישת רקמות באופן פרוספקטיבי כוללת מכשולים אדמיניסטרטיביים, טכניים ולוגיסטיים, ואיסוף דגימות מספיקות כדי להגיע לעוצמה סטטיסטית יכול להיות מאתגר. קבלת רקמות מביו-רפוזיטורים היא יתרון מכיוון שניתן לרכוש אותן בדיעבד, במספרים גדולים, וביו-רפוזיטורים מאשרים היסטולוגיה ופתולוגיה, משתמשים בהליכי הפעלה סטנדרטיים כדי לשמר ולאחסן רקמות באופן קריוגני, ויכולים לספק נתונים קליניים-פתולוגיים שיכולים לשמש לניתוחי קורלציה. עם זאת, כדי לשמר תכונות מולקולריות ומבניות, ביו-רפוזיטורים עשויים להקפיא רקמות על ידי הטמעתן בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), אשר הראינו מפריעה למבחני נורמליזציה של נתונים ולכימות של ספינגוליפידים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אלקטרוספריי יינון טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-MS/MS)11 . כמו כן, הוכח כי אלכוהול פוליוויניל ופוליאתילן גליקול, המרכיבים העיקריים בתרכובת OCT, גורמים לדיכוי יונים בפלטפורמות ניתוח אחרות של טרשת נפוצה12,13,14,15. לכן, יש להסיר תרכובת OCT מהרקמות לפני ניתוח ספינגוליפידומי על ידי טרשת נפוצה.

בדו"ח קודם, אימתנו פרוטוקול להסרת תרכובת OCT מדגימות אנושיות לניתוח LC-ESI-MS/MS 11 ואת המתודולוגיה המשמשת לשקילת רקמות לנורמליזציה של נתונים11. כאן, אנו מפרטים את השלבים של פרוטוקול הסרת תרכובת OCT sphingolipidomic (sOCTrP) ומראים נתונים מייצגים מגידולי אדנוקרצינומה של ריאה אנושית ורקמות לא מעורבות סמוכות רגילות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

רקמות ריאה אנושיות שעברו דה-זיהוי התקבלו מליבת האיסוף והניתוח של רקמות ונתונים של אוניברסיטת וירג'יניה (VCU) תחת פרוטוקול מאושר (#HM2471) של ועדת בדיקה פנימית (IRB). השימוש בעכברים למחקר וקציר רקמות עכברים אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של VCU (IACUC).

1. הכנת חומרים

הערה: יש לבצע שלבים אלה יום לפני שטיפת הרקמות.

  1. לתייג מראש ולשקול צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן 1.5 מ"ל עם קודי זיהוי תמציתיים אך ברורים עבור כל דגימה שתעובד למחרת. השתמש בסמן קבוע עמיד מבחינה כימית (ראה טבלת חומרים) שלא ידהה תחת הטיפול החוזר בצינור.
  2. פתח גיליון אלקטרוני ותייג עמודות עוקבות עם כותרות העמודות הבאות: מזהה צינור (ID), שפופרת בלבד, צינור עם רקמה ורקמה כוללת. הזן את מזהי הצינור שיעובדו לעמודה שכותרתה מזהה צינור.
  3. כיול מראש ואפס סולם אנליטי. מניחים בקבוק Erlenmeyer נקי 10 מ"ל במרכז צלחת האיזון (הבקבוקון ישמש כמחזיק צינור). סגרו את דלת תא השקילה וטרפדו את המאזניים עם הבקבוקון.
  4. שוקלים 1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגה. מניחים בזהירות את הצינור בבקבוקון וסוגרים את דלת תא השקילה. אפשרו למשקל להתייצב ורשמו את המשקל בעמודה המסומנת כצינור בלבד.
    הערה: הימנע מהזזת בקבוק Erlenmeyer 10 מ"ל בעת שקילת צינורות. אם הבקבוקון מוזז, מרכזו מחדש את הבקבוקון והגדירו מחדש את האיזון. מניחים את הצינורות הסגורים במדף ומאחסנים עד הצורך.
  5. תווית מראש 13 x 100 מ"מ צינורות זכוכית בורג העליון וכובעים עם קודי המזהה ולמלא אותם עם 2 מ"ל של מתנול כיתה LC-MS. מניחים אותם במדף צינורות, מכסים את הצינורות ומאחסנים אותם במקרר (4 מעלות צלזיוס) עד לשימוש.
    הערה: השתמש במתקן ממס עליון לבקבוקים (ראה טבלת חומרים). אם אחד מהם אינו זמין, השתמש בפיפטות זכוכית כדי למנוע שימוש בפלסטיק בעת חלוקת ממיסים אורגניים.
  6. תווית מראש 13 x 100 מ"מ זכוכית מבחנות. יש לכסות ולאחסן את המבחנות בטמפרטורת החדר.
  7. בקבוקוני autoinjector עם תווית מראש עם קודי זיהוי. כסו ואחסנו את בקבוקוני האוטואינג'קטור בטמפרטורת החדר עד לשימוש.
  8. הכינו פתילות לייבוש רקמות.
    1. התחילו בניקוי מספריים כירורגיים על ידי טבילתם במתנול בדרגה LC-MS למשך 5 דקות, ולאחר מכן נגבו אותם עם רקמה נקייה ברמת מעבדה.
    2. בעזרת כפפות נטולות אבקה, סובבו את קצה הרקמה בדרגה מעבדתית (ראו טבלת חומרים) עד שנוצר פתיל מחודד דק בקוטר 30-40 מ"מ.
    3. בעזרת מספריים מנוקים מתנול, חותכים את הפתיל בקצה העבה. מניחים פתילות בקופסת קרטון נקייה. הכפילו את מספר הפתילות מהנדרש כדי לעבד את כל הדגימות.
  9. הכינו טיפים מקוצרים של 1 מ"ל פיפטה. בעזרת מספריים כירורגיים המנוקים מתנול, חותכים 4-5 מ"מ מקצה קצה פיפטה של 1 מ"ל, ומניחים את הקצה בחזרה במחזיק הקצה. הכינו פי שניים יותר טיפים מדוגמאות לעיבוד.
    הערה: אלה ישמשו לשליפת רקמות שטופות מצינורות. אין לגעת בקצה הקצה.
  10. קדם-צינון ביולוגי מולקולרי כיתה פוספט חצץ מלוחים (PBS) ל 4 °C (0.5 L מספיק). פעולה זו תשמש לאחזור דגימות. עבור כל דגימה שתעובד, לפני צינה (4 מעלות צלזיוס) 60 מ"ל של מים דה-יוניים טהורים במיוחד.
  11. הכן תקנים פנימיים של ספקטרומטריית מסה. ממיסים את השומנים הבאים באתנול:מתנול:מים (7:2:1; v/v/v) בריכוז של 25 ננומול/מ"ל: d17:1-ספינגוזין, (2S,3R,4E)-2-אמינוהפטדק-4-ene-1,3-דיול; d17:1-sphingosine-1-פוספט, heptadecasphing-4-enine-1-פוספט; C12-סרמיד (d18:1/C12:0), N-(דודקנויל)-sphing-4-enine; C12-sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine; C12-גלוקוזילצרמיד (d18:1/C12:0), N-(דודקניל)-1-β-גלוקוזיל-sphing-4-eine; C12-לקטוסילצרמיד (d18:1/C12:0), N-(דודקניל)-1-ß-לקטוזיל-sphing-4-ene.

