Detección de agregación de proteínas mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia

Summary

Aquí introducimos un procedimiento para medir oligomeros proteicos y agregación en lysato celular y células vivas utilizando espectroscopia de correlación de fluorescencia.

Abstract

La agregación de proteínas es un sello distintivo de los trastornos neurodegenerativos como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer (AD), la enfermedad de Parkinson (PD), la enfermedad de Huntington (EH), etc. Para detectar y analizar oligomeros o agregados de proteínas solubles o difusas, se ha utilizado espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), que puede detectar la velocidad de difusión y el brillo de una sola partícula con una sola sensibilidad a moléculas. Sin embargo, el procedimiento adecuado y el know-how para la detección de agregación de proteínas no han sido ampliamente compartidos. Aquí, mostramos un procedimiento estándar de medición del FCS para las propiedades de difusión de proteínas propensas a la agregación en lysato celular y células vivas: fragmento carboxil-terminal de 25 kDa asociado al ELA de ADN TAR/proteína de unión al ARN 43 kDa (TDP25) y desmutasa de superóxido 1 (SOD1). Los resultados representativos muestran que una parte de los agregados de proteína fluorescente verde (GFP) etiquetados TDP25 se incluyó ligeramente en la fracción soluble de neuroblastoma murino Neuro2a lisato celular. Además, el SOD1 etiquetado con GFP que lleva mutación asociada a la ELA muestra una difusión más lenta en las células vivas. En consecuencia, aquí introducimos el procedimiento para detectar la agregación de proteínas a través de su propiedad de difusión utilizando FCS.

Introduction

Se sabe que las agregaciones proteicas que involucran trastornos neurodegenerativos como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, etc.^{en 1,} son tóxicas y perturbarían la homeostasis proteica (proteostasis) en las células y órganos, que luego podrían conducir al envejecimiento^2. Se espera que el aclaramiento de la agregación de proteínas sea una estrategia terapéutica; sin embargo, todavía no se han establecido productos químicos que prevengan la formación de agregación de proteínas y degraden los agregados proteicos (por ejemplo, moléculas pequeñas o fármacos). Además, la forma en que la agregación de proteínas ejerce toxicidad sigue siendo esquiva. Por lo tanto, para promover proyectos de investigación relacionados con la agregación de proteínas, es importante introducir procedimientos de alto rendimiento para simplemente detectar la agregación de proteínas. La detección de agregación de proteínas utilizando anticuerpos que reconocen la conformación de la agregación de proteínas y el tinte fluorescente específico de la agregación se ha utilizado ampliamente³. Sin embargo, es difícil detectar la agregación, especialmente en las células vivas utilizando tales procedimientos clásicos.

La transferencia de energía por resonancia Förster (FRET) es un procedimiento para detectar la agregación de proteínas y los cambios estructurales. Sin embargo, FRET es incapaz de analizar la dinámica proteica (por ejemplo, difusión y oligomerización de proteínas en células vivas)³. Por lo tanto, presentamos aquí un protocolo simple para detectar la agregación de proteínas en solución (por ejemplo, lisato celular) y células vivas utilizando espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), que mide la propiedad de difusión y el brillo de moléculas fluorescentes con sensibilidad de molécula única^4. FCS es un método de conteo de fotones mediante el uso de un microscopio confocal de escaneo láser (LSM). Utilizando un detector de fotones altamente sensible y el cálculo de la función de autocorrelación (ACF) del tiempo de llegada del fotón, se mide el paso a través del tiempo y el brillo de las moléculas fluorescentes en el volumen de detección. La difusión se ralentiza con un aumento del peso molecular; por lo tanto, la interacción intermolecular se puede estimar utilizando FCS. Aún más potente, un aumento en el brillo de la molécula fluorescente indica la homo-oligomerización de las moléculas. Por lo tanto, fcs es una herramienta poderosa para detectar dicha agregación de proteínas.

