Summary
Vi introduserer her en prosedyre for å måle protein oligomerer og aggregering i cellelyse og levende celler ved hjelp av fluorescens korrelasjonsspektroskopi.
Abstract
Proteinaggregering er et kjennetegn på nevrodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HS) og så videre. For å oppdage og analysere løselige eller diffuse protein oligomerer eller aggregater, har fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS), som kan oppdage diffusjonshastigheten og lysstyrken til en enkelt partikkel med en enkelt molekylfølsomhet, blitt brukt. Imidlertid har riktig prosedyre og kunnskap for proteinaggregeringsdeteksjon ikke blitt mye delt. Her viser vi en standardprosedyre for FCS-måling for diffusjonsegenskaper av aggregasjonsutsatte proteiner i cellelyse og levende celler: ALS-assosiert 25 kDa karboksylterminalfragment av TAR DNA / RNA-bindende protein 43 kDa (TDP25) og superoksiddismutase 1 (SOD1). De representative resultatene viser at en del av aggregater av grønt fluorescerende protein (GFP)-merket TDP25 var litt inkludert i den oppløselige brøkdelen av murin neuroblastom Neuro2a celle lysat. Videre viser GFP-merket SOD1 med ALS-assosiert mutasjon en langsommere diffusjon i levende celler. Følgelig introduserer vi her prosedyren for å oppdage proteinaggregering via diffusjonsegenskapen ved hjelp av FCS.
Introduction
Proteinaggregasjoner som involverer nevrodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntington sykdom og så videre1 er kjent for å være giftige og vil forstyrre protein homeostase (proteostase) i celler og organer, som deretter kan føre tilaldring 2. Clearance av proteinaggregering forventes som en terapeutisk strategi; Imidlertid er kjemikalier som forhindrer proteinaggregasjonsdannelse og nedbrytningsproteinaggregater (f.eks. små molekyler eller legemidler) ikke fastslått ennå. Videre, hvordan proteinaggregasjon utøver toksisitet forblir unnvikende. Derfor, for å fremme forskningsprosjekter relatert til proteinaggregering, er det viktig å introdusere høy gjennomstrømningsprosedyrer for å bare oppdage proteinaggregering. Proteinaggregeringsdeteksjon ved hjelp av antistoffer som gjenkjenner konformasjonen av proteinaggregasjon og aggregeringsspesifikk fluorescerende fargestoff har blitt mye brukt3. Det er imidlertid vanskelig å oppdage aggregasjonen, spesielt i levende celler ved hjelp av slike klassiske prosedyrer.
Förster resonans energioverføring (FRET) er en prosedyre for å oppdage proteinaggregering og strukturell endring. FRET er imidlertid ikke i stand til å analysere proteindynamikk (f.eks. diffusjon og oligomerisering av protein i levende celler)3. Derfor introduserer vi her en enkel protokoll for å oppdage proteinaggregering i løsning (f.eks. cellelysat) og levende celler ved hjelp av fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS), som måler diffusjonsegenskapen og lysstyrken til fluorescerende molekyler med enkeltmolekylfølsomhet4. FCS er en fotontellingsmetode ved hjelp av et laserskanningskonfokalt mikroskop (LSM). Ved hjelp av en svært følsom fotondetektor og beregning av autokorrelasjonsfunksjon (ACF) av fotonankomsttid måles passeringstiden og lysstyrken til de fluorescerende molekylene i deteksjonsvolumet. Diffusjonen bremser med en økning av molekylvekten; Intermolekylær interaksjon kan derfor estimeres ved hjelp av FCS. Enda kraftigere indikerer en økning i lysstyrken til det fluorescerende molekylet homo-oligomerisering av molekylene. Derfor er FCS et kraftig verktøy for å oppdage slik proteinaggregering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Materialer og reagenser
- Bruk pyrogene frie løsninger og medium for cellekultur (Tabell 1).
- Forbered løsninger for det biokjemiske eksperimentet ved hjelp av ultrarent vann og bruk som DNase / RNase gratis.
- Velg en passende FBS for cellekulturen med mye kontrollprosess. Siden det valgte FBS-partiet endres regelmessig, kan ikke katalogen og partinummeret for FBS representeres her.