2. שטיפת רקמות

הערה: השלמת כל השלבים בסעיף 1 יום אחד לפני כן מאפשרת לחוקר מיומן לעבד עד 40 דגימות ביום, ומתחילים ~ 10-15 דגימות ביום. יש להתחיל מוקדם בבוקר ולא להפסיק עד להשלמת כל השלבים בסעיפים 2.1-3.8.

  1. ביום שבו הרקמות יעובדו, הכינו את אזור העבודה של ארון הבטיחות הביולוגית על ידי הצטיידות במערבולת, פיפטור סרולוגי טעון במלואו ומגש קרח. עבור כל השלבים בסעיף זה, יש ללבוש PPE מתאים, כולל מעיל מעבדה, שכבה כפולה של כפפות ומשקפי מגן. אזהרה: יש להתייחס לרקמות ונוזלים אנושיים ולהתייחס אליהם כאל חומרים ביו-האזרדיים.
  2. לפני צינה (4 מעלות צלזיוס) צנטריפוגת דלי מתנדנדת, כל המתאמים הדרושים להחזקת צינורות צנטריפוגה חרוטיים של 15 מ"ל, ומכסי ביו-בידור של צנטריפוגות. Pre-Chill (4 °C) צנטריפוגה בזווית קבועה המסוגלת להכיל צינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  3. אם רקמות אינן מתמקמות בצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל פוליפרופילן, השתמש במרית מנוקה מתנול (נקייה עבור כל דגימת רקמה חדשה) כדי להעביר אותן לצינורות פוליפרופילן מסומנים מראש של 15 מ"ל. תייג גם את הכובעים של 15 מ"ל.
    1. הניחו מתלה צינורות המסוגל להכיל צינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל במגש קרח ומלאו את המגש בקרח. הפשרת רקמות שיעובדו באותו יום על ידי הנחתן במדף על קרח.
      הערה: יש לבקש לפחות 3-4 מ"ג רקמה מהביו-רפוזיטוריה לעיבוד, שכן הוכח בעבר כי פרוטוקולי שטיפת רקמות ושקילה מדויקים ואמינים במשקלים אלה11.
  4. העבירו את מגש הקרח עם הדגימות לארון הבטיחות הביולוגית.
  5. בצע שלושה מחזורי sOCTrP11 כמפורט להלן (כלומר, בצע שלבים 2.5.1-2.5.5 שלוש פעמים).
    1. יש להוסיף 10 מ"ל של מים דה-יוניים קרים כקרח וטהורים במיוחד לכל צינור ולכסות אותם היטב. אפשר לצינורות לדגור במשך 10 דקות.
    2. מערבל במרץ כל צינור במשך 10-20 שניות או עד שכל הרקמה שהופקדה על קירות הצינור, או גלולת רקמה, מתחדשת לחלוטין.
      הערה: במחזורי sOCTrP 2-3, חיוני לבצע החייאה של הכדור כך שכל OCT בגלולה ידלל לתמיסת הכביסה.
    3. מעבירים את הצינורות לצנטריפוגת הדלי המתנדנדת המצוננת מראש (4 מעלות צלזיוס). דגימות צנטריפוגות ב 4,000-5,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: הימנע מייצור וחשיפה לאירוסולים ביו-האזרדיים הנוצרים במהלך הצנטריפוגה על-ידי איטום נושאי הצנטריפוגות באמצעות מכסה ביו-בידור (ראה טבלת חומרים).
    4. שלפו דגימות מהצנטריפוגה והעבירו למגש הקרח. הניחו את המגש בארון בטיחות ביולוגית ופתחו את הצינורות. שמור את הכובעים.
    5. שאפו בזהירות את תמיסת הכביסה. הימנע משאיפת חומר הרקמה בכדור על ידי השארת ~ 0.5 מ"ל של הסופרנטנט בצינור. כסו את הצינורות והימנעו מזיהום צולב על ידי התאמת כובעים מסומנים לצינורות.
      הערה: תמיסת הכביסה (הסופר-נטנט) בשלב 2.5.5 היא חומר ביו-האזרדי; לטפל ולהשליך אותו בהתאם להנחיות בטיחות ביולוגית המתאימות לדגימות ממקור אנושי.

3. שקילת רקמות (לנורמליזציה של נתונים)

