Summary
Bu makalede, hESC farklılaşması sırasında Activin A ve CHIR99021'in kesin endoderm (DE) olarak sürekli olarak takviye edilmesiyle insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC' ler) fonksiyonel hepatosit benzeri hücrelere (HLC) farklılaştırılması için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
İnsan embriyonik kök hücrelerinden (HESC) elde edilen hepatotit benzeri hücrelerin (LC' ler) potansiyel işlevleri hastalık modelleme ve ilaç tarama uygulamaları için büyük umut vaat ediyor. Burada, hESC'lerin fonksiyonel HLC'lere farklılaştırılması için verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlanmaktadır. Endoderm soyunun kurulması, HLC'lere farklılaşmada önemli bir adımdır. Yöntemimizle, hESC farklılaşması sırasında Activin A ve CHIR99021'i sürekli olarak kesin endoderm (DE) olarak destekleyerek, ardından hepatik progenitör hücrelerin üretilmesini ve son olarak tipik hepatosit morfolojisine sahip HLC'leri tamamen tanımlanmış reaktiflerle evre yönünde bir yöntemle düzenleyerek anahtar sinyal yollarını düzenliyoruz. Bu yöntemle üretilen hESC türevi HBC'ler sahne alanına özgü belirteçleri (albümin dahil, HNF4α nükleer reseptör ve sodyum taurokolat kotransporting polipeptid (NTCP)) ve olgun ve fonksiyonel hepatositlerle ilgili özel özellikler gösterir (indocyanine yeşil lekelenme, glikojen depolama, hematoksilin-eozin boyama ve CYP3 aktivitesi dahil) ve karaciğer hastalıkları çalışmasında HLC tabanlı uygulamaların geliştirilmesi için bir platform sağlayabilir.
Introduction
Karaciğer, deoksidasyon, glikojen depolama ve proteinlerin salgılanması ve sentezi dahil olmak üzere çeşitli roller oynayan son derece metabolik bir organdır1. Çeşitli patojenler, ilaçlar ve heredite karaciğerde patolojik değişikliklere neden olabilir ve işlevlerini etkileyebilir2,3. Karaciğerin ana fonksiyonel birimi olarak hepatositler, yapay karaciğer destek sistemlerinde ve ilaç toksisitesinin ortadan kaldırılmasında önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, primer insan hepatatositlerinin kaynağı hücre bazlı tedavide ve karaciğer hastalığı araştırmalarında sınırlıdır. Bu nedenle, fonksiyonel insan hepatatlarının yeni kaynaklarının geliştirilmesi, rejeneratif tıp alanında önemli bir araştırma yönüdür. HESC'lerin kurulduğu 1998 yılından bu yana4, hESC'ler üstün farklılaşma potansiyelleri (uygun bir ortamda çeşitli dokulara farklılaşabilirler) ve yüksek derecede kendini yenileyebilmeleri nedeniyle araştırmacılar tarafından yaygın olarak kabul edilmiştir ve böylece biyoartificial karaciğerler, hepatosit transplantasyonu ve hatta karaciğer doku mühendisliği için ideal kaynak hücreler sağlar5.
Şu anda, hepatik farklılaşma verimliliği büyük ölçüde artırılabilir endoderm6. Kök hücrelerin endoderm haline gelen soy farklılaşmasında, dönüşen büyüme faktörü β (TGF-β) sinyalizasyon seviyeleri ve WNT sinyal yolları endoderm oluşum aşamasının düğümündeki temel faktörlerdir. TGF-β ve WNT sinyalizasyonunun üst düzey aktivasyonu endoderm7,8gelişimini teşvik edebilir. Activin A, TGF-β'a ait bir sitokindir. Bu nedenle, Activin A yaygın insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin endoderm indüksiyonunda kullanılır (hiPSC' ler) ve hESC9,10. GSK3 serine-threonine protein kinazdır. Araştırmacılar, GSK3β'nin belirli bir inhibitörü olan CHIR99021'in tipik WNT sinyallerini uyarabileceğini ve belirli koşullar altında kök hücre farklılaşmasını teşvik edebildiğine ulaşarak, CHIR99021'in kök hücre farklılaşmasına endoderm 11 , 12,13'e indükleme potansiyeline sahip olduğunu öne sürmektedir.