Protocol

1. Materiales y reactivos

1. Utilice soluciones libres de pirogénicos y medios para el cultivo celular (Tabla 1).
2. Preparar soluciones para el experimento bioquímico utilizando agua ultrapura y utilizar como DNase / RNase libre.
3. Seleccione un FBS adecuado para la referencia cultural de celda con un proceso de comprobación de lote. Puesto que el lote FBS seleccionado cambia regularmente, el catálogo y el número de lote para FBS no se pueden representar aquí.
4. ADN plásmido
   1. Preparar pmeGFP-N1⁵ para la expresión monómera eGFP; pmeGFP-C1-TDP25⁶ para la expresión GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R⁷ para la expresión SOD1-G85R-GFP; y pCAGGS⁸ como portador.
      NOTA: meGFP es una variante monómera portadora de mutación A206K de GFP mejorado (eGFP). TDP25 es un fragmento de terminal C asociado a ELA de TDP-43. SOD1-G85R es un mutante asociado a la ELA de SOD1.
5. Tensión celular
   1. Utilice células de neuroblastoma murino Neuro2a.
      NOTA: Las células neuro2a tienen alta eficiencia de transfección y proteínas exógenas altamente exprés. Para la expresión TDP25, se requieren cepas celulares con eficiencias de alta expresión como células Neuro2a o HEK293. En las células HeLa, TDP25 no fue capaz de expresarse eficientemente.

2. Cultivo celular y transfección

1. Preparar un plato de plástico de 100 mm que cultiva células Neuro2a semiconfluentemente en el medio de crecimiento normal.
   NOTA: Es necesario incubar a 37 °C durante aproximadamente 48-72 horas después de la siembra anterior hasta que se alcance la semiconfluencia.
2. Retire el medio.
3. Añadir 0,5 ml de solución trypsin-EDTA en el plato de cultivo celular e incubarlos a 37 °C durante 1 minuto.
4. Añadir 9,5 ml de medio de crecimiento normal en el plato y suspender las células separadas.
5. Usando Trypan blue para manchar las células muertas, cuente el número de celdas usando un contador de celdas o manualmente. A continuación, diluya las células en medio de cultivo (1,0 × 10⁵/ml).
6. Agregue 2 ml de suspensión celular en un plato de plástico de 35 mm para lisis celular o un plato base de vidrio para la medición de células vivas.
7. Incubar el plato a 37 °C durante 1 día.
8. Comience los siguientes preparativos 15 minutos antes del día de la transfección.
9. Prepare dos tubos de 1,5 ml y agregue 100 μL de Opti-MEM I a cada tubo.
10. En el primer tubo, mezcle 1,0 μg de ADN plásmido (Solución A). En el segundo tubo, mezclar 2,5 μL de Lipofectamina 2000 (Solución B).
    NOTA: Para mantener la eficiencia de transfección, mantenga la cantidad total de ADN igual. Para reducir el nivel de expresión para la medición del FCS en células vivas, la cantidad fraccionada de ADN plásmido para la expresión proteica debe disminuir (por ejemplo, 0,2 μg de pmeGFP-N1-SOD1-G85R y 0,8 μg de mezcla de pCAGGS). Además, mantener la misma relación entre el volumen de lipofectamina 2000 y la cantidad de ADN plásmido.
11. Mezcle suavemente la solución A y B añadiendo una en cualquiera de los tubos y, a continuación, incubarla durante 1 minuto a temperatura ambiente (Solución C).
12. Agregue la solución C al medio de cultivo; e incubar las células durante 24 h a 37 °C.

3. Lisis celular e intercambio medio

1. Compruebe la expresión GFP utilizando un microscopio de rutina.
2. Retire el medio del plato.
3. Añadir 2 ml de PBS a 25 °C para lavar el medio. Retire el PBS.
4. Coloque el plato en una placa de aluminio sobre el hielo triturado.
   NOTA: Utilizamos una placa de aluminio de 1 mm de espesor cortada en una tienda de herramientas dominical o comercialmente disponible como equipo de laboratorio.
5. Añadir 200 μL de tampón de lisis a 4 °C. Agitar el plato suavemente para que el tampón se distribuya uniformemente en la parte inferior del plato.
6. Raspa el plato usando un rascador de células y recupera el lysate con restos celulares sin disuelto en un nuevo tubo de 1,5 ml.
7. Centrífuga la solución a 20.400 x g durante 5 minutos a 4 °C.
8. Recupera el sobrenadante en un nuevo tubo de 1,5 ml y mantenlo a 4 °C o sobre hielo.
   NOTA: No congele el lysate.
9. Para las mediciones de células vivas, reemplace el medio antes de la medición. Compruebe el accesorio de celda utilizando un microscopio de contraste de fase. Confirme la expresión utilizando un microscopio de fluorescencia.