  1. לאחר מחזור השטיפה האחרון של sOCTrP, שאפו בזהירות את רוב תמיסת הכביסה אך הימנעו מלהפריע לכדור. השאר ~ 0.5 מ"ל של תמיסת הכביסה בצינור.
  2. באמצעות קצוות פיפטה מקוצרים (מוכן בשלב 1.9), לקחת 500 μL של PBS קר כקרח ולהוסיף אותו לצינור.
    1. באמצעות אותו קצה, בעדינות לתלות את הכדור ולשלוף את כל הרקמות. הימנע pipetting סוער כדי להפחית את אובדן הרקמה על ידי דבקותו בצינורות וקירות קצה פיפטה.
  3. הוסף את הרקמה המחודשת לצינור הצנטריפוגה המקביל שלה המסומן מראש ומשקלו מראש 1.5 מ"ל והנח את הצינור על קרח. חזור על הפעולה עבור כל הרקמות בערכת הנתונים.
  4. מניחים את צינורות 1.5 מ"ל לתוך צנטריפוגה מקוררת מראש ופולטים את הרקמות ב 7,000 x גרם במשך 5-7 דקות ו 4 מעלות צלזיוס.
    1. שלוף צינורות ושאף בזהירות כמה שיותר מה- PBS מבלי להפריע לכדור. החזירו את הצינור לקרח.
  5. צינורות צנטריפוגה למשך 3 דקות נוספות ב 7,000 x גרם כדי להבטיח שהרקמות יהיו גלולות היטב. מעבירים את הצינורות לקרח.
    הערה: שלב הצנטריפוגה הנוסף חשוב למניעת אובדן רקמות בעת הסרת כל תמיסת הכביסה והפתילות. אם אתם מעבדים יותר מחמש דגימות, חזרו על שלב הצנטריפוגה של 3 דקות, 7,000 x גרם לאחר שכל דגימה חמישית מעובדת כדי להבטיח שהרקמות יישארו כדוריות.
  6. בעזרת הפתילות שהוכנו בשלב 1.8, יש להסיר בעדינות את תמיסת הכביסה שנותרה. השתמשו בפתיל נקי לכל דגימה. מקובל לטפוח בעדינות את הרקמה עם הפתילה, מה שיעזור להסיר את רוב תמיסת הכביסה אך ימנע מאובדן רקמות כלשהן על ידי היצמדות לפתילה. סגור את הצינור והנח אותו על קרח.
  7. שקלו כל שפופרת במאזן האנליטי המכויל, המאופס והאפסי שצויר לאחרונה.
    1. מניחים כל צינור בבקבוק הזכוכית של ארלנמאייר וסוגרים את דלת התא. כאשר המשקל התייצב, רשום אותו בעמודת הגיליון האלקטרוני שכותרתה צינור w/tissue.
    2. לאחר השקילה, החזירו את הצינור לקרח.
  8. הוסיפו 300 מיקרון של PBS קר כקרח. באמצעות קצה פיפטה מקוצר (שלב 1.9), יש לאחזר בזהירות את כל הרקמות ולהפקיד בצינור זכוכית עם תווית בורגית מראש (מוכן בשלב 1.5) המכיל 2 מ"ל של מתנול קר כקרח בדרגה LC-MS (הוסף את הרקמה למתנול, לא לצד הצינור).
  9. חשב את כמות הרקמה שנשטפה על ידי חיסור הצינור לבדו מהצינור עם ערך הרקמה. רשום מספר זה בעמודת הרקמות הכוללת. ערך הרקמה הכולל ישמש לנרמול נתוני ספקטרומטריית מסות בשלב 6.12.
  10. אחסן את הדוגמאות בטמפרטורה של -80°C עד שתהיה מוכנה לביצוע שלבים 4.1-4.15.
    הערה: זוהי נקודת עצירה טובה, וניתן לאחסן את הדגימות בבטחה במשך כמה שבועות ב -80 מעלות צלזיוס. לשיטות אחרות לנורמליזציה של רקמות, כגון ריכוז חלבונים או תכולת פוספט שומנים, עיין ב- Rohrbach et al.11.

4. מיצוי שומנים

הערה: חשוב להתחיל בשלבים אלה בבוקר, במיוחד כאשר דגימות רבות יעובדו. לפני שמתחילים, מחממים מראש אמבט מים או אינקובטור ל 48 מעלות צלזיוס.

  1. אחזר את הדגימות שהוכנו בשלב 3.8 ואת תקני השומנים של MS (שהוכנו בשלב 1.11) מהמקפיא. אפשרו להם להתאזן לטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  2. מערבלים וטובלים את התמיסה הסטנדרטית הפנימית באמבט מים על-קולי (ראו טבלת חומרים) למשך 2-3 דקות או עד שתקני השומנים של MS מומסים במלואם לפני החלוקה לדגימות. פעולה זו תמנע שגיאות בנורמליזציה של נתונים.
  3. באמצעות פיפטה חוזרת, יש להוסיף 250 pmol (10 μL מתמיסת 25 nmol/mL שהוכנה בשלב 1.11) של תקני ספקטרומטריית מסה פנימית לכל צינור. כסו מחדש את הצינורות קלות.
  4. כדי להקל על הומוגניזציה, התאם את נפח המתנול ל -2 מ"ל. יש להשתמש רק במתנול בדרגה LC-MS/MS.
  5. עובדים על צינור אחד בכל פעם, להשתמש homogenizer כדי triturate את הרקמה עד לא נראים גושים (בדרך כלל 5-20 שניות). הזיזו את קצה ההומוגנייזר בתנועה מעגלית ולחצו בעדינות על דופן הצינור כדי לסייע לטריטורציה. כסו מחדש את הצינור.
    הערה: הקפדה על כך שכל הרקמות עוברות טריטורציה עדינה תמקסם את מיצוי השומנים. אין להוסיף כלורופורם לדגימות לפני ההומוגניזציה, שכן קצוות ההומוגנייזר החד פעמיים עשויים מפלסטיק שיתמוסס בתמיסות המכילות כלורופורם.
  6. לטבול את הצינור בזווית של 45 מעלות באמבט מים קולי למשך 5-10 שניות.
    1. אם לא נוצרים גושי רקמה עם טבילה באמבטיה הקולית, מכסים אותה ועוברים לצינור הבא.
    2. אם גושי רקמות נוצרים כאשר הצינור שקוע באמבטיה קולית, הומוגניות מחדש, ולמקד את הגושים.
    3. חזור על תהליך זה (הומוגניזציה/טבילה באמבטיה אולטראסונית) באופן איטרטיבי עד לפירוק כל גושי הרקמות הגדולות.
  7. במכסה אדים, יש להוסיף כלורופורם ומתנול בדרגה LC-MS לכל צינור (השתמשו במתקן עליון לבקבוק) כדי להשיג יחס של 2:1:0.1 מתנול:כלורופורם:מים. בעזרת מכסים נקיים, אוטמים את הצינורות היטב ומשאירים על הספסל עד סוף היום.
    1. עבור רקמות במשקל 50 מ"ג או פחות, השתמש בנפח מיצוי כולל של 4 מ"ל, והתאם באמצעות יחס זה (תמיסת מיצוי של 50 מ"ג:4 מ"ל) לדגימות גדולות יותר.
  8. לפני היציאה באותו ערב, הניחו את הצינורות הסגורים היטב באמבט מים או אינקובטור בטמפרטורה של 48 מעלות צלזיוס ודגרו אותם למשך הלילה.
    הערה: חשוב מאוד שהצינורות יהיו סגורים היטב כך שיחסי הממס לא ישתנו עקב אידוי.
  9. למחרת בבוקר, אחזו את הדגימות מאמבט המים בטמפרטורה של 48 מעלות צלזיוס וגלגלו כל פסולת בלתי מסיסה בממס על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 4,000-5,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  10. הוא עובד בתוך מכסה אדים, ומכניס בזהירות את הסופר-נאטנט לתוך מבחנות הזכוכית הבורוסיליקטיות בגודל 13 x 100 מ"מ המסומנות מראש. הטה את הצינור בגודל 13 x 100 מ"מ בזווית של 30-45° כדי להקל על ההדחה.
    הערה: אם מעבדים יותר מ-12 דגימות, אין לאפשר לצינורות הצנטריפוגה לשבת לפרקי זמן ממושכים, שכן הכדורים יתרככו ופסולת בלתי מסיסה תועבר בעת ביצוע שלב 4.10. כדי להימנע מכך, הוציאו רק 12 צינורות מהצנטריפוגה בכל פעם והמשיכו בצנטריפוגה של הצינורות האחרים עד שתהיו מוכנים לנטרל אותם.
  11. העבירו את הצינורות לרכז ואקום המסוגל להכיל צינורות בגודל 13 x 100 מ"מ. מאדים את כל הממס עם שלב חימום ראשוני של שעה אחת (40 מעלות צלזיוס) ופועלים תחת הוואקום המרבי.
  12. הסר שפופרות מרכז הוואקום והוסף 500 μL של מתנול בדרגה LC-MS (השתמש במתקן עליון לבקבוק) לכל שפופרת.
  13. יש להשעות את תמציות השומנים המיובשות על ידי מערבולת במשך 5-10 שניות, ולאחר מכן לטבול צינורות בזווית של 45° באמבט מים על-קולי למשך 2 דקות תוך כדי סיבוב הצינור. מערבל מחדש במשך 5 שניות וטבול באמבט מים קולי למשך דקה נוספת.
    הערה: זהו צעד קריטי כדי להבטיח התאוששות מקסימלית של שומנים שחולצו. אין להתקדם עד שכל החומר המיובש שעל דופן הצינור עבר החייאה.
  14. הניחו את הצינורות בגודל 13 x 100 מ"מ בצנטריפוגה מקוררת מראש (4 מעלות צלזיוס) והסירו כל פסולת בלתי מסיסה על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 4,000-5,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות.
  15. הבהירו בזהירות את הסופרנאטנט המובהר לתוך בקבוקון autoinjector מסומן מראש. הטיית בקבוקון ה-autoinjector בזווית של 30-45° תקל על ההדחה. ודא כי כל התוכן של צינור 13 x 100 מ"מ הם decanted לתוך בקבוקון autoloader.
  16. יש לסגור את הצינורות בחוזקה ולאחסן את הצינורות בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח על ידי LC-ESI-MS/MS.