Burada, HESC'lerin fonksiyonel HLC'lere farklılaştırılmasını etkili bir şekilde teşvik etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem rapor ediyoruz. Activin A ve CHIR99021'in sıralı ilavesi yaklaşık% 89.7±0.8 SOX17 (DE belirteci) pozitif hücreler üretti. Daha fazla olgunlaştıktan sonra in vitro, bu hücreler hepatik spesifik belirteçleri ifade etti ve hepatosit benzeri morfoloji (hematoksilin-eozin boyama (H & E) ve indocyanine yeşili (ICG), glikojen depolama ve CYP3 aktivitesi gibi işlevler uyguladı. Sonuçlar, hESK'lerin bu yöntemle olgun fonksiyonel HLC'lere başarılı bir şekilde farklılaştırılabileceğini ve karaciğer hastalığına bağlı araştırmalara ve in vitro ilaç taramasına zemin hazırladığını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kök hücre bakımı
NOT: Aşağıda açıklanan hücre bakım protokolü, bir yapışan monolayerde tutulan hES03 hücre hattı için geçerlidir. Bu yazıda yer alan aşağıdaki tüm protokoller için hücreler biyolojik bir güvenlik kabini altında ele alınmalıdır.
- 5x ek ortamı mTesR temel ortamına seyrelterek 1x mTesR kök hücre kültürü ortamı hazırlayın.
- 5 mL hESC nitelikli Matrigel'i buz üzerinde 5 mL DMEM/F12 ile seyrelterek 30x hESC nitelikli Matrigel ortamı hazırlayın. -20 °C'de saklayın.
- 33,3 μL 30x hESC nitelikli Matrigel'i 1 mL DMEM/F12 ile seyrelterek 1x hESC nitelikli Matrigel ortamı hazırlayın.
- Steril 6 kuyuyu kaplayın, doku kültürüyle işlenmiş plakalar 1 mL 1x hESC nitelikli Matrigel her kuyuda önceden ve bir gecede 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığında (RT) en az 30 dakika bekletin.
- Kriyoprezite edilmiş hESC'leri 37 °C'lik su banyosunda titremeden 3 dakika boyunca çözün. Ardından, 4 mL önceden ısıtılmış 37 °C mTesR ortam içeren 15 mL santrifüj tüpüne pipetle girerek hücreleri hemen aktarın, 2 kez hafifçe yukarı ve aşağı borulayın.
- HESC'leri RT'de 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin.
- Süpernatantı aspire edin ve hücreleri 1 mL mTesR ortamda hafifçe yeniden biriktirin.
- DMEM/F12 ortamını plakadan emiş edin ve hücreleri 2 mL mTesR'de 1 x 10 5 hücre yoğunluğunda6 kuyulu bir tabağa tohumlayın.
- %5 CO2 inkübatörde kuluçkaya yatırın ve günlük önceden ısıtılmış mTesR ortamı ile değiştirerek hücreleri koruyun. Hücreleri kabaca% 70-80 birleştiğinde veya hücre kolonileri temas etmeye başladığında geçiş yapın.
2. Kök hücre geçişi ve farklılaşma
- Hücreleri geçirmek için, ortamı emiş edin ve hücreleri enzim çözeltisi kuyusu başına 1 mL ile kuluçkaya yatırın (örneğin, 37 °C'de 5 dakika accutase. Daha sonra hücreleri önceden 37 °C'ye önceden ısıtılmış 4 mL DMEM/F12 içeren 15 mL santrifüj tüpüne pipetleme ile aktarın.
- Hücreleri RT'de 200 x g'da 2 dakika santrifüj edin.
- Ortamı aspire edin ve hücre peletini 1 mL mTesR ortamda hafifçe yeniden ıslatın.
- Önceden 250 μL 1x hESC nitelikli Matrigel medyumla kaplayarak 24 kuyu plakaları hazırlayın. Yukarıda açıklandığı gibi, 500 μL mTesR ortamında kuyu başına 1 -1,5 x 10 5 hücre yoğunluğunda tohum hESC'leri.
- Co 2 inkübatörde hücrelerin 37 °C'de24 saat kuluçkaya yatmasına izin verin.
3. DE oluşumu
- DMSO ile %0,2 BSA ve 3 mM CHIR99021 içeren DPBS ile 100 μg/mL Activin A stok çözümleri hazırlayın.
- RPMI ortamını 1x B27 ile destekleyerek Aşama I farklılaşma temel ortamını hazırlayın.
- Activin A'yı 100 ng/mL ve CHIR99021'lik son konsantrasyona, önceden ısıtılmış Aşama I farklılaşma temel ortamının uygun hacminde 3 μM'lik son konsantrasyona ekleyin.
- mTesR ortamını hücrelerden epire edin ve ilave farklılaşma faktörleri (örneğin, 24 kuyu plakasının kuyusu başına 0,5 mL) içeren Aşama I farklılaştırma ortamıyla değiştirin.
