Artículo de método

Perfil espacial de la expresión de proteínas y ARN en tejidos: un enfoque para ajustar la microdisección virtual

DOI:

10.3791/62651

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6 de julio de 2022

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1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

En este artículo

Resumen

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Aquí, describimos un protocolo para ajustar las regiones de interés (ROI) para las tecnologías de Spatial Omics para caracterizar mejor el microambiente tumoral e identificar poblaciones celulares específicas. Para los ensayos proteómicos, los protocolos personalizados automatizados pueden guiar la selección del ROI, mientras que los ensayos transcriptómicos se pueden ajustar utilizando ROI tan pequeños como 50 μm.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La multiplexación permite la evaluación de varios marcadores en el mismo tejido al tiempo que proporciona un contexto espacial. Las tecnologías de Spatial Omics permiten la multiplexación de proteínas y ARN mediante el aprovechamiento de anticuerpos y sondas oligomarcados foto-divisorias, respectivamente. Los oligos se escinden y cuantifican a partir de regiones específicas a través del tejido para dilucidar la biología subyacente. Aquí, el estudio demuestra que los protocolos automatizados de visualización de anticuerpos personalizados se pueden utilizar para guiar la selección del ROI junto con los ensayos de proteómica espacial. Este método específico no mostró un rendimiento aceptable con los ensayos de transcriptómica espacial. El protocolo describe el desarrollo de un ensayo inmunofluorescente (IF) 3-plex para la visualización de marcadores en una plataforma automatizada, utilizando amplificación de señal de tiramida (TSA) para amplificar la señal fluorescente de un objetivo de proteína dado y aumentar el grupo de anticuerpos para elegir. El protocolo de visualización se automatizó utilizando un ensayo 3-plex completamente validado para garantizar la calidad y la reproducibilidad. Además, se evaluó el intercambio de DAPI por colorantes SYTO para permitir la obtención de imágenes de ensayos de FI basados en TSA en la plataforma de perfiles espaciales. Además, probamos la capacidad de seleccionar pequeños ROI utilizando el ensayo de transcriptómica espacial para permitir la investigación de áreas de interés altamente específicas (por ejemplo, áreas enriquecidas para un tipo de célula determinado). Se recolectaron ROI de 50 μm y 300 μm de diámetro, lo que corresponde a aproximadamente 15 células y 100 células, respectivamente. Las muestras se hicieron en bibliotecas y se secuenciaron para investigar la capacidad de detectar señales de pequeños ROI y regiones específicas del perfil del tejido. Determinamos que las tecnologías de proteómica espacial se benefician enormemente de los protocolos automatizados y estandarizados para guiar la selección del ROI. Si bien este protocolo de visualización automatizada no era compatible con los ensayos de transcriptómica espacial, pudimos probar y confirmar que poblaciones celulares específicas pueden detectarse con éxito incluso en pequeños ROI con el protocolo de visualización manual estándar.

Introducción

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Los avances en las técnicas de multiplexación continúan proporcionando mejores herramientas de caracterización para los objetivos presentes en los tumores. El microambiente tumoral (EMT) es un sistema complejo de células tumorales, células inmunes infiltrantes y estroma, donde la información espacial es crítica para comprender e interpretar mejor los mecanismos de interacción entre biomarcadores de interés1. Con técnicas emergentes como GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) y 10x Visium, se pueden detectar y cuantificar múltiples objetivos simultáneamente dentro de su contexto espacial. El uso de protocolos de inmunofluorescencia que facilitan la visualización del tejido puede mejorar aún más las capacidades de perfil espacial de estas tecnologías.

La tecnología de Spatial Omics en la que nos centramos para el desarrollo de este método consiste en ensayos de proteómica espacial y transcriptómica donde los oligonucleótidos se unen a anticuerpos o sondas de ARN a través de un enlace fotodivisible sensible a los rayos UV. Los portaobjetos histológicos se etiquetan con estos anticuerpos o sondas oligoconjugados y luego se obtienen imágenes en la plataforma de perfiles espaciales. A continuación, se seleccionan ROI de diferentes tamaños y formas para la iluminación, y los oligonucleótidos fotohendidos se aspiran y se recogen en una placa de 96 pocillos. Los oligonucleótidos fotohendidos están preparados para ser cuantificados con el sistema Nanostring nCounter o Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (Figura 1)4,5.