5. ניתוח LC-ESI-MS/MS

הערה: ההליך הבא משתמש במערכת משאבות בינארית המוצמדת למערכת autoinjector, degaser ו- LC-MS/MS הפועלת במצב משולש-מרובע. טמפרטורת העמודה נשמרה באמצעות תנור עמודים. ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים על הציוד שבו נעשה שימוש.

  1. הכן את השלב הנייד A1 (CH 3OH:H 2O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, עם פורמט אמוניום של 5 mM) ואת השלב הנייד B1 (CH3OH:HCOOH, 99:1, v:v, עם פורמט אמוניום של 5 mM). יש להשתמש רק בממסים, מים וריאגנטים בדרגה LC-MS.
  2. עבור כל קבוצה של דוגמאות, הכינו ארבעה בקבוקוני מטען אוטומטי ריקים המכילים 500 μL של מתנול בדרגה LC-MS.
  3. עבור כל קבוצת דוגמאות, הכינו שני בקבוקוני מטען אוטומטי של תקן פנימי (תווית כ-IS) על ידי דילול 10 μL (250 pmol סה"כ כל תקן) של התמיסה הסטנדרטית הפנימית שהוכנה בשלב 1.11 ב-500 μL של מתנול בדרגה LC-MS.
  4. הגדר את טמפרטורת תנור העמודים ל- 60°C, ואת טמפרטורת מקור היונים ל- 500 °C.
  5. לצורך ניתוח MS/MS, השתמש במצב המשולש-מרובע של הספקטרומטר. הגדר את המרובע הראשון (Q1) כדי להעביר יונים מקדימים, תוך הגדרת המרובע השלישי (Q3) כך שיעבור יוני מכפלה ייחודיים מבחינה מולקולרית (או סריקה על פני מספר m/z ב-Q1 או Q3) תוך שימוש ב-N2 כדי לגרום לדיסוציאציות התנגשות ב-quadrupole 2 (Q2), אשר מוסט מ-Q1 ב-30-120 eV.
  6. הגדר את חלון הזיהוי של זוגות ניטור תגובות מרובות (MRM) ל-120 שניות עם זמן סריקת יעד של 1.0 שניות. עיין בטבלה 1 לקבלת רשימה של זוגות MRM, אנרגיות יינון ואנרגיות התנגשות.
  7. השתמש בפרמטרים הבאים כדי לפתור sphingolipids בשלב LC: באמצעות קצב זרימה של 0.7 מ"ל/דקה, שיווי משקל 2.1 (i.d) x 50 מ"מ C18 עמוד פאזה הפוכה למשך 0.5 דקות עם תערובת ממס של 95% שלב נייד A1 ו 5% שלב נייד B1.
    1. לאחר הזרקת הדגימה, שמרו על יחס פאזה ניידת A1/B1 ב-95/5 למשך 2.25 דקות, ולאחר מכן על שיפוע ליניארי ל-100% B1 במשך 1.5 דקות, ולאחר מכן מוחזק ב-100% B1 למשך 5.5 דקות, ולאחר מכן חזרה הדרגתית של 0.5 דקות ל-95/5 A1/B1.
    2. לאחר הריצה, שיווי משקל מחדש של העמודה עם תערובת של 95/5 A1/B1 למשך 0.5 דקות.
  8. השתמש בהגדרות הבאות עבור המטען האוטומטי לדוגמה: נפח שטיפה, 500 μL; שבץ מחט, 52 מ"מ (זה צריך להיות מותאם בהתאם לגודל בקבוקון ונפח בכל בקבוקון); מהירות שטיפה, 35 μL / s; מהירות דגימה, 5.0 μL/s; זמן טבילה שטיפה, 2 שניות; מצב שטיפה, לפני ואחרי השאיפה; זמן שטיפה,2 שניות.
  9. הנח דוגמאות שהוכנו בשלב 4.15 על מגש טעינה אוטומטית בסדר הבא: ריק; הוא; ריק; דוגמאות שהוכנו בשלב 4.15; ריק, הוא, ריק.
  10. נתח 5-10 μL מכל דגימה על-ידי LC-ESI-MS/MS. נתח את אותו אמצעי אחסון עבור כל הדגימות בערכת הנתונים.

6. עיבוד נתונים, אינטגרציה ונורמליזציה

הערה: למרות שהשלבים הבאים מתארים הליך עבור תוכנה ספציפית (ראה טבלת חומרים), ניתן להשתמש בהליכים דומים במכשירים ובתוכנות מקבילים של LC-MS כדי לשלב זוגות MRM עבור מחלקות השומנים שנותחו והתקנים הפנימיים המתאימים.