- Hücrelerin CO 2 inkübatörde 37 °C'de3 gün kuluçkaya yatmasına izin verin ve aşama I medyasını günlük olarak yeni eklenen farklılaşma faktörleriyle değiştirir (Gün 0-2).
NOT: 3 günlük farklılaşmadan sonra, farklılaştırılmış hücreler FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 ve FOXA1 (devam etmek için GEREKEN SOX17'nin en az% 80'i) gibi DE hücrelerinin işaretleyicilerini ifade etmelidir.
4. Hepatik progenitör hücrelerin farklılaşması
- Nakavt serum replasmanını (KOSR) Knock Out DMEM'de %20'lik son konsantrasyona çözerek Aşama II farklılaşma temel ortamlarını hazırlayın.
- %1 DMSO, 1x GlutaMAX, 1x esansiyel olmayan amino asit (NEAA) çözeltisi, 100 μM 2-mercaptoethanol ve 1x penisilin/streptomisin (P/S) içeren Aşama II farklılaşma ortamını uygun KOSR/nakavt DMEM hacmine hazırlayın.
- Farklılaşmanın 3. gününde, ortamı epire edin ve Aşama II ortamıyla değiştirin (örneğin, 24 kuyu plakasının kuyusu başına 0,5 mL). Sonra 24 saat kuluçkaya yaslanın.
- Farklılaşmanın 4. gününde, ortamı epire edin ve Aşama II ortamıyla değiştirin (örneğin, 24 kuyu plakasının kuyusu başına 1 mL).
- Ortamı iki günde bir değiştirin (6. günde ortamı değiştirin).
NOT: 8 günlük farklılaşmadan sonra, farklılaştırılmış hücreler HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (devam için gereken HNF4α'nın minimum% 80'i) gibi hepatik progenitör hücrelerin uygun belirteçlerini ifade etmelidir.
5. Hepatosit farklılaşması
- DBPS (%0,2 BSA içeren) ile 10 μg/mL hepatosit büyüme faktörü (HGF), 20 μg/mL Oncostatin (OSM) stok çözümleri ve 0,22 μm filtre zarı ile filtre hazırlayın.
- Aşama III farklılaşma temel ortamını hazırlayın (HepatoZYME-SFM (HZM) 10 μM hidrokortizon-21-hemisuccinate ve 1x P/S ile desteklenmiş ortam).
- HGF'yi 10 ng/mL ve OSM'lik son konsantrasyona, önceden ısıtılmış Stage III farklılaşma ortamının uygun hacmine 20 ng/mL'lik son konsantrasyona ekleyin.
- Farklılaşmanın 8. gününde, Aşama II ortamını hücrelerden epire edin ve Aşama III ortamıyla değiştirin (örneğin, 24 kuyu plakasının kuyusu başına 1 mL).
- Hücrelerin CO2 inkübatöründe 37 °C'de 10 gün kuluçkaya yatmasına izin verin, aşama III ortamlarını her gün yeni eklenen farklılaşma faktörleriyle değiştirir (Gün 8-18).
NOT: 18 günlük farklılaşmadan sonra, farklılaştırılmış hücreler AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4 gibi hepatositlerin karakteristik belirteçlerini ifade etmelidir. Albümin pozitif hücrelerin yüzdesi genellikle% 90'dan fazladır.
6. RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve RT-qPCR analizi
- Hücrelerden orta epire edin ve uygun miktarda RNAiso Plus reaktifi ekleyin (örneğin, 24 kuyu plakasının kuyusu başına 0,3 mL). Süpernatant'ı 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın ve RT'de 5 dakika bekletin.
- 60 μL kloroform reaktif ekleyin ve 5 dakika RT'de bırakın. Daha sonra 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj.
- 125 μL süpernatantı toplayın ve başka bir santrifüj tüpüne aktarın. 160 μL izopropanol ekleyin, iyice karıştırın ve 10 dakika RT'de durun.
- 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj.
- Süpernatantı çıkarın, çökelme yerine% 75 etanol ekleyin ve 5 dakika boyunca 7.500 x g'da santrifüj ekleyin.
- RT'de kuruduktan sonra, çözmek için 40 μL DEPC arıtıcı su ekleyin. qPCR için, üreticinin protokolüne göre ters transkripsiyon kiti ile 2 μg toplam RNA'yı ters yazıya dökin.
- Rt-qPCR'yi üreticinin protokolüne göre ticari bir kit kullanarak gerçekleştirin.
- İndüklenmeyen kök hücrelere göre gen ekspresyonini normalleştirin ve GAPDH'ye normalleşmeyi takiben kat varyasyonu belirleyin.