Las distribuciones celulares varían dentro de los tejidos, y la capacidad de caracterizar ubicaciones específicas de células utilizando marcadores seleccionados y diferentes tamaños de ROI es de gran importancia para comprender completamente el entorno del tejido e identificar características específicas. En la tecnología Spatial Omics mencionada aquí, el protocolo de visualización estándar utiliza anticuerpos directamente conjugados y es un protocolo manual. Los marcadores estándar para distinguir entre tumor y estroma son pancitoqueratina (panCK) y CD456,7, pero se necesitan marcadores adicionales para dirigirse a poblaciones celulares específicas de interés. Además, el uso de anticuerpos fluorescentes directamente conjugados carece de amplificación, lo que limita la selección de anticuerpos a marcadores abundantes. Además, los ensayos manuales están sujetos a una mayor variabilidad que los flujos de trabajo automatizados8. Por lo tanto, es deseable tener un protocolo de visualización personalizable, automatizado y amplificado para la selección del ROI.

Aquí, el estudio demuestra que, para los ensayos de proteómica espacial, la tecnología TSA se puede utilizar para protocolos de visualización en una plataforma automatizada, lo que resulta en un ensayo más específico y estandarizado. Además, los ensayos basados en TSA permiten el uso de marcadores de baja expresión, lo que aumenta el rango de objetivos que se pueden seleccionar para la visualización. Se desarrolló un ensayo 3-plex para panCK, FAP y Antibody X utilizando una plataforma automatizada donde se usaron panCK y FAP para diferenciar entre tumor y estroma, respectivamente. El anticuerpo X es una proteína estromal que se encuentra con frecuencia en los tumores, pero su biología y su impacto en la inmunidad antitumoral no se comprenden completamente. La caracterización de la textura inmune en áreas ricas en anticuerpos X puede dilucidar su papel en la inmunidad antitumoral y la respuesta terapéutica, así como su potencial como diana farmacológica.

Si bien los paneles de visualización TSA automatizados personalizados demostraron ser exitosos para los ensayos de proteómica espacial, no se pudo confirmar la aplicación de estos ensayos para ensayos de transcriptómica espacial. Esto se debe probablemente a los reactivos y al protocolo utilizado para los protocolos de visualización automatizada, que parecen comprometer la integridad del ARN. Reconocer que un protocolo de etiquetado automatizado para marcadores de visualización se puede utilizar para ensayos de proteómica espacial, pero no para ensayos de transcriptómica espacial, proporciona una guía importante sobre los diseños de ensayos de tecnología Spatial Omics.

Además, el estudio demuestra que el ensayo de transcriptómica espacial se puede utilizar para perfilar objetivos en regiones tan pequeñas como 50 μm de diámetro, o aproximadamente 15 células. Se seleccionaron dos ROI de diferentes tamaños para probar la capacidad del ensayo para detectar también transcripciones en ROI pequeños. Para cada región de interés, se recolectaron oligos correspondientes a 1.800 objetivos de ARNm y se convirtieron en bibliotecas de acuerdo con el protocolo de la plataforma de perfiles espaciales. Las bibliotecas se indexaron individualmente, posteriormente se agruparon y secuenciaron. Esto permitió evaluar tanto la eficiencia de la agrupación como la capacidad de identificar poblaciones celulares específicas en pequeños ROI.

Este documento muestra que para los ensayos de proteómica espacial, se puede utilizar un protocolo automatizado para guiar la selección del ROI en marcadores específicos de interés para dirigirse selectivamente a la interrogación de áreas de tejido relevantes y caracterizar el entorno espacial del tejido. Además, demostramos que se pueden usar ROI más pequeños para ensayos transcriptómicos espaciales para detectar y caracterizar poblaciones celulares específicas.

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Protocolo

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Todos los tejidos humanos se adquirieron de biobancos comerciales o bancos de tejidos acreditados bajo la garantía de que se obtuvo la aprobación apropiada de la Junta de Revisión Institucional y el consentimiento informado.