  1. פתח את תוכנת הכמות. בכרטיסייה כמותית לחץ פעמיים על אשף הכמות. בחלון המוקפץ, בסביבת העבודה השמאלית ביותר, נווט אל ערכת הנתונים הנכונה ולחץ עליה שמאלה. הדוגמאות הזמינות יוצגו בסביבת העבודה האמצעית.
  2. סמן את הדוגמאות לניתוח ולאחר מכן לחץ על החץ הימני כדי להוסיף דוגמאות לסביבת העבודה ' דוגמאות נבחרות' . לחץ על הבא כדי לנווט אל מסך ההגדרות והשאילתה שבו נעשה שימוש בדרך כלל בהגדרות ברירת המחדל.
  3. מכה הבא כדי לנווט למסך בחירת שיטת האינטגרציה. בחר שיטת אינטגרציה מתאימה המכילה זוגות מעבר MRM לניתוח שומנים. עיין בטבלה 1 עבור זוגות מעבר MRM. הכה סיום.
    הערה: זמני השמירה משתנים בהתאם למכשור ולהגדרות הנפרדות, ולכן יש לאמת אותם עבור כל הגדרה בנפרד.
  4. בסרגל הניווט, לחץ על החלונית סקירת שיא כדי שניתן יהיה לבדוק זוגות MRM. כדי להקל על הסקירה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על החלונית סקירת שיא, שנה את ההגדלה האוטומטית ל- 100% מהשיא הגדול ביותר וחלון שינוי גודל תצוגה של 1.00 - 2.00 דקות.
  5. לחץ לחיצה ימנית על חלון תצוגת הכמות ובחר Analyte ואת sphingolipid הרצוי להיבדק. ודא שאין שיאים בדגימות הריקות ושהשיא הנכון שולב בדגימות IS.
  6. התחל לשלב דוגמאות לא ידועות. עבודה בכיתה ספינגוליפית אחת בכל פעם, בדוק את זמן השמירה עבור זוג MRM של התקן הפנימי (כלומר, C12:0 ceramide) ולוודא שהתוכנה שילבה את השיא הנכון.
  7. המשך אל האנליטים באותה מחלקת שומנים (כלומר, C14:0 סרמיד, C16:0-סרמיד וכו'), החל מהשומנים באורך השרשרת הקצר ביותר בכיתה. ודא עבור כל ליפידים באורך שרשרת ששגרת התוכנה שילבה את שיא זוג ה-MRM הנכון.
  8. כאשר כל האנליטים שולבו, צור גיליון אלקטרוני עבור כל מין sphingolipid שנותח (למשל, סרמידים, sphingomyelins, וכו '). כותרות עמודות תוויות התואמות לסדר האנליטים ואורכי השרשרת בתוכנת הכמות LC-MS/MS. כלול גם כותרת עמודה עבור מזהה לדוגמה ומשקלי נורמליזציה לדוגמה שנקבעו בשלב 3.9.
    הערה: כפי שתואר קודםלכן 11, אמצעי נורמליזציה נפוצים אחרים כוללים תכולת פוספט שומנים כוללת או כמות חלבון.
  9. ייצא או העתק את אזורי השיא עבור כל האנליטים והתקנים הפנימיים לגיליון האלקטרוני האלקטרוני.
  10. נרמל את הנתונים על-ידי חלוקת שטח השיא המשולב של כל מין באורך שרשרת עבור מחלקה Sphingolipid נתונה באזור השיא של התקן הפנימי המקביל לו. לדוגמה, C14:0 סרמיד, C16:0 סרמיד, סרמיד C18:1 וכו', יש לחלק כל אחד מהם ב-C12:0 אזור שיא סטנדרטי פנימי של סרמיד.
  11. המרת שטח השיא לשומות של שומנים שהתאוששו על ידי הכפלת שטח השיא המנורמל (מחושב בשלב 6.10) עם כמות התקן הפנימי, בפיקומולים, שנוספה לדגימה בשלב 4.3. בפרוטוקול זה, כמות זו היא 250 pmol.
  12. כדי לקבל את כמות השומנים היחסית בכל דגימה, חלקו את הפיקומולים של כל אורך שרשרת שומנים במשקל הרקמה שנקבע בשלב 3.9. זה ייתן יחידות של picomoles של שומנים לכל מ"ג של רקמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בפרוטוקול זה אנו מתארים בפירוט שיטה להסרת OCT מרקמות אנושיות שהשתמרו בקריו ושוקלים את הרקמות לניתוח על ידי LC-ESI-MS/MS. החומרים הנדרשים להליך זה מפורטים בטבלת החומרים. מוצגות באיור 1 תוצאות של ניסוי טיפוסי שבו 10 גידולי אדנוקרצינומה של ריאות אנושיות ו-10 רקמות סמוכות נורמליות נשטפו כדי להסיר OCT ונותחו על-ידי LC-ESI-MS/MS. חשוב לציין שכפי שהראינו בעבר11, ישנם מינים שונים של סרמידים באורך שרשרת (איור 1A) ומונוהקסוזיל-סרמידים (איור 1B) שנמצאים בעלייה משמעותית בגידולי אדנוקרצינומה של הריאה בהשוואה לרקמות סמוכות לא מעורבות רגילות.

בניסויי בקרה להערכת ההשפעה של OCT על שלבי מיצוי השומנים המתוארים בסעיף 4, 200 מ"ג של כבד עכברים (C57BL6; זכרים; 14-16 שבועות) הוחזרו ב-2 מ"ל של מלח חצוב פוספט והומוגניות עד לטריטורציה דקה. לאחר מכן, תרחיף הכבד העדין שנוצר לאחר מכן הושמע בהרחבה באמצעות סוניקטור בדיקה (שלושה סיבובים של סוניקציה של דקה אחת על קרח, מנוחה של דקה אחת על קרח, 60% כוח; מיקרוטיפ). מתמיסה זו הוכנו שישה שכפולים הומוגניים של 300 μL בכבד. לשלושה משוכפלים נוספו 200 מ"ג של OCT (הכמות הממוצעת שנמצאה בדגימות ביו-רפוזיטוריות11), ו-200 μL של מים נוספו לשלושת האחרים. לאחר מכן הדגימות עובדו במקביל לאחר השלבים המפורטים בסעיף 4. חשוב לציין שבעקבות צנטריפוגה של תמיסת Bligh-Dry החד-פאזית, דגימות שהכילו OCT היו עכורות ואילו דגימות הבקרה שהכילו מים היו צלולות (איור 2A). העכירות בתמיסת מיצוי השומנים החד-פאזית נמשכה גם לאחר צנטריפוגה מוגברת וסוניקציה נרחבת (לא מוצגת). לאחר שהממס התאדה, לדגימות שהכילו OCT היו כדורים גדולים (איור 2B), שלא ניתן היה לשחזר במתנול אפילו תחת מערבולות נמרצות וסוניקציה נרחבת. דגימות שהכילו OCT הראו גם אובדן גדול של אות עבור תקנים פנימיים של כל המינים שנותחו (איור 3A-G). הראינו בעבר גם שדגימות המכילות OCT הראו אובדן אות עבור רבים מהספינגוליפידים שנותחו11.