7. Farklılaşmanın İmmünofluoresans Doğrulaması
- PBS'ye %0,1 Ara Doldurma-20 ekleyerek 1x PBST yıkama tamponu hazırlayın.
- Yapışan hücrelerden orta epire edin ve bir çalkalayıcıda RT'de PBS ile kısa bir süre yıkayın.
- PBS'yi epire edin ve hücreleri bir gecede -20 °C'de sabitlemek için 24 kuyulu bir plakanın kuyusu başına 500 μL buz gibi metanol ile kuluçkaya bırakın.
- Metanol çıkarın ve RT'de her seferinde 10 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde PBS ile hücreleri 3 kez yıkayın.
- PBS'de 1-2 saat boyunca hazırlanan %5 BSA'lık 500 μL'lik blok hücreler bir çalkalayıcı üzerinde RT'de.
- Birincil antikoru blokaj için kullanılan çözeltide 1: 200'de seyreltin.
- Sabit hücreleri bir çalkalayıcı üzerinde 4 °C'de bir gecede 300 μL birincil antikor çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
- Gece kuluçkadan sonra, hücreleri PBST ile 3 kez 10 dakika boyunca RT'de bir çalkalayıcıda yıkayın.
- 1:1000'de blokaj çözeltisinde ikincil antikor çözeltisi hazırlayın.
- Bir çalkalayıcıda RT'de 1 saat boyunca ışıktan korunan 300 μL ikincil antikor çözeltisinde kuluçkaya yatın.
- İkincil antikor çözeltisi aspirat ve bir çalkalayıcı üzerinde RT her zaman 10 dakika PBST ile hücreleri 3 kez yıkayın.
- Hücreleri 3-5 dakika boyunca 300 μL 1 μg/mL DAPI ile kuluçkaya yatırın ve ardından PBST ile iki kez yıkayın.
- PBST'yi arzu ettikten sonra, floresan mikroskobu altında fotoğraf çekmek için uygun miktarda PBS ekleyin.
8. Batı blot analizi
- Tris tamponlu saline (TBS) %0,1 Ara-20 ekleyerek 1x TBST yıkama tamponu hazırlayın.
- Üreticinin protokolüne göre ticari bir kit kullanarak SDS-PAGE elektroforez tamponu ve batı transfer tamponu hazırlayın.
- Toplam hücre proteinini (40 μg) %10 sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel üzerinde çözün ve SDS-PAGE elektroforez tamponunda yaklaşık 2 saat boyunca 15 mA sabit akımda çalıştırın.
- Jeli düşük sıcaklıkta 2 saat boyunca 300 mA sabit akımda bir polivinylidene difluorid (PVDF) membranına aktarın.
NOT: Çalışma süresi ve aktarım süresi, kullanılan ekipmana ve jelin türüne ve yüzdesine bağlı olarak değişebilir. - Bir çalkalayıcı üzerinde RT'de 1 saat boyunca TBST'de hazırlanan % 3 BSA ile membranı engelleyin.
- Birincil antikor çözeltisinde (1:1000 seyreltme) bir gecede 4 °C'de bir çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın.
- Gece kuluçkadan sonra, şişkin membranları TBST ile 3 kez bir çalkalayıcıda RT'de 15 dakika boyunca yıkayın.
- İkincil antikor çözeltisinde (1:2000 seyreltme) bir çalkalayıcıda RT'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
- İkincil antikor çözeltisini atın ve membranı TBST ile 3 kez, her seferinde 15 dakika boyunca rt'de bir çalkalayıcıda yıkayın.
- İmmünürak bantları bir chemiluminescence reaktifi ve ardından otoradyografi kullanarak görselleştirin. Yükleme denetimi olarak β-actin kullanın.
9. Indocyanine yeşil alımı
- DMSO'da 200 mg/mL indocyanine yeşil stok çözeltisi hazırlayın.
- Aşama III farklılaşma ortamını indocyanine yeşil çözelti ile 1 mg/mL'lik son konsantrasyona takviye ederek bir çalışma çözümü hazırlayın.
- 1-2 saat boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatörde kuluçkaya yatırın.
- Orta emiş ve pbs ile hücreleri 3 kez yıkayın.
- Mikroskop altında fotoğraf.
10. Periyodik Asit-Schiff (PAS) boyama ve Hematoksilin-Eosin (H&E) boyama
- Ortamı yapışan hücrelerden epire edin ve PBS ile iki kez kısaca yıkayın.