NOTA: El protocolo se realiza utilizando Discovery Ultra y GeoMx Digital Spatial Profiler. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los reactivos, el equipo y el software utilizados en este protocolo.

1. Protocolo de visualización automatizado para ensayos de proteómica espacial

  1. Programa autotinción para aplicar anticuerpos de visualización fluorescente
    1. En el software autostainer, haga clic en el botón de inicio y elija Protocolos. Luego, haga clic en Crear / Editar protocolos y seleccione RUO DISCOVERY Universal como procedimiento.
    2. Haga clic en Primera secuencia > Deparafinización > Depar v2. Para Temperatura media, elija 72 grados C, luego haga clic en Pretratamiento y seleccione Acondicionamiento celular y depósito CC1. Para Temperatura muy alta, elija 100 grados C, luego haga clic en CC1 8 Min y continúe haciendo clic hasta que se seleccione CC1 64 Min .
    3. Haga clic en Inhibidor > Inhibidor DISCOVERY y, para Tiempo de incubación, elija 8 minutos. Luego, haga clic en Incubación de anticuerpos > Ab de alta temperatura; para baja temperatura, elija 37 grados C; en Anticuerpo, elija el número de anticuerpo de la etiqueta del dispensador (Anticuerpo 6 en este ejemplo); en Plus Incubation Time (Tiempo de incubación Plus), seleccione 32 Minutes.
      NOTA: Este protocolo tiene tres números de anticuerpos diferentes. El primer anticuerpo es FAP, el segundo es Pan-citoqueratina y el tercero es el Anticuerpo X.
    4. Haga clic en Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, luego en Antibody Blocking, elija Gt Ig Block, y para Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 4 Minutes. A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap anti-Rb HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 Minutes. Luego, haga clic en Cy5, y para el tiempo de incubación largo, elija 0 Hr 8 Min.
    5. Haga clic en Secuencia dual y elija Desnaturalización de anticuerpos, luego seleccione Desnaturalización de anticuerpos CC2-1, y para Temperatura muy alta, elija 100 grados C. Asegúrese de que el tiempo de incubación sea de 8 min. A continuación, haga clic en DS Inhibitor y seleccione Neutralizar.
    6. Haga clic en DS Antibody, y para Very Low Temperature, elija 37 Deg C. A continuación, en Anticuerpo, elija el número de anticuerpo de la etiqueta del dispensador (Anticuerpo 3 en este ejemplo) y, en Tiempo de incubación Plus, seleccione 32 minutos.
    7. Haga clic en DS Multimer HRP y elija DS Multimer HRP Blocker. Luego, en Antibody Blocking, seleccione Gt Ig Block y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 4 Minutes. A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap anti-Ms HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 Minutes. Luego, haga clic en DS Rhodamine 6G, y para el tiempo de incubación largo, elija 0 Hr 8 Min.
    8. Haga clic en Triple tinción y seleccione Desnaturalización de anticuerpos TS, luego seleccione Desnaturalización de anticuerpos CC2-2, y para Temperatura muy alta, seleccione 100 grados C. Asegúrese de que el tiempo de incubación sea de 8 min. A continuación, haga clic en Inhibidor de TS y seleccione TS Neutralize.
    9. Haga clic en Cuerpo TS y, para Temperatura muy baja, seleccione 37 grados C. A continuación, en Anticuerpo, seleccione el número de anticuerpos de la etiqueta del dispensador (Anticuerpo 7 en este ejemplo) y, en Plus Incubation Time, seleccione 32 Minutes.
    10. Haga clic en TS Multimer HRP y elija TS Multimer HRP Blocker. Luego, en Antibody Blocking, seleccione Gt Ig Block y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 4 Minutes. A continuación, en Multimer HRP Reagent, seleccione OMap anti-Rb HRP y, en Incubation Time (Tiempo de incubación), elija 16 Minutes. Luego, haga clic en TS FAM y, para el tiempo de incubación largo, elija 0 Hr 8 Min.
