Detección de agregación de proteínas mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia

Summary

Aquí introducimos un procedimiento para medir oligomeros proteicos y agregación en lysato celular y células vivas utilizando espectroscopia de correlación de fluorescencia.

Abstract

La agregación de proteínas es un sello distintivo de los trastornos neurodegenerativos como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer (AD), la enfermedad de Parkinson (PD), la enfermedad de Huntington (EH), etc. Para detectar y analizar oligomeros o agregados de proteínas solubles o difusas, se ha utilizado espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), que puede detectar la velocidad de difusión y el brillo de una sola partícula con una sola sensibilidad a moléculas. Sin embargo, el procedimiento adecuado y el know-how para la detección de agregación de proteínas no han sido ampliamente compartidos. Aquí, mostramos un procedimiento estándar de medición del FCS para las propiedades de difusión de proteínas propensas a la agregación en lysato celular y células vivas: fragmento carboxil-terminal de 25 kDa asociado al ELA de ADN TAR/proteína de unión al ARN 43 kDa (TDP25) y desmutasa de superóxido 1 (SOD1). Los resultados representativos muestran que una parte de los agregados de proteína fluorescente verde (GFP) etiquetados TDP25 se incluyó ligeramente en la fracción soluble de neuroblastoma murino Neuro2a lisato celular. Además, el SOD1 etiquetado con GFP que lleva mutación asociada a la ELA muestra una difusión más lenta en las células vivas. En consecuencia, aquí introducimos el procedimiento para detectar la agregación de proteínas a través de su propiedad de difusión utilizando FCS.

Introduction

Se sabe que las agregaciones proteicas que involucran trastornos neurodegenerativos como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, etc.^{en 1,} son tóxicas y perturbarían la homeostasis proteica (proteostasis) en las células y órganos, que luego podrían conducir al envejecimiento^2. Se espera que el aclaramiento de la agregación de proteínas sea una estrategia terapéutica; sin embargo, todavía no se han establecido productos químicos que prevengan la formación de agregación de proteínas y degraden los agregados proteicos (por ejemplo, molécul....

Protocol

1. Materiales y reactivos

1. Utilice soluciones libres de pirogénicos y medios para el cultivo celular (Tabla 1).
2. Preparar soluciones para el experimento bioquímico utilizando agua ultrapura y utilizar como DNase / RNase libre.
3. Seleccione un FBS adecuado para la referencia cultural de celda con un proceso de comprobación de lote. Puesto que el lote FBS seleccionado cambia regularmente, el catálogo y el número de lote para FBS no se pueden representar aquí.
4. ADN plásmido
   1. Preparar pmeGFP-N1⁵ para la expresión monómera eGFP; pmeGFP-C1-TDP25⁶ para la expresión GFP-....

Results

Realizamos la medición fcs de GFP-TDP25 en lisato celular y SOD1-G85R-GFP en células vivas. En ambos casos, se pudo adquirir una amplitud positiva y AIF suaves. Hemos demostrado que una porción de GFP-TDP25 expresada en células Neuro2a fue recuperada en la fracción soluble bajo la condición indicada⁶. En la fracción soluble del lisato celular, se detectaron moléculas de fluorescencia extremadamente brillantes en el registro de tasa de recuento de fotones utilizando FCS(Figura .......

Discussion

En cuanto a la calibración del sistema antes de las mediciones, se deben utilizar los mismos cristalerías que la utilizada para medir la muestra (por ejemplo, la cámara de vidrio de cubierta de 8 pozos para el lisato celular y la placa base de vidrio de 35 mm para células vivas). Debido a la adsorción de Rh6G en el vidrio, su concentración efectiva a veces puede disminuir. Si es así, se debe utilizar una solución Rh6G altamente concentrada, como 1 μM, solo para el ajuste del agujero. Se deben evitar tasas de recuento de .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% (p/v) Tripsina-1 mmol/L EDTA· Solución de 4Na con rojo de fenol (tripsina-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
Platos de plástico de 100 mm	CORNING	430167
Plato base de vidrio de 35 mm	IWAKI	3910-035	Para la medición de células vivas
Platos de plástico de 35 mm	Thermo Fisher Scientific	150460
Placa de aluminio	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss	Objetivo
células	Sumitomo Baquelita Co., Ltd.	MS-93100
Membrana filtrante de acetato de celulosa (0,22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Cámara de cubierta de vidrio 8 pocillos	IWAKI	5232-008	Para la medición de soluciones
modificado de Dulbecco (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	Medio basal
Suero fetal bovino (FBS)	biosera		Verificación de lote requerida
Lipofectamina 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		Sistema FCS
Neuroblastoma murino Células Neuro2a	ATCC	CCL-131	Línea celular
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	ADN plasmídico para el portador de transfección
Solución de penicilina-estreptomicina (× 100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			ADN plasmídico para TDP25 marcado con eGFP monomérico
pmeGFP-N1			ADN plasmídico para la expresión de monómeros eGFP
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			ADN plásmido para el mutante G85R ligado a ALS de SOD1 marcado con cóctel de
inhibidores de proteasa	Sigma-Aldrich	P8304