- Hücre fiksasyonu için PBS'yi aspire edin ve hücreleri bir gecede -20 °C'de buz gibi metanol ile kuluçkaya yatırın.
- PAS boyama ile glikojen depolamayı görselleştirin ve üreticinin talimatlarını takip eden bir kit kullanarak H & E boyama ile binüklelenmiş hücreleri gözlemleyin.
- Floresan mikroskopla görüntü alın.
11. CYP Etkinliği için Test
- Cyp450 aktivitesini, üreticinin talimatlarına göre piyasada bulunan hücre bazlı tahlilleri (P450-Glo Tahlilleri) kullanarak ölçün.
- Test için üç bağımsız yineleme kullanın. Veriler ortalama ± SD olarak temsil edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HESC'lerden HLC indüksiyonunun şematik diyagramı ve her farklılaşma aşamasının temsili parlak alan görüntüleri Şekil 1'degösterilmiştir. Aşama I'de, kök hücreleri endoderm hücreleri oluşturmaya teşvik etmek için 3 gün boyunca Activin A ve CHIR99021 eklendi. Evre II'de endoderm hücreleri 5 gün boyunca farklılaşma ortamı ile tedavi edildikten sonra hepatik progenitör hücrelere farklılaştı. Evre III'te erken hepatositler HGF ve OSM'de 10 gün sonra olgunlaşmış ve HLC'lere farklılaşmıştır (Şekil 1A). Farklılaşmanın son aşamasında, hücreler tipik bir hepatosit fenotipi göstermiştir (hücreler çokgendir ve eşit ve düzenli olarak dağıtılır) (Şekil 1B).
Hepatik farklılaşmayı daha da doğrulamak için endoderm hücrelerinin, hepatik progenitör hücrelerin ve olgun hepatositlerin belirteçlerini tespit etmek için RT-qPCR, immünofluoresans boyama ve batı şişkinliği kullanılmıştır (Şekil 2). Farklılaştırılmış hücreler, 3. günde ENDODERM belirteçleri SOX17 (%89.7± 0.8) gibi her aşamada farklılaşma ile ilgili gen ve proteinlerin yüksek ekspresyon seviyelerini gösterdi. Hepatik progenitör belirteci HNF4α (%81.3±2.9) 8. günde, AFP (%86.6±0.3) 14. günde ve olgun hepatosit işaretleyici ALB (%94.5±1.1) 18. Bu sonuçlar, hepatosit benzeri hücrelerin bu protokol tarafından oluşturulduğunu göstermektedir.
HLC'lerin hepatosit fonksiyonlarına sahip olup olmadığını tespit etmek için ICG alımı, glikojen depolama ve HLC'lerin CYP aktivitesinin yanı sıra H&E boyaması gerçekleştirdik. Görüldüğü gibi HLC'lerde yeşil lekelenme (Şekil 3A) ve glikojen depolama ile uyumlu geniş sitoplazmik periyodik asit-Schiff lekelenmesi (pembeden mora) gözlenmiştir (Şekil 3B). Ek olarak, tipik bir binüklelenmiş hepatositin temsili morfolojisini görebiliriz (Şekil 3C). Son olarak karaciğerdeki en önemli metabolik CYP olan CYP3A4'ün enzimatik aktivitesi tahlil ile doğrulanmıştır(Şekil 3D).