4. Calibración de espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS)

1. Inicie el sistema y ejecute el software de operación. Encienda el argón⁺ láser (458/477/488/514 nm). Estabilice el sistema al menos durante 30 min.
2. Configurar la trayectoria óptica: Divisor de haz principal: HFT488; Espejo dicrónico: NFT600; Filtro de barrera de fluorescencia: un filtro de paso de banda 505-540 (BP505-540); Detector: fotodiodo de avalancha (APD)).
3. Ajuste el tamaño del agujero introduciendo el valor directamente (66 μm; 1 unidad ventilada).
4. Añadir la solución Rhodamine 6G (Rh6G) en un pozo de la cámara de vidrio de la cubierta en el escenario.
5. Añade el agua ultrapura de inmersión sobre el objetivo. No utilice el aceite de inmersión.
6. Ajuste la cámara en el escenario del microscopio. Mueva el escenario a la posición adecuada.
7. Concéntrese en la superficie superior del vidrio midiendo la luz dispersa de la superficie de vidrio. Después de bajar la lente objetivo hacia la parte inferior, gire la perilla de enfoque en el sentido de las agujas del reloj para ajustarse.
   NOTA: Compruebe la dirección de giro de la perilla de enfoque porque es opuesta entre las fabricadas en Japón y Alemania.
8. Levante el punto focal 200 μm por encima de la superficie superior del vidrio para observar el interior de la solución.
9. Haga clic en la velocidad de recuento y supervise la tasa de recuentos de fotones.
10. Aumente gradualmente el valor de los filtros ajustables acousto-ópticos (AOTF) (por ejemplo, transmisión láser de excitación) para que el valor de la velocidad de recuento sea superior a 10 kHz.
11. Haga clic en Ajuste de agujero y abra el asistente de ajuste de agujero. Encuentra la posición del agujero con el mayor número (un pico) de fotones en el eje x e y.
12. Gire el anillo de corrección de la lente objetivo para que el valor de recuentos por molécula (CPM) sea el más alto.
    NOTA: Dado que el espesor del vidrio de la cubierta de la cámara especificada aquí es de 0,12-0,17 mm, el anillo de corrección está alrededor de su mínimo o a pocos giros de él, donde el CPM está en su máximo.
13. Disminuya el valor AOTF gradualmente para que el valor CPM se convierta en 2-3 kHz.
14. Adquiera la función de autocorrelación (ACF) de Rh6G para 90 s.
15. Una vez completada la medición, haga clic en Ajustar para realizar el análisis de ajuste de curvas.
16. Seleccione un modelo para la difusión tridimensional (3D) de un componente con un estado de trillizos.
    NOTA: El Rh6G es monodisperse y difuso de un componente con un estado de trillizos.
17. Ajuste la hora de inicio de la conexión moviendo la línea roja. Haga clic en Ajustar todo y compruebe la desviación de ajuste. Después de realizar el ajuste de curva, asegúrese de que el tiempo de difusión (DT) y el parámetro de estructura (SP) estén aproximadamente en el rango de 20-30 μs y 4-8, respectivamente.
18. Recuerde el valor del parámetro estructural. Utilice el valor sp para el análisis de ajuste de curvas de todas las CA medidas el mismo día, en las mismas condiciones ópticas, y utilizando el mismo tipo de plato base de vidrio o vidrio de cubierta con cámara en el escenario del microscopio.

5. Medición del FCS en el lisato celular

1. Preparar los lysates de celda (ver arriba).
2. Coloque el lysate en la cámara de vidrio de la cubierta. Coloque una tapa para evitar el secado y la tapa del escenario para un sombreado ligero.
3. Establezca la condición de adquisición, la potencia láser, el tiempo de medición y las repeticiones.
4. Haga clic en Contar velocidad y ajuste el valor AOTF del láser para que el valor CPM se convierta en más de 1 kHz.
5. Realice una medición de prueba durante 1 min. Compruebe si el ACF calculado muestra una amplitud positiva y una decaimiento suave.
6. Realice la medición principal durante 5 min.
   NOTA: El tiempo total de medición se incrementa gradualmente hasta que la forma del ACF no cambia incluso si se aumenta el tiempo de medición.
7. Haga clic en Ajustar para realizar el análisis de ajuste de curvas.
8. Seleccione un modelo para difusión 3D de dos componentes con un estado de trillizos. Recuerde introducir el valor del SP y cambiar su configuración a "Fijo" no "Libre" antes de hacer clic en Ajustar todo.
9. Exporte la tabla ajustada como un archivo de texto delimitado por tabulaciones.
10. Si es necesario, exporte el registro de tasa ACF y Count como un archivo de texto delimitado por tabulaciones.