- Plasmid DNA
- Forbered pmeGFP-N15 for eGFP monomeruttrykk; pmeGFP-C1-TDP256 for GFP-TDP25-uttrykk; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 for SOD1-G85R-GFP-uttrykk; og pCAGGS8 som bærer.
MERK: meGFP er en monomerisk variant som bærer A206K mutasjon av forbedret GFP (eGFP). TDP25 er et ALS-assosiert C-terminalfragment av TDP-43. SOD1-G85R er en ALS-assosiert mutant av SOD1.
- Forbered pmeGFP-N15 for eGFP monomeruttrykk; pmeGFP-C1-TDP256 for GFP-TDP25-uttrykk; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 for SOD1-G85R-GFP-uttrykk; og pCAGGS8 som bærer.
- Cellestamme
- Bruk murin neuroblastom Neuro2a celler.
MERK: Neuro2a celler har høy transfeksjon effektivitet og svært ekspress eksogene proteiner. For TDP25-uttrykk kreves cellestammer med høy uttrykkseffektivitet som Neuro2a- eller HEK293-celler. I HeLa-celler kunne ikke TDP25 uttrykkes effektivt.
- Bruk murin neuroblastom Neuro2a celler.
2. Cellekultur og transfeksjon
- Forbered en 100 mm plastfat som vokser Neuro2a-celler halvveis i normalt vekstmedium.
MERK: Det er nødvendig å inkubere ved 37 °C i ca. 48-72 timer etter forrige sådd til halvsamtid er nådd. - Fjern mediet.
- Tilsett 0,5 ml trypsin-EDTA-oppløsning i cellekulturretten og inkuber dem ved 37 °C i 1 min.
- Tilsett 9,5 ml normal vekstmedium i parabolen og suspender de frittliggende cellene.
- Bruk Trypan blå til å farge de døde cellene, telle antall celler ved hjelp av en celleteller eller manuelt. Fortynn deretter cellene i kulturmediet (1,0 × 105/ml).
- Tilsett 2 ml celleoppheng i en 35 mm plastfat for cellelys eller en glassbaserett for måling av levende celler.
- Inkuber retten ved 37 °C i 1 dag.
- Start følgende preparater 15 minutter før transfeksjonens dag.
- Forbered to 1,5 ml rør og tilsett 100 μL Opti-MEM I på hvert rør.
- I det første røret blander du 1,0 μg plasmid DNA (løsning A). I det andre røret blander du 2,5 μL lipofektamin 2000 (løsning B).
MERK: For å opprettholde transfeksjonseffektiviteten, hold den totale DNA-mengden den samme. For å redusere uttrykksnivået for FCS-måling i levende celler, bør brøkdelen av plasmid DNA for proteinuttrykk reduseres (f.eks. 0,2 μg pmeGFP-N1-SOD1-G85R og 0,8 μg pCAGGS-blanding). Videre, hold det samme forholdet mellom volumet av Lipofectamine 2000 og mengden plasmid DNA. - Bland løsning A og B forsiktig ved å legge den til i et av rørene, og inkuber den deretter i 1 min ved romtemperatur (løsning C).
- Legg løsning C til kulturmediet. og inkubere cellene i 24 timer ved 37 °C.
3. Cellelys og middels utveksling
- Kontroller GFP-uttrykket ved hjelp av et rutinemessig mikroskop.
- Fjern mediet i parabolen.
- Tilsett 2 ml PBS ved 25 °C for å vaske ut mediet. Fjern PBS.
- Legg fatet på en aluminiumsplate på toppen av den knuste isen.
MERK: Vi bruker en 1 mm tykk aluminiumsplate kuttet i en søndag verktøybutikk eller kommersielt tilgjengelig som laboratorieutstyr. - Tilsett 200 μL lysisbuffer ved 4 °C. Rist parabolen mildt slik at bufferen fordeles jevnt på bunnen av parabolen.
- Skrap parabolen ved hjelp av en celleskraper og gjenopprett lysatet med uløst celleavfall i et nytt 1,5 ml rør.
- Sentrifuger oppløsningen ved 20.400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Gjenopprett supernatanten i et nytt 1,5 ml rør og hold det ved 4 °C eller på is.
MERK: Ikke frys lysatet. - For måling av aktive celler erstatter du mediet før målingen. Kontroller cellevedlegget ved hjelp av et fasekontrastmikroskop. Bekreft uttrykk ved hjelp av et fluorescensmikroskop.