בדרך כלל, צפוי שהסטנדרטים של ספינגוליפידים יתחממו ברצף כפי שמוצג באיור 4 בסדר הבא: d17:1 sphingosine, d17:1 sphingosine-1-phosphate, C12:0 לקטוזיל-סרמיד, C12:0 מונוהקסיל-סרמיד, C12:0 ספינגומיאלין, ו- C12:0 סרמיד. עבור כל אחד ממיני הספינגוליפידים הללו, תוך שימוש בהגדרות השיפוע והמכשור המתוארות בסעיף 5 ובעבר11, תהיה תזוזה של כ-0.15 דקות בזמן השמירה עבור כל עלייה של 2-פחמן באורך השרשרת. לדוגמה, כפי שמוצג באיור 5, C14:0-סרמיד (איור 5B) יתחמם בערך +0.15 דקות מאוחר יותר מ-C12:0-סרמיד (איור 5A). קשר כפול בחומצת השומן גורם לעתים קרובות לשינוי של -0.15 בזמן השמירה, כך של-C16:0-סרמיד (איור 5C) יהיה זמן שמירה דומה לזה של C18:1-סרמיד (איור 5D). עם זאת, ליפידים ארוכים יותר באורך שרשרת (כלומר, C24:0, C26:0) עשויים להיות בעלי משמרות זמן שימור גדולות יותר (איור 5I,K, בהתאמה).

Figure 1
איור 1: פרופילי ספינגוליפידים של אדנוקרצינומות ריאה ורקמות ריאה לא מעורבות סמוכות . רקמות אוחסנו באופן קריוגני ב-OCT, הופשרו, עובדו בשלושה מחזורי sOCTrP, נשקלו ונותחו על ידי LC-ESI-MS/MS. הרמות הן ב-pmol לכל מ"ג רקמה. המינים המצוינים באורך שרשרת אציל של סרמיד (A), מונוהקסוזילצרמיד (B), ספינגומילין (C), לקטוסילצרמיד (D) וספינגוזין (E; Sph), ספינגוזין-1-פופשט (F; S1P), דיהידרו-Sph (E) ודיהידרו-S1P (F) כומתו. n = 10 גידולים ו- n = 10 רקמות לא מעורבות סמוכות. עלילות תיבה מציגות חציונים (קו שחור) ושפם של מינימום עד מקסימום, לא משמעותי; עמ≤0.005;, עמ' ≤ 0.0005., אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תמונות מייצגות של דגימות שחולצו עם ובלי OCT. כבדי העכברים עברו הומוגניות וסוניקטציה, וחולקו לשש דגימות זהות: 200 מ"ג של OCT נוספו לשלוש דגימות ומים לשלוש האחרות. (A) לאחר הוספת מתנול וכלורופורם כדי להשיג יחס של 2:1:0.1 מתנול:כלורופורם:מים (v:v:v), דגירה לילית בטמפרטורה של 48 מעלות צלזיוס, ואחריה צנטריפוגה, הסופרנטנטים של דגימות שהכילו OCT היו מעוננים ולא ניתן היה להבהיר אותם על ידי סוניקציה, מערבולת או צנטריפוגה. (B) לאחר אידוי הממס, כדור גדול התאושש מדגימות שהכילו OCT שלא ניתן היה לשחזר באופן מלא ב-0.5 מ"ל של מתנול לאחר סוניקציה ומערבולות נרחבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: כימות LC-ESI-MS/MS של תקני ספינגוליפידים בנוכחות או בהיעדר OCT. כבדי עכברים עברו הומוגניות, סוניזציה והתפצלו לשש דגימות זהות. לשלוש מתוך שש הדגימות נוספו 200 מ"ג של OCT, ואילו לשלוש האחרות נוספו מים. לאחר הוספת תקנים פנימיים, מתנול וכלורופורם, דגימות עובדו באופן זהה ושומנים שחולצו נותחו על ידי LC-ESI-MS/MS. מוצגים זוגות ניטור תגובה מרובים (MRM) של השומנים המצוינים (A-F), ואזורי שיא משולבים מתאימים (G). קיצורים: Sph, sphingosine; S1P, ספינגוזין-1-פוספט. חצים שחורים מצביעים על זוג ה-MRM הנכון עבור הספינגוליפיד שצוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: זמני שמירה יחסיים עבור זוגות ניטור תגובות מרובים של LC-ESI-MS/MS של תקני ספינגוליפידים. כבדי עכברים היו הומוגניים וסוניים; תקנים פנימיים, תוספת מתנול וכלורופורם; ושומנים שחולצו ונותחו על ידי LC-ESI-MS/MS. מוצגים זמני שמירה של זוגות ניטור תגובה מרובים של השומנים המצוינים (A-F). שים לב לסדר היחסי שבו שומנים מתרוממים במהלך שיפוע הכרומטוגרפיה הנוזלית. קיצורים: Sph, sphingosine; S1P, ספינגוזין-1-פוספט; SM, sphingomyelin. ציר ה-X הוא זמן השמירה של זוג MRM בדקות. ציר Y הוא עוצמת האות עבור זוגות MRM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: שינוי תלוי אורך שרשרת אציל בזמן השמירה של זוגות LC-ESI-MS/MS MRM. כבדי עכברים היו הומוגניים וסוניים; תקנים פנימיים, תוספת מתנול וכלורופורם; ושומנים שחולצו ונותחו על ידי LC-ESI-MS/MS. מוצגים זמני שמירה וזוגות MRM של השומנים שצוינו. שים לב לשינוי בזמן השמירה עם הגדלת אורך שרשרת האציל עבור שומנים שונים (A-K), אשר בדרך כלל מתאים לזמן שמירה של +0.15 דקות לכל עלייה של 2 פחמן. קשר כפול יגרום להסטת זמן שמירה של -0.15 דקות (D,H,J). עם זאת, עבור ליפידים בעלי שרשרת ארוכה יותר, העלייה היחסית בזמן השמירה עשויה להיות ארוכה יותר (G-K). ציר ה-X הוא זמן השמירה של זוג MRM בדקות. ציר Y הוא עוצמת האות עבור זוגות MRM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: זוגות MRM, פרמטרי יינון ואנרגיות התנגשות לניתוח LC-ESI-MS/MS. DP, פוטנציאל דה-אשכולות; CE, אנרגיית התנגשות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OCT הוא חומר שימור קריו נפוץ לטווח ארוך המשמש בביו-ריפוזיטורים. עם זאת, OCT יכול לגרום לדיכוי יונים כאשר רקמות מנותחות על ידי פלטפורמות ספקטרומטריית מסהשונות 12,13,14,15, או לגרום לאובדן אות כאשר דגימות מנותחות על ידי LC-ESI-MS/MS 11. OCT ברקמות בהקפאה יכול גם להפריע לשיטות נורמליזציה של רקמות כגון שקילה ומבחני כימות חלבונים כגון ברדפורד ו- BCA11. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט להסרת OCT מרקמות אנושיות ולאחר מכן ינותח על ידי ספקטרומטריית מסות. ניתן לשנות את הפרוטוקול כך שישתמש במקורות רקמה אחרים שאינם ריאה, או מרקמות עכברים כפי שתיארנו קודםלכן 11. בנוסף, ניתן להשתמש באסטרטגיות נורמליזציה אחרות של נתוני ספקטרומטריית מסות, כולל אלה שתיארנו בעבר11, כמו גם שיטות מאומתות אחרות.

