La capacidad de detectar con precisión los componentes de la unión neuromuscular es crucial en la evaluación de modificaciones en su arquitectura debido a procesos patológicos o de desarrollo. Aquí presentamos una descripción completa de un método sencillo para obtener imágenes de alta calidad de uniones neuromusculares de montaje completo que se pueden utilizar para realizar mediciones cuantitativas.
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Artículo de método
Disección De Fibras Musculares Esqueléticas Individuales Para Análisis Inmunofluorescentes Y Morfométricos De Las Uniones Neuromusculares De Montaje Completo
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En este artículo
Resumen
Resumen
La unión neuromuscular (NMJ) es un punto de contacto especializado entre el nervio motor y el músculo esquelético. Esta sinapsis periférica exhibe alta plasticidad morfológica y funcional. En desordenes numerosos del sistema nervioso, NMJ es una blanco patológica temprana dando por resultado falta de la neurotransmisión, debilidad, atrofia, e incluso en muerte de la fibra de músculo. Debido a su relevancia, la posibilidad de evaluar cuantitativamente ciertos aspectos de la relación entre los componentes nmj puede ayudar a comprender los procesos asociados con su montaje / desmontaje. El primer obstáculo cuando se trabaja con los músculos es obtener la experiencia técnica para identificar y diseccionar rápidamente sin dañar sus fibras. El segundo desafío es utilizar métodos de detección de alta calidad para obtener imágenes NMJ que se pueden utilizar para realizar análisis cuantitativos. Este artículo presenta un protocolo paso a paso para diseccionar los músculos del longus del digitorum del extensor y del sóseo de ratas. También se explica el uso de la inmunofluorescencia para visualizar elementos pre y postsinápticos de NMJ de montaje completo. Los resultados obtenidos demuestran que esta técnica puede utilizarse para establecer la anatomía microscópica de la sinapsis e identificar cambios sutiles en el estado de algunos de sus componentes en condiciones fisiológicas o patológicas.
Introducción
La unión neuromuscular de mamíferos (NMJ) es una gran sinapsis tripartita colinérgica compuesta por la terminación nerviosa de la neurona motora, la membrana postsináptica en la fibra muscular esquelética y las células terminales de Schwann1,2,3. Esta sinapsis exhibe una alta plasticidad morfológica y funcional4,5,6,7,8,incluso durante la edad adulta cuando los NMJ pueden sufrir modificaciones estructurales dinámic....
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Protocolo
Todos los procedimientos animales se realizaron de acuerdo con los lineamientos de la Ley Nacional N° 18611 para el Cuidado de animales utilizados con fines experimentales. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética Institucional (CEUA IIBCE, Protocolo Número 004/09/2015).
1. Disección muscular (Día 1)
NOTA: Antes de comenzar, haga 40 mL de paraformadehído al 0,5% (PFA), pH 7,4 en solución salina de fosfato (DPBS) de Dulbecco. Opcionalmente, haga 20 mL de 4% PFA. Preparar alícuotas de 5 mL y congelar a -20 °C. El día de la disección, descongelar una alícuota al 4% y añadir 35 mL de DPBS para obtener 40 mL de....
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Resultados
Este protocolo ofrece un método sencillo para aislar e inmunotener las fibras musculares de dos tipos diferentes de músculos (músculos de contracción rápida y lenta, ver Figura 1). Utilizando los marcadores y/o sondas correctos, los componentes de NMJ pueden ser detectados y evaluados desde un punto de vista cuantitativo para valorar algunos de los cambios morfológicos que pueden ocurrir como consecuencia de la progresión de la enfermedad o de un tratamiento farmacológico específico. En el p.......
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Discusión
En este artículo, presentamos un protocolo detallado para la disección de dos músculos esqueléticos de la rata (uno lento-contracción y el otro rápido-contracción contracción), aislamiento del músculo de la fibra y detección de la inmunofluorescencia de marcadores pre y postsinápticos para evaluar cuantitativo cambios de NMJ así como procesos del montaje/del desmontaje. Este tipo de protocolo puede ser útil en los modelos de roedores41,42 para evaluar nmj durante.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Muchas gracias al CSIC y al PEDECIBA por el apoyo financiero prestado a este trabajo; a Natalia Rosano por sus correcciones manuscritas; a Marcelo Casacuberta que hace el video y a Nicolás Bolatto por prestar su voz para ello.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio estereoscópico con iluminación de luz fría | Nikon | SMZ-10A | |
| Plataforma mecedora | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cubreobjetos (24 x 32 mm) | Portaobjetos de | D102432 | |
| Premium (Plus) | Pinzas PORLAB | PC-201-16 | |
| F.S.T | 11253-20 | ||
| Unibanda LA-4C Tijeras 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Cuchillas quirúrgicas desechables #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Jeringa estéril desechable (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pluma | E.M.S | 71310 | |
| 100 μ l o 200 μ l | pipeta Finnpipeta 9400130 | ||
| Microscopio confocal | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehído | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glicina | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Anti-Neurofilamento H (NF-H) purificado, Anticuerpo fosforilado | BioLegend | 801601 | Anteriormente Covance # SMI 31P |
| Anti-Neurofilamento H purificado (NF-H), Anticuerpo no fosforilado | BioLegend | 801701 | anteriormente Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxina, biotina-XX conjugado | Invitrogen | B1196 | |
| Estreptavidina, Alexa Fluor 555 conjugado | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminofenilindol (DAPI) | Sigma | D8417 |
Referencias
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neur....
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Reimpresiones y permisos