4. Kalibrering av fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS)
- Start systemet og kjør operasjonsprogramvaren. Slå på Argon+ laser (458/477/488/514 nm). Stabiliser systemet minst i 30 minutter.
- Sett opp den optiske banen: Hovedstrålesplitter: HFT488; Dichroic speil: NFT600; Fluorescensbarrierefilter: et båndpassfilter 505-540 (BP505-540); Detektor: skredfotodiode (APD)).
- Still inn pinhole-størrelsen ved å angi verdien direkte (66 μm; 1 luftig enhet).
- Tilsett Rhodamine 6G (Rh6G)-oppløsningen i en brønn av dekselglasskammeret på scenen.
- Tilsett nedsenking ultrapure vann på målet. Ikke bruk nedsenkningsoljen.
- Sett kammeret på mikroskopstadiet. Flytt fasen til riktig posisjon.
- Fokuser på den øvre glassoverflaten ved å måle det spredte lyset fra glassoverflaten. Når du har senket objektivlinsen til bunnen, dreier du fokusknappen med klokken for å justere.
MERK: Kontroller dreieretningen til fokusknappen fordi den er motsatt mellom de som er laget i Japan og Tyskland. - Løft fokuspunktet 200 μm over den øvre glassoverflaten for å observere innsiden av løsningen.
- Klikk på tellefrekvensen og overvåk fotontellingsfrekvensen.
- Øk gradvis den acoustooptiske tunable filters (AOTF)-verdien (f.eks. eksitasjonslaseroverføring) slik at tellehastighetsverdien er mer enn 10 kHz.
- Klikk justeringen av flagghullet, og åpne veiviseren for justering av hull. Finn pinhole-posisjonen med det høyeste (en topp) antall fotoner i både x- og y-aksen.
- Drei korreksjonsringen til objektivlinsen slik at verdien for antall per molekyl (CPM) er den høyeste.
MERK: Siden tykkelsen på dekselglasset på kammeret som er angitt her er 0,12-0,17 mm, er korreksjonsringen på rundt minimum eller bare noen få svinger fra den, der CPM er på sitt maksimale. - Reduser AOTF-verdien gradvis slik at CPM-verdien blir 2-3 kHz.
- Skaff deg autokorrelasjonsfunksjonen (ACF) til Rh6G i 90 s.
- Når målingen er fullført, klikker du Tilpass for å utføre kurvetilpasningsanalyse.
- Velg en modell for tredimensjonal 3D-spredning (én komponent) med trillingtilstand.
MERK: Rh6G er monodisperse og en-komponent diffus med en trilling tilstand. - Still inn starttiden for tilpasningen ved å flytte den røde linjen. Klikk Tilpass til alle, og kontroller avviket for tilpassing. Etter å ha utført kurvetilpasningen, må du sørge for at diffusjonstiden (DT) og strukturparameteren (SP) er omtrent i området 20-30 μs og 4-8.
- Husk den strukturelle parameterverdien. Bruk SP-verdien for kurvetilpasningsanalyse av alle ACFer målt på samme dag, under samme optiske forhold, og bruk samme type glassbasefat eller kammerdekselglasssett på mikroskopstadiet.
5. FCS-måling i cellelysat
- Forbered cellelysene (se ovenfor).
- Plasser lysatet på glasskammeret. Sett et lokk for å unngå tørking og scenelokket for lys skyggelegging.
- Angi anskaffelsestilstand, laserkraft, måletid og repetisjoner.
- Klikk på Tellehastighet og juster AOTF-verdien til laseren slik at CPM-verdien blir mer enn 1 kHz.
- Utfør en prøvemåling i 1 min. Sjekk om den beregnede ACF-en viser en positiv amplitude og glatt forfall.
- Utfør hovedmålingen i 5 min.
MERK: Den totale måletiden økes gradvis til formen på ACF ikke endres selv om måletiden økes. - Klikk Tilpass for å utføre kurvetilpasningsanalyse.
- Velg en modell for to-komponent 3D-spredning med trillingtilstand. Husk å angi SP-verdien og endre innstillingen til "Fast" ikke "Ledig" før du klikker på Tilpass alle.
- Eksporter den monterte tabellen som en tabulatordelt tekstfil.
- Eksporter om nødvendig ACF- og antallsfrekvensposten som en tabulatordelt tekstfil.