6. Medición del FCS en células vivas

1. Reemplace el medio por uno nuevo antes de la medición.
2. Utilice una incubadora de etapa de calor. Poner el plato de cultivo celular en el escenario del microscopio.
3. Confirme el enfoque y la posición utilizando el micrope confocal. Seleccione la celda de medición. Acerque y ajuste la posición de la celda. Adquiera imágenes de fluorescencia de una célula que expresa GFP utilizando el modo de velocidad de escaneo lento.
4. Seleccione una posición de medición FCS utilizando Posición en la sección "FCS".
5. Seleccione al menos un punto de medición FCS utilizando un punto de mira (Figura 1).
6. Mida el ACF durante 1 min.
   NOTA: Debido a que las proteínas fluorescentes tienden a ser fotoblechadas en células vivas debido al movimiento lento en comparación con la solución, el tiempo de medición debe ser mínimo. Generalmente es difícil obtener ACF en la célula tan suavemente como las mediciones de la solución porque la medición prolongada conducirá a la fotobleaching de proteínas fluorescentes.
7. Haga clic en Ajustar para realizar el análisis de ajuste de curvas utilizando un modelo para difusión 3D de dos componentes con un estado de trillizos.
   NOTA: Para las mediciones de células vivas, un modelo para difusión 3D de dos componentes con un estado de trillizos sería mejor porque es empíricamente difícil disminuir el valor chi-cuadrado con un modelo de difusión 3D de un componente debido a la existencia de varios componentes móviles en la célula viva. Pero incluso utilizando un modelo para la difusión 3D de tres componentes, los componentes de difusión generalmente no están separados en comparación con el uso del modelo para dos componentes.

Results

Realizamos la medición fcs de GFP-TDP25 en lisato celular y SOD1-G85R-GFP en células vivas. En ambos casos, se pudo adquirir una amplitud positiva y AIF suaves. Hemos demostrado que una porción de GFP-TDP25 expresada en células Neuro2a fue recuperada en la fracción soluble bajo la condición indicada⁶. En la fracción soluble del lisato celular, se detectaron moléculas de fluorescencia extremadamente brillantes en el registro de tasa de recuento de fotones utilizando FCS(Figura ...

Discussion

En cuanto a la calibración del sistema antes de las mediciones, se deben utilizar los mismos cristalerías que la utilizada para medir la muestra (por ejemplo, la cámara de vidrio de cubierta de 8 pozos para el lisato celular y la placa base de vidrio de 35 mm para células vivas). Debido a la adsorción de Rh6G en el vidrio, su concentración efectiva a veces puede disminuir. Si es así, se debe utilizar una solución Rh6G altamente concentrada, como 1 μM, solo para el ajuste del agujero. Se deben evitar tasas de recuento de ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% (p/v) Tripsina-1 mmol/L EDTA· Solución de 4Na con rojo de fenol (tripsina-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
Platos de plástico de 100 mm	CORNING	430167
Plato base de vidrio de 35 mm	IWAKI	3910-035	Para la medición de células vivas
Platos de plástico de 35 mm	Thermo Fisher Scientific	150460
Placa de aluminio	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss	Objetivo
células	Sumitomo Baquelita Co., Ltd.	MS-93100
Membrana filtrante de acetato de celulosa (0,22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Cámara de cubierta de vidrio 8 pocillos	IWAKI	5232-008	Para la medición de soluciones
modificado de Dulbecco (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	Medio basal
Suero fetal bovino (FBS)	biosera		Verificación de lote requerida
Lipofectamina 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		Sistema FCS
Neuroblastoma murino Células Neuro2a	ATCC	CCL-131	Línea celular
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	ADN plasmídico para el portador de transfección
Solución de penicilina-estreptomicina (× 100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			ADN plasmídico para TDP25 marcado con eGFP monomérico
pmeGFP-N1			ADN plasmídico para la expresión de monómeros eGFP
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			ADN plásmido para el mutante G85R ligado a ALS de SOD1 marcado con cóctel de
inhibidores de proteasa	Sigma-Aldrich	P8304