    11. Agregue un título al protocolo. Seleccione un número de protocolo, agregue un comentario y haga clic en Activo seguido de Guardar.
  2. Preparar diapositivas, imprimir etiquetas e iniciar la ejecución del autostainer
    1. El vendedor de panadería adquirió secciones de tejido humano FFPE (fijadas en formalina, incrustadas en parafina) en un horno a 70 °C durante 20-60 min. Mientras se hornean las diapositivas, imprima etiquetas haciendo clic en Crear etiqueta en el software de tinción automática. A continuación, haga clic en Protocolos, seleccione el número de protocolo y haga clic en Cerrar / Imprimir. Agregue información relevante en la etiqueta de la diapositiva y haga clic en Imprimir.
    2. Retire los portaobjetos del horno y déjelos enfriar a temperatura ambiente (RT). Aplique las etiquetas de protocolo previamente impresas a las diapositivas correspondientes.
    3. Cargue los dispensadores de anticuerpos recargables con anticuerpos de acuerdo con el número de etiqueta de anticuerpos asignado en el paso 1.1. En este protocolo, use el anticuerpo 6 para FAP a 1 μg/ml, use el anticuerpo 3 para la pancitoqueratina a 0,1 μg/ml y el anticuerpo 7 para el anticuerpo X a 2,5 μg/ml. Diluir cada anticuerpo en el diluyente especificado y preparar los dispensadores de anticuerpos recargables.
    4. Reúna los dispensadores de reactivos precargados de bloqueo, detección y amplificación mencionados anteriormente y colóquelos en una bandeja de reactivos. Cargue diapositivas en las bandejas de diapositivas (hasta 30 diapositivas por ejecución) y haga clic en En ejecución seguido de Sí. Tenga en cuenta que DAPI no se utiliza para la contratinción nuclear.
    5. Confirme el inicio de la ejecución comprobando la duración de la ejecución en el software autostainer. El protocolo tarda ~ 11 h en completarse y puede ejecutarse durante la noche.
    6. Al día siguiente, asegúrese de completar la carrera observando las luces verdes intermitentes en las ranuras de la bandeja deslizante. Luego, retire los portaobjetos del instrumento y enjuáguelos vigorosamente en 1x Tampón de reacción hasta que la solución líquida de cubreobjetos se elimine por completo.
  3. Protocolo de plataforma de perfilado espacial para ensayos proteómicos
    1. Siga el protocolo de proteómica espacial indicado en la nota a continuación. Incluya los siguientes cambios en el protocolo para habilitar el procedimiento de etiquetado automatizado 3-plex.
    2. Realice los pasos 1.2.1-1.2.6 el día antes de iniciar el protocolo de proteómica espacial y vaya directamente al paso de recuperación de antígenos del protocolo de proteómica espacial después de realizar el paso 1.2.6. Omita el procedimiento de visualización descrito en el protocolo de proteómica de perfiles espaciales.
    3. Reemplace SYTO 13 con SYTO 64 a 5000 nM para permitir la integración de fluoróforos. Diluir SYTO 64 en 1x TBS e incubar en una cámara de humedad durante 15 min.
    4. Al configurar los parámetros de escaneo en la plataforma de perfilado espacial, seleccione los filtros y los canales de enfoque de acuerdo con los fluoróforos utilizados en el panel de visualización para permitir la integración 3-plex. Use FITC para DISCOVERY FAM y establezca la exposición en 200 ms, use Cy3 para DISCOVERY Rhodamine 6G y establezca la exposición en 200 ms, use Texas Red para SYTO 64 y establezca la exposición en 50 ms (especifique esto como el canal de enfoque) y, finalmente, use Cy5 para DISCOVERY Cy5, establezca la exposición en 200 ms, y guardar cambios.
      NOTA: Las instrucciones detalladas del protocolo de proteómica de perfiles espaciales se encuentran en la pestaña Soporte del sitio web oficial seleccionando Documentación > Manuales de usuario. Aquí, busque el protocolo de proteínas para nCounter usando Bond RX.