| Reaktifin Adı | Şirket | Katalog Numarası | Stok Konsantrasyonu | Son Konsantrasyon |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | 50 mM | 100 μM |
| Fare IgG'ye karşı 488 etiketli keçi | ZSGB-BIO | ZF-0512 | - | EĞER: 1:1000 |
| Tavşan IgG'ye karşı 488 etiketli keçi | ZSGB-BIO | ZF-0516 | - | EĞER: 1:1000 |
| Accutase | Kök Hücre Teknolojileri | 7920 | 1 x | 1 x |
| Activin A | peproTech | 120-14E | 100 μg/ml | 100 ng/ml |
| Anti - Albümin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | - | EĞER: 1:200; GÇ:1:1000 |
| Anti - İnsan Oct4 | Abcam | Ab19587 | - | EĞER: 1:200 |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | - | EĞER: 1:200; GÇ:1:1000 |
| Anti -SOX17 | Abcam | AB224637 | - | EĞER: 1:200 |
| Anti-Hepatosit Nükleer Faktör 4 alfa (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | - | EĞER: 1:200 |
| B-27 Ek | Gibco | 17504-044 | 50 x | 1 x |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | - | 5.00% |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | 3 mM | 3 μM |
| DAPI | Beyotime | C1006 | - | - |
| DEPC suyu | Beyotime | R0021 | - | - |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | 500 μM | 250 nM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | 1 x | 1 x |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | 1 x | 1 x |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | 1 x | 1 x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 x | 1 x |
| H&E boyama kiti | Beyotime | C0105S | - | - |
| Hepatosit büyüme faktörü (HGF) | peproTech | 100-39 | 10 μg/ml | 10 ng/ml |
| HepatozYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | - | - |
| Hidrokortizon-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | 1 mM | 10 μM |
| Indocyanine | Sangon Biyoteknoloji | A606326 | 200 mg/mL | 1 mg/mL |
| DMEM'i Nakavt | Gibco | 10829-018 | 1 x | 1 x |
| SR Çok Türlü Nakavt | Gibco | A31815-02 | - | 20% |
| Matrigel hESC nitelikli | Corning | 354277 | 60 x | 1 x |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | 100 x | 1 x |
| mTesR 5X Eki | Kök Hücre Teknolojileri | 85852 | 5 x | 1 x |
| mTesR Bazal Orta | Kök Hücre Teknolojileri | 85851 | 1 x | 1 x |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | 20 μg/ml | 20 ng/ml |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | - | - |
| PAS boyama kiti | Solarbio | G1281 | - | - |
| Kalem/Strep | Gibco | 15140-122 | 100 x | 1 x |
| Peroksidaz-Konjuge Keçi Anti-Fare IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | - | GÇ: 1:2000 |
| Batı Blot için Birincil Antikor Seyreltme Tamponu | Beyotime | P0256 | - | - |
| ReverTraAce qPCR RT Kiti | TOYOBO | FSQ-101 | - | - |
| RNAiso Artı | Takara | 9109 | - | - |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | 1 x | 1 x |
| Yağsız süt | Sangon Biyoteknoloji | A600669 | - | 5.00% |
| SYBR Yeşil Ana Karışımı | Termo Fisher Bilimsel | A25742 | - | - |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | 15 μM | 15 nM |
| Ara | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | - | 0.10% |
Tablo 1: Hücre kültürü ve farklılaşma temel ortamı bileşenleri.
| Gene'in Adı | Kısaltma | astar dizileri(F) | astar dizileri (R) |
| POU Sınıf 5 Homeobox 1 | OCT4 | AGCGAACCAG TATCGAGAAC |
TTACAGAACC ACACTCGGAC |
| ÇatalBaş Kutusu A2 | FOXA2 | GCATTCCCAATC TTGACACGGTGA |
GCCCTTGCAGC ÇAĞATAYKACATT |
| SRY Kutusu Transkripsiyon Faktörü 17 | SOX17 | TATTTTGTCTGC CACTTGAACAGT |
TTGGGACACAT TCAAAGCTAGTTA |
| Kıvırcık Sınıf Reseptörü 8 | FZD8 | ATCGGCTACAA CTACACCTACA |
GTACATGCTGC ACAGGAAGAA |
| C-X-C Motifli Kemokin Reseptörü 4 | CXCR4 | CACCGCATCT GGAGAACCA |
GCCCATTTCCT CGGTGTAGTT |
| ÇatalBaş Kutusu A1 | FOXA1 | AAGGCATACGA ACAGGCACTG |
TACACACCTTG GTAGTACGCC |
| Msh Homeobox 1 | MSX1 | CGCCAAGGCA AAGAGACTAC |
GCCATCTTCAG CTTCTCCAG |
| Mezogenin 1 | MSGN1 | GCTGGAATCCTA TTCTTCTTCTCC |
TGGAAAGCTAACA TATTGTAGTCCAC |
| Caudal Tipi Homeobox 1 | CDX1 | AAGGAGTTTCAT TACAGCCGTTAC |
TGCTGTTTCTTCT TGTTCACTTTG |
| Çift Atlanan Homeobox 1 | EVX1 | GCTGTCTCTCTG AACAAAATGCT |
CATCTCACTCTCTCT CTCCTCCAAA |
| Mesoderm Posterior BHLH Transkripsiyon Faktörü 2 | MESP2 | AGCTTGGGTG CCTCCTTATT |
TGCTTCCCTGAA AGACATCA |
| NK2 Homeobox 5 | NKX2.5 | CAAGTGTGCG TCTGCCTTT |
CAGCTCTTTCTT TTCGGCTA |
| ISL LIM Homeobox 1 | ISL1 | AGATTATATCAGGT TGTACGGGATCA |
ACACAGCGGA AACACTCGAT |
| Hepatosit Nükleer Faktör 4 Alfa | HNF4α | ACATGGACATG KİkACTAC |
CGTTGAGGTTG GTGCCTTCT |
| Alfa Fetoprotein | AFP | ACTGAATCCAG AACACTGCA |
TGCAGTCAATG CATCTTTCA |
| T-Box Transkripsiyon Faktörü 3 | TBX3 | TTATGTCCCAG CGAGGGTGA |
ACGTGGTGGTG GAGATCTTG |
| Transthyretin | TTR | AGAAAGGCTG CTGATGAC |
GTGCCTTCCA GTAAGATTTG |
| Albümin | ALB | CCCCAAGTGT CAACTCCA |
GTTCAGGACCA CGGATAG |
| Sodyum taurokolat kotransporting polipeptid | NTCP | CATAGGGATCGT CCTCAAATCCA |
GCCACACTGCAC AAGAGAATG |
| CCAAT Arttırıcı Bağlayıcı Protein Alfa | CEBPA | AGGAGGATGAA GCCAAGCAGCT |
AGTGCGCGATC TGGAACTGCAG |
| Serpin Ailesi A Üyesi 1 | AAT | AAATGAACTCA CCCACGAT |
ACCTTAGTGATG CCCAGT |
| Asialoglycoprotein Reseptörü 1 | ASGR1 | CAGACCCTGAGA CCCTGAGCAA |
TCCTGCAGCTGG GAGTCTTTTCT |
| Sitokrom P450 Ailesi 3 Alt Aile A Üyesi 4 | CYP3A4 | TTGTAATCACTG TTGGCGTGGG |
AATGGGCAAAGT CACAGTGGA |
Tablo 2: q-PCR analizi için astar dizileri.
Şekil 1: DE ve HLC'lerin spesifikasyonu için şematik protokol şeması. (A) Bu çalışmada kullanılan 3 aşamalı farklılaşma stratejisinin şematik sunumu. (B) Gün 0, 3, 8, 14 ve 18'de farklılaştırılmış hücrelerin morfolojisi. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: HESC farklılaşması sırasında sahne alanına özgü işaretleyici ekspresyasyonu HLC'lere. (A) evreye özgü genlerin mRNA ekspresyasyonu. (B-C) Evreye özgü genlerin protein ekspresyy kullanımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: HESC türevi HLC'lerin fonksiyonları. (A) 1 mg/mL indocyanine green ile 1 h boyunca tedavi edilen LC'ler faz mikroskopisi ile değerlendirildiği gibi alımı gösterir. (B) Glikojen depolamayı gösteren temsili PAS boyama görüntüleri. (C) Temsilci HE binükleat hücrelerini gösteren görüntüleri lekeliyor. (D) Majör sitokrom P450 enzimlerinin bazal düzey aktivitesi. Tüm değerler ortalama ± SD olarak sunulur. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, HESC'lerden HLC'leri üç aşamada indükleyen adım adım bir yöntem sunuyoruz. İlk aşamada, Activin A ve CHIR99021 HESC'leri DE'ye ayırt etmek için kullanıldı. İkinci aşamada KO-DMEM ve DMSO, DE'yi hepatik progenitör hücrelere ayırt etmek için kullanıldı. Üçüncü aşamada, hepatik progenitör hücreleri HLC'lere ayırmaya devam etmek için HZM artı HGF, OSM ve hidrokortizon 21-hemisuccinate sodyum tuzu kullanıldı.
Protokol kullanırken aşağıdaki kritik adımların dikkate alınması gerekir. Hücrelerin ilk farklılaşma yoğunluğu ve orta değişikliklerin doğru zamanlaması başarılı farklılaşma için önemli faktörlerdir. Farklılaşmaya başladığımızda, hücrelerin birbirleriyle yeni temas etmeye başladığı yaklaşık% 30-40'lık bir bir izdihamda ilk tohumlama yoğunluğunun uygun olduğundan ve hücreler arası boşlukların görüş alanı altında bir ağda eşit olarak düzenlendiğinden emin olmalıyız. Farklılaşma sırasında, ilgili farklılaşma ortamı, hücrelerin embriyonik gelişim sürecini taklit eden modda ve aşamada farklılaşmasını sağlamak için, özellikle ilk aşamada ve her değiştirme aşamasının anahtar anında, belirtilen zamanda tam olarak değiştirilmelidir.
HESC'lerin DE'ye farklılaştırılmasının ilk aşaması özellikle önemlidir. Genellikle hücre kaderi için kritik bir aşama olan farklılaşmanın I. Aşaması sırasında ayrılarak yüzen çok sayıda hücre vardır, ancak şu anda hücreler hala çoğalma yeteneğini korur. Bu nedenle, hücrelerin birleşmesi Aşama I'in sonunda yaklaşık% 90-100'e ulaşabilir. Ek olarak, farklılaşma evre III'ün başında (yani, Gün 8), hücrelerin sitoplazmasının yoğunlaşmaya başladığı ve hücrelerin yavaş yavaş ince bir morfoloji elde ettiği belirtilmelidir. Bununla birlikte, 10.
Bu çalışmada, ELDE EdİlEN TCC'ler aslında fetal hepatositlere daha yakındır, çünkü AFP 18. Üretilen HLC'ler hepatotit özellikleri ve işlevleri uygulasa da, HLC'ler ve birincil insan hepatatositleri arasında hala bir boşluk vardır, bu da farklılaştırılmış hücrelerimizin hala işlevsel olarak olgunlaşmadığını gösterir. Bu nedenle, gelecekteki çalışmaların farklılaşma yöntemini daha da optimize etmeye odaklanması gerekecektir.
Günümüzde büyüme faktörleri ve Activin A9, 10,14,Wnt3a15, CHIR16, Torin217ve IDE118,19 gibi küçük moleküler bileşikler çeşitli farklılaşma sistemlerinde DE farklılaşmasına neden olmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Song grubu kök hücreleri DE'ye ayırt etmek için Activin A'yı kullandı ve hepatik spesifikasyon ve HLCs olgunlaşması 20 için FGF4 (Fibroblast Growth Factor 4), BMP2(Bone morfogenetik protein2),HGF, KGF (Keratinosit büyüme faktörü), OSM ve Dex'i kullandı. Sullivan grubu ACTIVIN A ve Wnt 3a tarafından DE'yi ve β-ME (2-mercaptoethanol), DMSO, İnsülin, HGF, OSM21tarafından indüklenen HLC'leri indüklemiştir. Siller ekibi, karaciğer fonksiyon özelliklerine sahip HLC elde etmek için DE farklılaşması, DMSO, Dihexa (Hepatosit büyüme faktörü reseptör agonisti N-heksanoik-Tyr) ve HLC farklılaşması için Dex için CHIR99021'i kullandı16. Bununla birlikte, bu yöntemlerden bazıları yüksek maliyetle DE üretmek için birçok rekombinant büyüme faktörü kullanır ve bazıları daha düşük verimlilikle DE üretmek için sadece küçük moleküller kullanır. Activin A, DE üretimi için kritik bir faktördür. Activin A'yı diğer küçük moleküllerle değiştirmeye çalıştık, ancak genellikle daha düşük bir verim elde ettik. Bu nedenle, ACTIVIN A ve CHIR99021'i DE'nin indükleyici faktörleri olarak ekleme yöntemini benimsiyoruz ve her aşamada farklılaşma ile ilgili genleri q-PCR, immünofluoresans ve batı şişkinliği ile tespit ediyoruz.
Son yıllarda, hESC'lerden yönlendirilmiş HLC indüksiyonu için deneysel bir sistemin kurulması, karaciğere bağlı hastalıklar için hepatat geliştirme ve tarama ilaçlarının modellanması için önemli bir temel oluşturmaktadır. Aynı zamanda hepatosit nakli, karaciğer doku mühendisliği, biyoartificial karaciğerler ve diğer araştırmalar için etkili bir hücre kaynağı sağlayabilir. Kök hücrelerden elde edilen HIV'lerin, hepatotoksik ilaç kaynaklı yanıtları tahmin etmek ve10,22 , 23,24,25hücrelerinin doğuştan gelen bağışıklık yolunu ve sinyal yollarını incelemek için bir ilaç tarama modeli olarak viral enfeksiyon üzerinde çeşitli çalışmalar yapmak için kullanıldığı bildirilmiştir. Genel olarak, bu yöntem, hESC'leri olgun fonksiyonel hepatositlere başarılı bir şekilde ayırt edebilen hESC'lerden verimli bir hepatosit benzeri hücre farklılaştırma tekniğini ayrıntılı olarak tanıtır. Sonuçlar, HLC tabanlı uygulamaların geliştirilmesi için bir platform sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81870432 Ve X.L.Z.'ye 81570567), (P.N.S.'e 81571994) tarafından desteklendi; Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı, Çin (No. 2020A1515010054 ila P.N.S.), Li Ka Shing Shantou Üniversitesi Vakfı (No. L1111 2008'den P.N.S.'ye). Shantou Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Prof. Stanley Lin'e faydalı tavsiyeler için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti - Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti - Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti - α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
References
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
- Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B.
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
- Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
- Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
- Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
- Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
- Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
- Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
- Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
- Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
- Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).