6. FCS-måling i levende celler
- Skift ut mediet med et nytt før målingen.
- Bruk en varmetrinn inkubator. Sett cellekulturretten på mikroskopstadiet.
- Bekreft fokus og posisjon ved hjelp av den konfiske mikrope. Merk målecellen. Zoom inn og juster celleplasseringen. Skaff deg fluorescensbilder av en GFP-uttrykkende celle ved hjelp av modus for langsom skannehastighet.
- Velg en FCS-måleposisjon ved hjelp av Posisjon i "FCS"-delen.
- Velg minst ett FCS-målpunkt ved hjelp av et trådkors (figur 1).
- Mål ACF i 1 min.
MERK: Fordi fluorescerende proteiner har en tendens til å bli fotobleached i levende celler på grunn av langsom bevegelse i forhold til løsningen, bør måletiden være minimum. Det er generelt vanskelig å oppnå ACF i cellen så jevnt som løsningsmålinger fordi langvarig måling vil føre til fotobleaching av fluorescerende proteiner. - Klikk Tilpass for å utføre kurvetilpasningsanalyse ved hjelp av en modell for tokomponent 3D-spredning med trillingtilstand.
MERK: For live cellemålinger vil en modell for to-komponent 3D-diffusjon med trillingtilstand være bedre fordi det er empirisk vanskelig å redusere kjikvadratverdien med en 3D-diffusjonsmodell med én komponent på grunn av eksistensen av ulike mobile komponenter i livecellen. Men selv ved hjelp av en modell for tre-komponent 3D-diffusjon, blir diffusjonskomponentene vanligvis ikke skilt sammenlignet med å bruke modellen for to-komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utførte FCS-måling av GFP-TDP25 i cellelys og SOD1-G85R-GFP i levende celler. I begge tilfeller kunne en positiv amplitude og glatte ACFer anskaffes. Vi har vist at en del av GFP-TDP25 uttrykt i Neuro2a-celler ble gjenopprettet i den oppløselige fraksjonen under den angitte tilstanden6. I den oppløselige brøkdelen av cellelyset ble det oppdaget ekstremt lyse fluorescensmolekyler i fotontellingsrekorden ved hjelp av FCS (Figur 2A, topp, pil). Slike "pigger (også kalt burst)" ble ikke observert i GFP monomerer og monodisperse kjemisk fluorescerende fargestoffløsning, noe som tyder på at piggene indikerer oligomeriske proteiner9. Kurvetilpasningsanalyse ved hjelp av en modell forutsatt to-komponent 3D-diffusjon med trillingtilstand viste at de raske diffuserende molekylene (DTFast = 186 μs) var ~ 90% og de resterende 10% var 2,3 ms (Figur 2A, bunn; og Tabell 2).
Under SOD1-G85R-GFP-målingen i levende celler viste fotontellingsfrekvensposten en gradvis reduksjon, noe som tyder på fotobleaching i deteksjonsvolumet (Figur 2B, øverst). Selv om bidraget fra fotobleaching ble vist i et lengre enn 1 s område i ACF, ble det observert en positiv amplitude og glatt forfall av ACF (Figur 2B, bunn). Kurvetilpasningsanalyse ved hjelp av en modell forutsatt to-komponent 3D-diffusjon med trillingtilstand viste at de raske diffuserende molekylene (DTFast = 397 μs) var ~ 93,4% og de resterende 6,6% var 12,3 ms (Tabell 2). ALS-koblet mutasjon, G85R, i SOD1 tillot ikke en dramatisk forskjell i diffusjonsegenskap sammenlignet med vill type. Proteasominhibering reduserte imidlertid diffusjonshastigheten bare i G85R-mutanten til SOD1 i cytoplasma7.