2. Selección del ROI para ensayos de transcriptómica espacial

  1. Hornear las secciones de pellets de células FFPE en un horno a 70 °C durante 20-60 min. Siga el protocolo NGS de la plataforma de perfilado espacial indicado en la nota a continuación y escanee diapositivas en la plataforma de perfilado espacial, seleccionando tamaños de 50 μm y 300 μm. Se destaca la siguiente recomendación para el ensayo de transcriptómica espacial:
    1. Al preparar la biblioteca, si se seleccionaron varios tamaños de ROI, agrupe los ROI de tamaños similares para crear una biblioteca por tamaño. Esto es para garantizar que se logren suficientes profundidades de secuenciación para todos los ROI sin sesgo de tamaño.
      NOTA: Las instrucciones detalladas de la plataforma de creación de perfiles espaciales se encuentran en la pestaña Soporte del sitio web oficial seleccionando Documentación > Manuales de usuario. Aquí, busque el protocolo de ARN para aplicaciones NGS que usan Bond RX.

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Resultados

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Protocolo de visualización automatizado para guiar la selección del ROI
En este documento, presentamos el uso de un protocolo IF automatizado y personalizado basado en TSA para visualizar el tejido y seleccionar ROI específicos. El desarrollo del panel de visualización utilizando melanoma y piel humana normal como tejidos de control consistió en pruebas de estabilidad de epítopos, ajuste fino de las intensidades de los marcadores y evaluación de sangrado a través de controles de dejar uno fuera. Para ...

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Discusión

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Hasta la fecha, los anticuerpos fluorescentes directamente conjugados en un protocolo manual se utilizan más comúnmente como paneles de visualización para ensayos de proteómica espacial o transcriptómica espacial 9,10. Sin embargo, el uso de anticuerpos fluorescentes directamente conjugados puede ser un desafío para los marcadores menos abundantes, lo que limita la selección de anticuerpos adecuados. Este protocolo muestra que el etiquetado de marcadores de visua...

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Divulgaciones

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Verónica Ibarra-López, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modriestán y Sandra Rost son empleadas y accionistas de Genentech, miembro del Grupo Roche. Otras empresas que forman parte de Roche producen reactivos e instrumentos utilizados en este manuscrito. Ciara Martin es empleada a tiempo completo de NanoString Technologies Inc, que produce reactivos e instrumentos utilizados en este manuscrito.

Agradecimientos

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Los autores reconocen a Thomas Wu por procesar archivos NGS. Agradecemos a James Ziai por las discusiones de resultados y la revisión del manuscrito y a Meredith Triplet y Rachel Taylor por la revisión interna del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10x solución salina tamponada Tris (TBS)Cell Signaling Technologies12498Sdiluido a 1x TBS en agua tratada con DEPC
Anticuerpo X (no revelado)anticuerpo cegado debido a la confidencialidad
Agua tratada con DEPCThermoFisherAM9922Se puede utilizar otro
Acondicionamiento celular DISCOVERY ( CC1)Ventana950-500
DISCOVERY Cy5 KitVentana760-238Denominado Cy5
DISCOVERY FAM KitVentana760-243Denominado
FAM DISCOVERY Goat Ig BlockVentana760-6008Denominado Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anti-MS HRPVentana760-4310Denominado OMap anti-MS HRP
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRPVentana760-4311Denominado OMap anti-Rb
HRP DISCOVERY Rhodamine 6G KitVentana760-244Denominado Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA Sistema Automatizado de Preparación de PortaobjetosVentana05 987 750 001 / N750-DISU-FSReferido como autotinción en el manuscrito
FAP [EPR20021] AnticuerpoAbcamAb207178
GeoMx Digital Spatial ProfilerNanoStringGMX-DSP-1YDenominado plataforma de perfilado espacial en el manuscrito
Cámara de humedadSimportM920-2Se puede utilizar otro
Anticuerpo Pan-Citoqueratina [AE1/AE3]AbcamAb27988
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
Python PythonAnálisis estadístico
Tampón de reacción (10x)Ventana950-300
Software de análisis estadísticoGraphPadPrism 7Análisis estadístico
SYTO 64ThermoFisherS11346
ULTRA Acondicionamiento celular (ULTRA CC2)Ventana950-223
Ventana Diluyente de anticuerpos con caseínaVentana760-219Referido como diluyente especificado en el manuscrito
Ventana Dispensador primario de anticuerposVentanaEl número de catálogo depende del número de dispensador

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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