מגבלה חשובה של פרוטוקול זה היא כי זה לא מספיק לניתוח של רקמות כי כבר קבוע בעבר עם פורמלדהיד או סוכן תיקון אחר. הוא מתאים רק לרקמות שלא תוקנו והוקפאו ב-OCT. בנוסף, שיטה זו אינה מספקת לעיבוד רקמות השוקלות פחות מ 1-2 מ"ג שכן תמיד יש אובדן רקמות במהלך שלבי sOCTrP והעברות בין צינורות. יהיה קשה לשקול רקמות קטנות כאלה באמצעות סולם אנליטי סטנדרטי, וכל שאריות PBS שלא יוסרו בשלב הפתילה יתרמו רבות לטעות הניסוי. להלן שיקולים חשובים נוספים בעת שטיפת רקמות להסרת OCT בשיטה זו.

כדי להבטיח ביצוע חלק של פרוטוקול זה, במיוחד אם דגימות רבות יעובדו, יש לבצע מראש את השלבים המפורטים בסעיף 1, כולל תיוג מקדים ושקילה מראש של צינורות 1.5 מ"ל, תיוג מראש של 13 x 100 מ"מ צינורות וכובעי ברגים, צינורות תרבית 13 x 100 מ"מ, ובקבוקונים של autoinjector, הכנת כל הפתילות, קיצור מראש של טיפים לפיפטה של 1 מ"ל, ותמיסות שטיפה לפני קירור. זה ימנע הליכים זמן רב צריך להתבצע ביום כי רקמות יהיה שטף, אשר יכול להוביל לעיכובים. באופן כללי, אנו מוצאים שאם רבים מהצעדים הללו מבוצעים יום קודם לכן, חוקר מנוסה יכול לשטוף 30-40 דגימות ביום עבודה רגיל. עם זאת, מכיוון שנקודת העצירה המוצעת הראשונה היא לאחר שכל הרקמות נשטפו, נשקלו והונחו במתנול ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, אי ביצוע שקילה מוקדמת של 1.5 מ"ל וסימון מראש ישפיע על היעילות ויאריך את משך הזמן הנדרש לשטיפת 30-40 רקמות.

שקילת רקמות היא אחד הצעדים החשובים ביותר, שכן טעויות או רשלנות ישפיעו על איכות הנתונים מכיוון שהם יעברו לנורמליזציה של נתונים. זה קריטי שהאיזון האנליטי המשמש לשקילה יהיה מכויל, מאופס כראוי ומעוות. לפיכך, בעת שימוש בפתילות, חשוב להסיר כמה שיותר מתמיסת הכביסה, במיוחד עבור רקמות במשקל של פחות מ-5 מ"ג. במשקלי רקמות אלה, שאריות תמיסת הכביסה יהפכו את השקילה ללא מדויקת באחוזים גדולים ויעבירו כטעות בנורמליזציה של הנתונים. בעת הסרת תמיסת הכביסה, אנו מוצאים כי ניתן לגעת בעדינות ברקמות עם הפתיל למשך מספר שניות כדי להסיר כמה שיותר תמיסת כביסה מבלי להוביל להפסדים משמעותיים של רקמות על ידי הידבקות לפתילה. עם זאת, כל סוג רקמה שנשטף צריך להיבדק להידבקות לפתילות, ושלבים אלה בפרוטוקול מותאמים בהתאם.

כדי להקל על זרימת העבודה של שטיפת הרקמות, מומלץ לבקש שבבי רקמות מהביו-רפוזיטוריה בצינורות פוליפרופילן של 15 מ"ל. זה יקטין את הטיפול ברקמות לפני הכביסה.

בעת שטיפת רקמות, אם חומר דמוי ג'ל נצפה בתחתית הצינור לאחר מחזור sOCTrP השלישי, זה מעיד על כך שלא כל OCT הוסר ויש צורך במחזורי sOCTrP נוספים. עקוב אחר מספר המחזורים הדרושים, וכדי לשמור על עקביות, בצע את אותו מספר מחזורי sOCTrP בכל הדגימות בערכת הנתונים. הערכנו בעבר עד 9 מחזורי sOCTrP ולא מצאנו השפעה על דלדול של ספינגוליפידים ברקמות11.

בעת שימוש בפתילות להסרת תמיסת הכביסה, טפטוף עדין של הרקמה יבטיח שכל תמיסת הכביסה תוסר. זה מגדיל את הדיוק של הערכת משקל הרקמה. עם זאת, יש לנקוט בזהירות רבה עם רקמות קטנות מאוד שכן אלה יכולות להידבק לפתיל ולגרום לאובדן הדגימה. כדאי להשתמש במספר פתילות עבור אותה שפופרת כדי להסיר כמה שיותר פתרון. כדי למנוע זיהום בין דגימות, השתמש תמיד בפתיל חדש ונקי עבור כל דגימה. בעת ייצור פתילות, יש להשתמש ברקמות ברמת מעבדה (ראו טבלת חומרים) כפי שבדקנו אותן בעבר ומצאנו שהן מכילות כמות זניחה של ספינגוליפידים מזהמים11. פתילות מחומרים אחרים ניתן להשתמש אם הם נבדקים כמתואר11.

כאשר שולפים דגימות מצינורות של 1.5 מ"ל לאחר שקילה, חיוני שכל הרקמות יתאוששו. אם לא תעשה זאת, הדבר יגרום לשגיאות בנורמליזציה של נתונים. אם יש צורך בכמות PBS נוספת כדי לשחזר את כל הרקמות, הוסף את הכמות המקבילה של PBS המשמשת לכל הצינורות האחרים כדי למנוע הבדלים ביעילות המיצוי שעלולים לנבוע מדגימות המכילות כמויות שונות של PBS. התאם את נפחי הכלורופורם והמתנול כך שיתחשבו בכל עלייה בנפח המים כדי לשמור על יחס מתנול:כלורופורם:מים של 2:1:0.1.