Figur 1: Konfiskert fluorescerende bilde av Neuro2a-celler som uttrykker SOD1-G85R-GFP. Konfekt fluorescerende bilde av Neuro2a celler som uttrykker SOD1-G85R-GFP. Trådkorset indikerer FCS-måleposisjonen i cytoplasma. Bar = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Typiske FCS-resultater og monterte kurver for autokorrelasjonsfunksjonene. (A og B) Topp: Registrert antall foton i FCS-måletidsområdet (grønn linje). Bunn: Beregnede autokorrelasjonsfunksjoner (ACFer; Rå, grå linjer) og monterte ACF-kurver ved hjelp av en modell for tredimensjonal diffusjon med to komponenter med trillingtilstand (Fit, magenta linjer). G(τ) for Y-akse angir amplituden til ACFer på tidspunktet τ sek. for X-aksen. Prikklinjer viser montering av start- og sluttidspunkt. Mørkeblå piler viser piggen med ekstremt lyse proteiner som passerer gjennom deteksjonsvolumet (dvs. løselige oligomerer/aggregater). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn på materiale/utstyr | Komponenter | Kommentarer/beskrivelse |
| 0,1 mM Rhodamin 6G-oppløsning. | ||
| 1 M HEPES-KOH pH 7,5 | ||
| 2 M natriumklorid (nacl) | ||
| Lysis buffer | 50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1× proteasehemmercocktail | Protease inhibitor cocktail bør blandes like før cellelyset. |
| Normalt vekstmedium | DMEM supplert med 10% FBS og 100 U/ml penicillin G og 100 mg/ml Streptomycin | Det bør være nødvendig med partisjekk for FBS. |
| Fosfatbuffer saltvann (PBS) | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4 |
Tabell 1: Løsningssammensetninger
| CPM (kHz) | RaskDT (ms) | Rask komponent (%) | DTSakte (ms) | Langsom komponent (%) | |
| GFP-TDP25 i lysat | 7.9 | 186 | 89.7 | 2.3 | 10.3 |
| SOD1-G85R-GFP i levende celle | 6.3 | 397 | 93.4 | 12.3 | 6.6 |
Tabell 2: Typiske verdier for autokorrelasjonsfunksjonene
Monterte verdier for autokorrelasjonsfunksjonene er representert i figur 2 ved hjelp av en modell for tredimensjonal diffusjon med to komponenter med trillingtilstand. Teller per molekyl (CPM), rask og langsom diffusjonstid (henholdsvis DTFast og DTSlow), og deres komponenter (Fast and Slow component) er representert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når det gjelder systemkalibrering før målinger, bør de samme glassene som den som ble brukt til å måle prøven brukes (f.eks. 8-brønners dekselglasskammeret for cellelys og 35 mm glassbasefat for levende celler). På grunn av adsorpsjonen av Rh6G på glasset, kan den effektive konsentrasjonen noen ganger reduseres. I så fall bør en svært konsentrert Rh6G-løsning som 1 μM brukes bare til pinhole-justeringen. Ekstremt høye fotontellingshastigheter må unngås for å beskytte detektoren (f.eks. mer enn 1000 kHz). Videre er den konsentrerte løsningen ikke egnet for oppkjøp av autokorrelasjonsfunksjon (opprettholde mindre enn 100 kHz). Kalibrering av pinhole posisjon er viktig. Hvis det optiske systemet brukes ofte, er det sjelden for dramatisk dislokasjon av pinhole; Dermed er det ofte ikke noe problem å bruke "Fine" i begynnelsen for å finne riktig posisjon. Hvis det ikke blir funnet noen toppposisjon for tellehastighetene ved hjelp av "Fin", bruker du "Grov" til å flytte hullhullet fra den ene enden av bevegelsesområdet til den andre før posisjonsfunnet ved hjelp av "Fin". Hvis amplituden til ACF-en var flat, må du kontrollere om fokus og posisjon er passende.
Etter Rh6G-målingen og dens montering, hvis DT og/eller SP er utenfor det angitte området, kan du prøve justeringen av hull og korreksjonsring på nytt. Når du fortsatt viser deg utenfor rekkevidde, anbefaler vi at du kontakter produsentens støtte, da det sannsynligvis skyldes mistanke om avhopping av det optiske systemet. Ved hjelp av den målte DT og SP i tillegg til den kjente diffusjonskoeffisienten til Rh6G (414 μm2/s) i vann, kan den effektive stråle midjen beregnes fordi DT er avhengig av bjelke midje10. Videre, ettersom SP er forholdet mellom stråle midje og høyden på det effektive deteksjonsvolumet, kan deteksjonsvolumet beregnes. Volumberegningen er nødvendig for å bestemme absolutt konsentrasjon. Mer beskrivelse av prinsippet og feilsøking under kalibreringen er også tilgjengelig i protokoller som rapportert tidligere11,12,13.
Noen pigger ble observert i FCS-målingen av GFP-TDP25 i cellelysat (figur 2A, topp). Vi viser at slike pigger ble observert i FCS måling av aggregert utsatt huntingtin inkludert utvidet polyglutamin repetisjoner merket med GFP eller gult fluorescerende protein (YFP) (HttQ78 og HttQ143)9; Det antyder dermed løselige oligomerer/aggregater av GFP-TDP25 i den løselige brøkdelen av cellelyset. Men en slik økningspopulasjon var sjelden; Acf og dets kurvetilpasningsresultat kan derfor ikke inneholde et stort bidrag fra slike pigger. En mulig årsak til at bare en liten mengde aggregater blir inkludert i den oppløselige brøkdelen, er sannsynligvis fordi TDP25 er svært aggregeringsutsatt og aggregatene er fraksjonert i den uoppløselige brøkdelen som vist ved hjelp av en fraksjonering av cellelysatet etterfulgt av vestlig blottingsdeteksjon6. Fenomenene i tendensen til å gjenopprette til den uoppløselige brøkdelen av aggregeringsutsatt protein har ofte blitt observert6,9. Slike oppløselige oligomerer/aggregater kan ikke lett oppdages ved hjelp av konvensjonelle biokjemiske metoder som SDS-PAGE etterfulgt av vestlig blotting; dermed har FCS en fordel. Det er imidlertid vanskelig å analysere flere komponenter ved hjelp av konvensjonell FCS fordi den måler den gjennomsnittlige populasjonen. Mer utviklingsprosedyrer kombinert med bayesiansk ikke-parametrisk analyse vil bestemme multikomponentene i utvalget uten antagelser for komponentene14.
Diffusjonstiden i levende celler var relativt langsom sammenlignet med cellelyset. Siden viskositet i cellen er kjent for å være høyere enn i løsninger som PBS og vaskemiddelholdig buffer15, blir diffusjonstiden i levende celler teoretisk 2,5-3 ganger lengre. På grunn av denne langsomme spredningen i levende celler som sammenligner i løsning, kan fotobleaching av fluorescerende koder ofte forårsakes. For å korrigere fotobleaching-effekten på ACFer, er det foreslått noen prosedyrer som eksponentiell forfallsforutsetning16 og støyfiltrering ved hjelp av wavelet-funksjonen17. Selv om slike rettelser antas å være effektive, har det fortsatt ikke vært så enkelt for generelle brukere fordi det krever programmeringsferdigheter. Videre, i levende cellemålinger, bør tilpasningsområdet bestemmes mer nøye slik at kjikvadratverdien til den monterte kurven blir liten. Som vist i figur 2B, ble området der G(τ) var mindre enn 1, utelatt fra tilpasningsområdet. Alternativt er det nødvendig med mer lysstoffrørskoder for å analysere sakte diffuserende / bevegelige molekyler. GFP er enkel å bruke som merkemerke, og stabiliteten er god, men den er ofte fotobleached under FCS-målinger. For å overvinne denne fotostabile egenskapen har HaloTag med tetrametylrhodamin (TMR) som et kjemisk fluorescerende fargestoff vært tilgjengelig18. Ufullstendig merking av fluorescerende ligander (f.eks. TMR-ligand) og fanget fargebassenger er imidlertid problematiske problemer for spesifikk merking av proteiner av interesse19; Dermed vil eksogent uttrykk for protein-av interesse merket med fluorescerende proteiner være førstevalget for fluorescerende merking i levende celler.
Det finnes mange typer fluorescerende proteiner, samt kjemiske fluorescerende fargestoffer; Imidlertid, som vist i denne artikkelen, er monomerisk forbedret GFP (meGFP) en brukervennlig tag for FCS så vel som andre fluorescensmikroskopi fordi dens biokjemiske og fluorescensegenskaper er velkjente. Derfor er meGFP i våre studier førstevalget og brukes vanligvis til å merke aggregasjonsutsatte proteiner for FCS-målinger6,7,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Disse forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
A.K. ble støttet av en Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), av et tilskudd fra Nakatani Foundation for Countermeasures mot nye koronavirusinfeksjoner, ved et stipend fra Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station), og et tilskudd fra Hoansha Foundation. M. K. ble delvis støttet av en JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686), og en JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information physics of living matters" (#20H05522).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