כאשר מפשירים דגימות, חשוב כי צעד זה ייעשה על הקרח כדי למנוע השפלה של שומנים labile כגון sphingosine-1-פוספט. הפשרה מלאה של דגימות עד שה-OCT נמצא במצב נוזלי תקל גם היא על הסרתו מכיוון שהוא יתמוסס בקלות רבה יותר בתמיסת הכביסה הקרה במקום להישאר ככדור במהלך שלבי הכביסה המוקדמים.

מדי פעם, במיוחד בעת שטיפת רקמות הריאה, יהיו שברים שלא יגלו ויצפו על גבי תמיסת הכביסה לאחר צנטריפוגה. בזהירות, טבילת הקצה השואף מתחת לרקמות הצפות כדי להסיר את תמיסת הכביסה יכולה למנוע אובדן במהלך השאיפה.

אין להוסיף כלורופורם לדגימות לפני ההומוגניזציה, שכן קצוות ההומוגנייזר החד-פעמיים עשויים מפלסטיק ומתמוססים בתמיסות המכילות כלורופורם. זה יכול להשפיע באופן משמעותי על כימות LC-MS/MS של שומנים בדגימות. לכן, באופן כללי, יש להימנע משימוש בפלסטיק שאינו עמיד בפני ממיסים בעת חלוקת כלורופורם ומתנול. ממיסים אלה הם גם רעילים ויש לטפל בהם במכסה אדים מתאים. יש ללבוש PPE מתאים בעת טיפול בממסים כגון מתנול וכלורופורם.

רקמות אנושיות צריכות להיות מעובדות בארון בטיחות ביולוגית מתאים (למשל, Class II). יש להכשיר את המשתמשים בטיפול בחומרים ביולוגיים ובנוזלים ממקור אנושי ולעקוב אחר פרוטוקולי בטיחות כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים ופירוק כל משטח או ציוד שבא במגע עם דגימות. על המשתמשים לחטא ביסודיות (ראה טבלת חומרים לחומרים מוצעים לפירוק) כל משטח או ציוד (צנטריפוגות, מנשאי צנטריפוגות ומתאמים, פיפטורים, מערבולות, משטחי מכסה אדים, מאזנים, כלי זכוכית, מגשי קרח, מקלדות מחשב, עכבר מחשב וכו ') המשמשים במהלך הליך הכביסה. חברי מעבדה אינם צריכים להשתמש בציוד או ברדסים המשמשים לשטיפת רקמות עד שהם עברו חיטוי יסודי. הימנע משימוש באקונומיקה על משטחי פלדה ואלקטרוניקה.

בעת עיבוד דגימות רבות, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע זיהום צולב באמצעות מכסים נקיים בשלבי המכסה מחדש במהלך שלבי מיצוי השומנים. ניתן גם להשתמש מחדש באותיות גדולות אם הן מסומנות. עם זאת, בפועל, אנו מוצאים כי סמנים בולטים בצורה גרועה על כובעים שחורים, ותוויות דבק נופלות מצינורות במהלך הדגירה של 48 מעלות צלזיוס במהלך הלילה 48 מעלות צלזיוס.

ספינגוליפידים הודגמו כשחקנים חשובים באטיולוגיה של מחלות וסרטן אנושי. לכן, יש עניין רב להגדיר במדויק את השינויים בחילוף החומרים sphingolipid במחלות אלה כפי שהם עשויים לחשוף מטרות טיפוליות. עם זאת, רבות מהרקמות הנגישות בקלות לחוקרים נמצאות בהקפאה ב- OCT, שאינו תואם לניתוח ספקטרומטריית מסות. לפיכך, הפרוטוקול המפורט המתואר כאן ירחיב את רפרטואר הרקמות המתאים לניתוח ספינגוליפידומי כמותי, ובכך יסייע להגביר את הבנתנו את הביולוגיה של שינויים בחילוף החומרים של שומנים במחלות אנושיות ובסרטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

השירותים והתמיכה של פרויקט המחקר סופקו על ידי מרכז הסרטן VCU מאסי רקמות ואיסוף וניתוח נתונים הליבה והליבה של VCU Lipidomics and Metabolomics, הנתמכים בחלקם במימון מענק התמיכה של מרכז הסרטן NIH-NCI P30CA016059. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות R21CA232234 (סנטיאגו לימה).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL polypropylene pipette tips NA NA Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes NA NA
10 mL Erlenmeyer flask VWR 89091-116 Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2 Sciex NA Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate Fisher Scientific A11550 For LC mobile phases
Analytical scale NA NA Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser Sartorius LH-723071 Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine Avanti Polar Lipids LM2212 Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine Avanti Polar Lipids LM2511 Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene Avanti Polar Lipids LM2512 Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine Avanti Polar Lipids LM2312 Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L VWR EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids Thermo Scientific 75007309 To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt Decon Labs 4101 Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven Shimadzu NA For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol Avanti Polar Lipids LM2000 Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate Avanti Polar Lipids LM2144 Internal standard
DGU20A5R degasser Shimadzu NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm VWR 53283-800 13x100 mm screw top tubes
Heated water bath NA NA For overnight lipid extraction
Homogenizer 150 Fisher Scientific 15-340-167 triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe Fisher Scientific 15-340-177 for homogenization
Kimwipes Kimtech 34120 Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L VWR EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system Shimadzu NA For LC-MS
Permanent marker VWR 52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) VWR 89001-502 13x100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline Thermo Scientific 10010023 To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette Eppendorf 4987000118 To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone VWR 89239-020 Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch VWR 46610-724 Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector Shimadzu NA
SpeedVac Thermo Scientific SPD2030P1220 For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column Sigma Aldrich 581300-U For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System Sciex NA For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath Branson Model 2800 for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer NA NA For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass VWR 47729572 13x100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS VWR BDH83645.400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
  2. Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
  3. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
  4. Hla, T., Dannenberg, A. J. Sphingolipid signaling in metabolic disorders. Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).
  5. Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
  6. Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
  7. Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
  8. Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
  9. Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
  10. Morad, S. A. F., Cabot, M. C. Advances in Cancer Research. Chalfant, C. E., Fisher, P. B. 140, Academic Press. 235-263 (2018).
  11. Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
  12. Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
  13. Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
  14. Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
  15. Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).

Tags

חקר הסרטן גיליון 170 ליפידומיה ספינגוליפיד ביו-רפוזיטוריה OCT סרטן ריאות אדנוקרצינומה של הריאות סרטן ריאות של תאים לא קטנים גידול תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית LC-ESI-MS/MS ספקטרומטריית מסה
הכנת רקמות אנושיות משובצות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לניתוח ספקטרומטריית מסה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyd, A. E., Allegood, J., Lima, S.… More

Boyd, A. E., Allegood, J., Lima, S. Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (170), e62552, doi:10.3791/62552 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter