Artículo de método

Modelos 2D y 3D basados en células madre pluripotentes inducidas por humanos para diseccionar la participación del cilio primario durante el desarrollo neocortical

DOI:

10.3791/62667

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25 de marzo de 2022

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1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos protocolos detallados para la generación y caracterización de modelos de desarrollo neocortical basados en células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC) 2D y 3D, así como metodologías complementarias que permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la biogénesis y función del cilio primario (PC).

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los cilios primarios (PC) son orgánulos dinámicos no móviles basados en microtúbulos que sobresalen de la superficie de la mayoría de las células de mamíferos. Emergen del centriolo más antiguo durante la fase G1/G0 del ciclo celular, mientras que se desmontan a medida que las células vuelven a entrar en el ciclo celular en el límite de la fase G2/M. Funcionan como centros de señales, detectando y transduciendo señales extracelulares cruciales para muchos procesos celulares. Al igual que en la mayoría de los tipos de células, se ha demostrado que todas las células madre y progenitoras neurales neocorticales (NSPC) albergan una PC que les permite detectar y transducir señales específicas requeridas para el desarrollo cortical cerebral normal. Aquí, proporcionamos protocolos detallados para generar y caracterizar modelos bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D) basados en células a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hIPSC) para diseccionar aún más la participación de la PC durante el desarrollo neocortical. En particular, presentamos protocolos para estudiar la biogénesis y la función de la PC en NSPC derivados de rosetas neuronales 2D, incluida la transducción de la vía Sonic Hedgehog (SHH). Para aprovechar la organización tridimensional (3D) de los organoides cerebrales, describimos un método simple para la obtención de imágenes 3D de organoides cerebrales in toto inmunoteñidos. Después de la limpieza óptica, la rápida adquisición de organoides completos permite la detección de centrosomas y PC en progenitores neocorticales y neuronas de todo el organoide. Finalmente, detallamos el procedimiento para la inmunotinción y limpieza de gruesas secciones organoides que flotan libremente, preservando un grado significativo de información espacial 3D y permitiendo la adquisición de alta resolución requerida para el análisis cualitativo y cuantitativo detallado de la biogénesis y la función de la PC.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los cilios primarios (PC) son orgánulos basados en microtúbulos que detectan y transducen una gran cantidad de señales químicas y mecánicas del entorno extracelular. En particular, la PC es el orgánulo central para la transducción de la vía de señalización del erizo en vertebrados1,2. Si bien se ha demostrado durante mucho tiempo que la mayoría de las células neuronales albergan una PC, la contribución de este orgánulo en la configuración del sistema nervioso central ha sido subestimada durante mucho tiempo. Los estudios sobre el desarrollo neocortical han llevado al descubrimiento de múltiples células madre y progenitoras neurales (NSPC), todas albergando una PC, cuya ubicación se ha propuesto que es crucial para la determinación del destino de los progenitores3,4,5,6,7. La PC ha demostrado ser crucial para los mecanismos celulares que se requieren para el desarrollo cortical cerebral normal, incluida la expansión y el compromiso de NSPC8,9,10,11,12, así como la polaridad apicobasal del andamio glial radial que apoya la migración neuronal13. Además, se requieren PC durante la migración tangencial de las interneuronas a la placa cortical14,15. Finalmente, se ha propuesto un papel para el PC en el establecimiento de conexiones sinápticas de neuronas en la corteza cerebral16,17. En conjunto, estos hallazgos abogan por un papel crucial de la PC en los principales pasos del desarrollo cortical cerebral18,19 y plantean la necesidad de investigar su participación en los mecanismos patológicos subyacentes a las anomalías del desarrollo cortical cerebral.

Estudios recientes han mejorado en gran medida nuestra comprensión de las importantes diferencias celulares y moleculares entre el desarrollo cortical en modelos humanos y animales, enfatizando la necesidad de desarrollar sistemas modelo humanos. Desde este punto de vista, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hIPSC) representan un enfoque prometedor para estudiar la patogénesis de la enfermedad en un contexto genético y celular relevante. Los modelos adherentes bidimensionales (2D) basados en células o rosetas neuronales contienen NSPC similares a los observados en la corteza cerebral en desarrollo, que se organizan en estructuras en forma de roseta que muestran una polaridad apicobasal correcta20,21,22. Además, el sistema de cultivo tridimensional (3D) permite la generación de organoides del cerebro anterior dorsal que recapitulan muchas características del desarrollo cortical cerebral humano23,24,25,26. Esos dos enfoques complementarios de modelado basado en células ofrecen perspectivas emocionantes para diseccionar la participación de la PC durante el desarrollo normal y patológico de la corteza cerebral.

Aquí, proporcionamos protocolos detallados para la generación y caracterización de rosetas neurales y NSPC derivados, así como organoides del cerebro anterior dorsal. También proporcionamos protocolos detallados para analizar la biogénesis y la función de la PC presente en los NSPC mediante la prueba de la transducción de la vía Sonic Hedgehog y el análisis de la dinámica de moléculas cruciales involucradas en esta vía. Para aprovechar la organización 3D de los organoides cerebrales, también establecimos un método simple y rentable para la obtención de imágenes 3D de organoides cerebrales in toto inmunoteñidos que permiten una rápida adquisición, gracias a un microscopio de lámina de luz, de todo el organoide, con alta resolución que permite visualizar PC en todo tipo de progenitores neocorticales y neuronas de todo el organoide. Finalmente, adaptamos la inmunohistoquímica en secciones de flotación libre de 150 μm con posterior limpieza y adquisición utilizando microscopio confocal de barrido resonante que permite la adquisición de imágenes de alta resolución, que se requiere para el análisis detallado de la biogénesis y la función de la PC. Específicamente, el software de imágenes 3D permite la reconstrucción 3D de PC con el análisis posterior de parámetros morfológicos que incluyen longitud, número y orientación de PC, así como la medición de la intensidad de la señal de los componentes ciliares a lo largo del axonema.

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Protocolo

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1. Generación de modelos 2D basados en células hIPS de desarrollo neocortical

  1. Formación de rosetas neurales
    1. Comience con cultivos hIPSC que albergan grandes colonias regulares, que exhiben menos del 10% de diferenciación y no más del 80% de confluencia.
    2. Enjuague las hIPSC con 2 ml de PBS.
    3. Añadir 2 mL de medio de inducción NSPC suplementado con el inhibidor de Rock (NIM + 10 μM de Y-27632).
    4. Diseccionar manualmente cada colonia hIPSC de un plato de 35 mm usando una aguja para cortar cada colonia con precisión en direcciones horizontales y verticales para crear un patrón de tablero de ajedrez que divide cada colonia en grupos iguales.
    5. Separe la colonia con un raspador de células y transfiérala a un plato de 35 mm de fijación ultra baja.
    6. Déjelos flotar durante la noche (ON) en una incubadora humidificada a 37 ° C y 5% de CO2, para que puedan formar cuerpos embrionarios (EB).
      NOTA: Los cuerpos embrioides (EB) se definen como grupos de esferoides flotantes o agregados de hIPSC.
    7. Transfiera los EB a platos de 35 mm recubiertos de poli-L-ornitina/laminina (PO/lam) en 2 mL NIM + 10 μM de Y-27632.
    8. Actualización diaria del medio de inducción NSPC (NIM sin Y-27632) hasta la formación de rosetas neurales que tarda aproximadamente de 12 a 14 días. Verifique bajo el microscopio.
      NOTA: Después de este paso, las rosetas neurales se pueden expandir, diferenciar y procesar para el análisis de inmunotinción o disociarse para obtener células madre y progenitoras neurales (NSPC) aisladas.
  2. Expansión de la roseta neural y diferenciación temprana
    1. Corta rosetas neurales en un patrón en forma de cuadrícula con una aguja y desaloja los racimos usando un raspador celular.
    2. Transfiera las rosetas a una placa de 4 pocillos que contenga una cubierta de vidrio recubierta de PO/lam (4-5 rosetas/pozo) en 0,5 ml de medio de mantenimiento NSPC (NMM).
    3. Incubar la placa en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
    4. Actualice NMM cada dos días hasta el día 20.
    5. A partir del día 20, las rosetas neuronales de cultivo en 0,5 ml de citoquinas agotaron la NMM para permitir la diferenciación. Refresque el medio cada 2-3 días.
    6. En el día 30 y día 40 (10 o 20 días de diferenciación), fijar las rosetas con 0,5 mL de PFA al 4%, 20 min, RT.
  3. Biogénesis de PC y análisis de funciones en NSPC aislados
    1. Disociación NSPC
      1. Corte las rosetas neurales del paso 1.1.8 en un patrón similar a una rejilla con una aguja y desaloje los grupos con un raspador celular. Transfiera las células a platos de 35 mm recubiertos de PO/lam en 2 ml de NMM e incube en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
      2. Actualice NMM cada dos días hasta la confluencia (aproximadamente 5-7 días).
      3. Después de raspar las células grandes y claras que rodean las rosetas neurales, recójalas manualmente y transfiéralas a platos frescos de 35 mm recubiertos de PO / lam para enriquecer los NSPC y agotar los tipos de células no neurales.
      4. Después de uno o dos pasajes manuales (repita el paso 1.3.1.3 si es necesario) necesarios para eliminar todos los tipos de células contaminantes, retire el medio y enjuague con PBS.
      5. Añadir 300 μL de tripsina al 0,05% e incubar durante 5 min a 37 °C hasta que la mayoría de las células se desprendan.
      6. Agregue 2 ml del medio que contenga 10% de FBS (DMEM + 10% de FBS) para inactivar la tripsina. Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml. Pipetee suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo tres veces para romper los grupos de células.
      7. Centrifugadora a 300 x g durante 5 min.
      8. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda las células en NMN.
      9. Sembrar los NSPC disociados como células individuales (1 x 105 células/cm2) en NMM en platos recubiertos de PO/lam e incubarlos en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
      10. Expanda los NSPC en NMM cambiando el medio cada dos días.
        NOTA: Los NSPC se siembran a alta densidad para evitar la diferenciación.
    2. Análisis de biogénesis de PC
      1. Sembra NSPC disociadas a 100.000 células/cm2 y las incubamos en una incubadora humidificada a 37 °C y al 5% de CO2 en NMM durante 2 días.
      2. Aspirar el medio y morir de hambre de NSPC en medio agotado de citoquinas (medio de inanición NSPC, Tabla suplementaria 1) durante 48 h.
      3. Arregle los NSPC con 4% de PFA durante 20 minutos en RT.
      4. Lavar dos veces con PBS durante 5 min en RT antes de la inmunotinción.
    3. Análisis de la función de la PC: vía de señalización SHH
      1. Semilla disocia NSPC a 100.000 células/cm2 en toboganes de cámara de 8 pocillos recubiertos de PO/lam (300 μL) o platos T25 (5 mL) e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 en NMM durante 2 días.
      2. Privar a los NSPC en medio de inanición NSPC (300 μL por pocillo de deslizamiento de cámara de 8 pocillos y 5 ml en matraz T25) durante 48 h.
      3. Para inducir la vía SHH, incubar los NSPC con el medio de inanición suplementado con SHH recombinante (100 ng/mL) o SAG (500 nM); (150 μL por pocillo de un portaobjetos de cámara de 8 pocillos y 2 ml en matraz T25) durante 24 h.
      4. Fijar los NSPC cultivados en portaobjetos de cámara de 8 pocillos en 250 μL de PFA al 4% por pocillo durante 20 min a RT y lavarlos dos veces con 250 μL de PBS durante 5 min a RT antes del análisis de inmunotinción.
      5. Retire el medio y lave los NSPC cultivados en platos T25 con PBS.
      6. Añadir 500 μL de tripsina al 0,05% e incubar durante 5 min a 37 °C hasta que las células se desprendan.
      7. Añadir 2 mL de medio que contenga 10% de FBS (DMEM + 10% de FBS) para inactivar la tripsina y recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 mL.
      8. Centrifugar a 300 x g durante 5 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante para obtener pellets NSPC que se puedan criopreservar a -80 °C antes de la extracción de ARN y el análisis RT-PCR.

2. Generación de organoides del cerebro anterior dorsal

  1. Cultivo unicelular de hIPSCs
    1. Comience con las culturas hIPSC que albergan grandes colonias regulares que exhiben menos del 10% de diferenciación y que se han pasado casi una vez. Asegúrese de que las células no sean más del 80% confluentes.
    2. Lavar las colonias con 2 ml de PBS.
    3. Añadir 500 μL de reactivo de disociación celular suave (GCDR) e incubar durante 5 a 7 min a 37 °C.
    4. Aspirar el GCDR y añadir 2 mL de medio mTeRS1 suplementado con 5 μM de Y-27632.
    5. Pipetear las células suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces para disociar todas las colonias en células individuales.
    6. Transfiera las células en platos recubiertos de vitronectina e incube en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
      NOTA: Realizar al menos 1 paso de las hIPSCs usando GCDR antes del experimento de diferenciación para adaptar las hIPSCs a condiciones de cultivo unicelular.
  2. En el día 0, permita que las hIPSC formen cuerpos embrionarios en medio EB que contengan una baja concentración de FGF2 y una alta concentración de inhibidor de roca requerida para la supervivencia de hIPSC. Para hacerlo, siga los pasos a continuación.
    1. Lavar las colonias con 2 ml de PBS.
    2. Añadir 500 μL de reactivo de disociación celular suave (GCDR) e incubar durante 5 a 7 min a 37 °C.
    3. Aspirar el GCDR y añadir 1 mL de medio EB suplementado con 50 μM de Y-27632; Use una pipeta de 1 ml para separar suavemente las células y transferirlas a un tubo cónico de 15 ml.
    4. Enjuague una vez más con 2 ml de medio EB suplementado con 50 μM de Y-27632, transfiera las células restantes al tubo cónico de 15 ml. Agregue inmediatamente 3 ml de medio EB suplementado con 50 μM de Y-27632 al tubo cónico y homogeneice suavemente la solución utilizando una pipeta de 5 ml.
    5. Centrifugar las células disociadas a 100 x g durante 5 min.
    6. Aspire suavemente el sobrenadante y resuspenda las células en 6 ml de medio EB suplementado con 50 μM de Y-27632.
    7. Centrifugar las células a 100 x g durante 5 min.
    8. Aspirar el sobrenadante y resuspend las células en 1 mL de medio EB suplementado con 50 μM de Y-27632. Use una pipeta de 1 ml para disociar suavemente las células en una suspensión de una sola célula.
    9. Inmediatamente después de resuspender las células, diluirlas y contarlas.
    10. Diluya el volumen adecuado de suspensión celular (que contiene 900,000 células) en 30 ml de medio EB suplementado con 50 μM de Y-27632 y 4 ng / ml de bFGF y mezcle suavemente la solución.
    11. Placa 9.000 células/pozo en una placa 96U de fijación ultra baja (300 μL/pocillo). Para evitar perturbar la formación de EB, incube la placa en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 hasta el día 3 sin cambio medio.
  3. Inducción neural (inhibición dual de SMAD)
    1. El día 3, asegúrese de que los EB midan 300-400 μm y muestren bordes regulares. Si se alcanzan ambos criterios, reemplace la mitad del medio (150 μL) con el medio de inducción-1 que contiene inhibidores duales de SMAD, lo que lleva a un brillo del contorno de los EB en el día 6 al día 7, lo que indica diferenciación neuroectodérmica (Tabla suplementaria 2).
    2. En el día 4, reemplace 3/4 del medio (225 μL) por medio de inducción-1.
    3. En el día 6 y día 8: Refrescar la mitad del medio de inducción-1 (150 μL).
  4. Incrustación de organoides en la matriz de la membrana basal (Día 10)
    1. El día 10, incruste EB en la matriz de membrana basal reducida (BMM) del factor de crecimiento.
      NOTA: A partir de este paso, utilice siempre tijeras estériles para cortar la abertura de las puntas de la pipeta para evitar dañar los organoides por pipeteo repetido.
    2. Primera transferencia alrededor de 15-17 organoides en tubos cónicos. Deje que los EB se asienten y retire el medio. Añadir 50 μL de medio de inducción-2 y transferirlos a un tubo de microcentrífuga que contenga 100 μL de BMM.
    3. Extienda la mezcla de matriz y EB en el centro de un pozo de una placa de fijación ultra baja y separe los EB para evitar que se fusionen.
    4. Deje que el BMM se solidifique en la incubadora a 37 °C durante 45 min.
    5. Añadir 3 mL del medio de inducción-2 en cada pocillo y colocar la placa en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
      NOTA: Asegúrese de que este procedimiento se realice lo más rápido posible, ya que BMM se solidifica a temperatura ambiente.
  5. Cultivo estacionario de organoides incrustados en la matriz de la membrana basal
    1. Día 12, 14: Actualizar la inducción media-2.
    2. Día 16: Refrescar el medio de inducción-2 y comprobar bajo un microscopio la expansión de las asas neuroepiteliales.
  6. Disociación y cultivo de la matriz de la membrana basal en un agitador orbital
    1. El día 17, disociar los organoides de BMM mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de 5 ml y transferirlos a la diferenciación media-1 (sin vitamina A). Incubar en un agitador orbital a 80 rpm en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 para mejorar la absorción nutricional.
      NOTA: Use una incubadora diferente para el cultivo estacionario y el cultivo en un agitador orbital para evitar cualquier vibración perjudicial para el crecimiento de células hIPS adherentes.
    2. Día 19: Refrescar la diferenciación media-1.
    3. Día 21: Cambiar diferenciación media-1 a diferenciación media-2 (con vitamina A).
    4. Del día 23 al día 35: Refrescar el medio con diferenciación media-2 cada 2-3 días.
    5. Del día 35 al día 70: Refrescar la diferenciación media-2 con un 1% de BMM y actualizar cada 2-3 días.
    6. Recoger los organoides después de 28, 42 y 70 +/- 2 días de diferenciación y fijarlos durante la noche a 4 °C, en 5 mL 4% PFA en un tubo cónico de 15 mL.
    7. Para un análisis de inmunotinción adicional en toto o flotante, los organoides se enjuagan dos veces en PBS y se conservan a 4 ° C en PBS + azida de sodio al 0,05%.
    8. Para el análisis de inmunotinción en secciones congeladas, sumerja los organoides fijos de PFA al 4% en sacarosa al 30% al 10 ml a +4 °C ON (o hasta que los organoides se hundan). Intértelos en una matriz de incrustación congelada y guárdelos a -80 ° C hasta la crioseccionación.

3. In toto inmunoetiquetado, limpieza y adquisición de láminas de luz de organoides del cerebro anterior dorsal

  1. Fijación
    1. Recoja los organoides en placas de 6 pocillos, retire el medio y fíjelos con 2 ml de PFA al 4%, a 4 ° C, durante la noche.
    2. Realizar tres lavados en 2 mL de PBS a temperatura ambiente.
    3. Transfiera los organoides en tubos de 2 ml y guárdelos a 4 °C en 2 ml de PBS + azida de sodio al 0,05%.
  2. Permeabilización
    1. Incubar organoides en 1 ml de PBS que contenga 0,2% de Tritón X100 en RT durante 1 h. Haga esto dos veces.
    2. Incubar en 1 mL de PBS que contenga 0,2% tritón X100 y 20% DMSO, a 37 °C, durante la noche.
    3. Incubar en 1 mL de PBS que contenga 0.1% Tween20, 0.1% Triton X100, 0.1% Desoxicolato, 0.1% NP40 y 20% DMSO, a 37 °C, durante la noche.
    4. Incubar en 1 mL de PBS que contenga 0,2% Triton-X100, en RT, durante 1 h. Haga esto dos veces.
  3. Bloqueo e inmunoetiquetado
    1. Bloqueo en 1 mL de solución bloqueadora (PBS, 0.2% Triton X100, 6% Donkey Serum, 10% DMSO), a 37 °C, ON.
    2. Incubar con anticuerpos primarios diluidos en 250 μL de PBS, 0,2% Tween20, 0,1 μg/mL de heparina, 5% DMSO y 3% Donkey Serum, a 37 °C, durante 2 días.
    3. Lavar en 1 ml de PBS que contenga Tween20 al 0,2% y 0,1 μg/ml de heparina, durante 1 h, a 37 °C. Haz esto cuatro veces.
    4. Lavar en 1 ml de PBS que contenga Tween20 al 0,2% y 0,1 μg/ml de heparina, durante la noche, a 37 °C.
    5. Incubar con anticuerpos secundarios diluidos en 250 μL de PBS que contengan 0,2% Tween 20, 0,1 μg/mL de heparina y 3% de suero de burro, a 37 °C, durante 2 días.
    6. Lavar en 1 ml de PBS que contenga 0,2% Tween 20 y 0,1 μg/ml de heparina, durante 1 h, en una rueda, en RT. Haz esto cuatro veces.
    7. Lavar en 1 ml de PBS que contenga 0,2% Tween 20 y 0,1 μg/ml de heparina, durante la noche, en una rueda, en RT.
    8. Lavar en 1 ml de PBS, durante 24 h, en RT.
    9. Stock a +4 °C en 1 mL de PBS y azida de sodio al 0,05% hasta la liquidación.
  4. Limpieza en TDE (2,2′ -Tiodietanol)
    1. Incubar los organoides en 1 mL de TDE al 30% (3 mL de TDE + 7 mL de PBS), durante 24 h, a RT.
    2. Incubar en 1 mL de TDE al 60% (6 mL de TDE + 4 mL de PBS), durante 24 h, a RT.
    3. Incubar en 1 mL de TDE al 80% (8 mL de TDE + 2 mL de PBS), durante 24 h, a RT.
  5. Incrustación de organoides antes de la adquisición de la hoja de luz
    NOTA: Utilice un sistema personalizado; hecho con una jeringa de 1 ml con la punta cortada con un bisturí.
    1. Preparar 100 mL de Agarosa de Baja Fusión al 4% en solución de TDE al 60% y alícuota en tubos de 2 mL. Conservar a +4 °C.
    2. Antes de la incrustación de organoides, precaliente un tubo que contenga 1,5 ml de agarosa de baja fusión al 4% en TDE al 60% en un baño de agua a 37 °C hasta que se licúe.
    3. Mientras tanto, prepare un sistema de moldeo a medida hecho de una jeringa de 1 ml cuya punta se corta con un bisturí.
    4. Bombee en la jeringa 600 μL de la solución de gel con el émbolo.
    5. Coloque la muestra con una punta de pipeta agrandada cuya abertura se haya cortado con tijeras estériles.
    6. Rellene la jeringa con 400 μL de solución de gel para que la muestra se coloque dentro del tercio inferior de la jeringa.
    7. Deje polimerizar el gel y almacene en una solución de TDE al 80% a 4 °C protegida de la luz hasta su adquisición.
    8. Para la adquisición de láminas ligeras, utilice un objetivo 20x inmerso en una solución de TDE al 80% agregada en la cámara de muestra para permitir ajustar con precisión al índice de refracción del método de limpieza.
    9. Inserte la jeringa que contiene el organoide incrustado de agarosa en el soporte de muestra más grande diseñado para acomodar una jeringa de 1 ml cuyo émbolo se puede operar para colocar el organoide frente al objetivo.
      NOTA: La adquisición de láminas ligeras de un organoide completo toma aproximadamente de 5 a 10 minutos.

4. Inmunotinción y limpieza de secciones flotantes de organoides dorsales del cerebro anterior

  1. Fijación, incrustación de agarosa y seccionamiento de los organoides
    1. Recolectar organoides después de 28, 42 y 70 +/- 2 días de diferenciación en una placa de 6 pocillos y fijarlos durante la noche a 4 °C en 2 mL de PFA al 4%.
    2. Enjuague dos veces en 2 ml de PBS y conserve a 4 °C en 2 ml de PBS + azida de sodio al 0,05%.
    3. Incruste los organoides fijos en agarosa de baja fusión al 4% en un molde de incrustación de plástico (7 x 7 mm). Retire con cuidado el bloque de agarosa del molde de plástico y péguelo a la etapa de vibratomo.
    4. Seccionar los organoides incrustados utilizando un vibratomo para obtener secciones de flotación libre de 150 μm transferidas en un pozo de una placa de 24 pocillos que contiene 500 μL de PBS utilizando un pincel para evitar dañar las secciones.
      NOTA: Se recomienda la agarosa de baja fusión ya que su temperatura de fusión es de solo aproximadamente 60 ° C. Prepare agarosa de baja fusión al 4% en solución de PBS y déjela enfriar justo por encima de 37 ° C en un baño de agua antes de la incrustación de organoides.
  2. Permeabilización, bloqueo e inmunotinción
    1. Incubar las secciones en 500 μL de PBS que contengan 0,3% tritón X100, en RT, bajo agitación, durante 20 min. Haz esto tres veces.
    2. Incubar las secciones en 500 μL de PBS que contengan 0,3% de Tritón X100 y 5% de Leche descremada, en RT, bajo agitación, durante 2 h.
    3. Incubar las secciones en 250 μL de solución primaria de anticuerpos (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% leche descremada), bajo agitación, a +4 °C, durante la noche.
    4. Lavar las secciones en 500 μL de PBS, en RT, bajo agitación, durante 20 min. Haz esto cuatro veces.
    5. Incubar las secciones en 250 μL de solución secundaria de anticuerpos (PBS + Tritón X100 al 0,3% + leche descremada al 1%), a RT, bajo agitación, durante 2 h.
    6. Lavar las secciones en 500 μL de PBS, en RT, bajo agitación, durante 20 min. Haz esto cuatro veces.
    7. Almacene las secciones en 500 μL de PBS, a +4 ° C hasta la limpieza.
  3. Limpieza en TDE (2,2′ -Tiodietanol)
    1. Incubar las secciones en 500 μL de 30% y 60% TDE durante 1 h cada una en RT, y luego en 500 μL de TDE al 80% durante la noche, en RT.
    2. Almacene las secciones despejadas en 500 μL de TDE al 80% hasta la adquisición a +4 °C.
  4. Montaje de secciones de flotación libre antes de la adquisición con escaneo resonante confocal
    1. Monte una sección de flotación libre en una cámara sellada que permita mantener la muestra en una solución de TDE al 80% y diseñada para adaptarse a una etapa XY motorizada de microscopios confocales.
    2. Coloque una cubierta redonda en el sistema de cámara.
    3. Transfiera cuidadosamente la sección inmunoteñida despejada con un pincel.
    4. Llene la cámara con una solución de TDE al 80%.
    5. Agregue dos fundas estándar más una segunda funda redonda y un sello de silicona.
    6. Atornille el anillo de atornillado de la cámara para sellar perfectamente el sistema.

5. Hoja de luz y análisis confocal de escaneo resonante

  1. Procese las adquisiciones de hojas de luz y escaneo resonante utilizando un software que permite la visualización y el análisis en 3D de toda la muestra inmunoteñida.
    NOTA: Dicho software permite abrir rápidamente datos enormes para hacer fácilmente instantáneas y animaciones. Permite mover la muestra en diferentes orientaciones y generar vistas 2D gracias a una herramienta de segmentación de datos 2D en diferentes orientaciones, XY y YZ por ejemplo.
  2. Para la detección automática tanto de centrosomas como de cilios primarios, utilice un asistente de manchas que permita cuantificar su número en condiciones patológicas frente a condiciones de control.
  3. Para la reconstrucción 3D de PC que permite una medición precisa de su longitud, use un asistente de filamento para fijar manualmente el punto de partida de la PC y el software utiliza la señal de fluorescencia para reconstruir la PC con precisión.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modelos 2D basados en células hIPS para estudiar la biogénesis y la función del cilio primario
El protocolo aquí detallado ha sido adaptado de estudios publicados anteriormente20,21,22. Este protocolo permite la generación de estructuras de rosetas neurales que contienen progenitores neocorticales y neuronas similares a las observadas en el neocórtex en desarrollo. La validación detallada se puede realizar me...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En la actualidad, los PC se consideran orgánulos clave que regulan pasos cruciales durante el desarrollo cortical cerebral normal18,19,31 incluyendo la expansión y el compromiso de NSPC8,9,10,11,12, así como la migración neuronal13,14

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Agence Nationale de la Recherche (ANR) a S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) y N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 y ANR-19-CE16-0002-01). LB cuenta con el apoyo de la ANR en el marco del programa Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) y la Fondation Bettencourt Schueller (programa MD-PhD). El Imagine Institute cuenta con el apoyo de fondos estatales de la ANR en el marco del programa Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01, proyectos CrossLab) y como parte del segundo programa Investissements d'Avenir (ANR-17-RHUS-0002).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-Mercaptoé etanol (50 mM)ThermoFisher Scientific31350010
6 pocillos Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plate Corning3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment MicroplateCorning7007
B-27 Supplement (50X), sin vitamina AThermoFisher Scientific12587010
B-27 Supplement (50X), sin sueroThermoFisher Scientific17504044
CellAdhere tampón de diluciónStemCell Technologies7183
DMEM/F-12, GlutamaxThermoFisher Scientific31331028
DMSOATCC4-X
DorsomorphinStemCell Technologies72102
Easy Grip 35 10mmFalcon353001
EDTAThermoFisher Scientific15575020
EGF , 25µ gThermofischerPHG0315
FGF2 , 25µ gThermofischerPHG0264
Reactivo de disociación celular suaveStemCell Technologies7174
InsulinaThermoFisher Scientific 12585014
KnockOutSerum ThermoFisher Scientific10828028
Laminina (1 mg)Thermofischer23017015
LDN193189StemCell Technologies72147
Factor de crecimiento Matrigel reducidoCorning354230
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)ThermoFisher Scientific11140050
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381-250G
mTeSR1StemCell Technologies85850
Medio basal neuralThermofischer21103049
Agitador orbitalDutscher 995002
PBSThermoFisher Scientific14190094
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
PFA 32%Ciencias de la microscopía electrónica15714
Poli-L-Ornitina (PO)SigmaP4957
BDNF humano recombinante 10 y micro; gStem Cell Technologies78005
FGF humano recombinante-básicoPeprotech100-18B
rSHHR& D Systems8908-SH
SAGSanta CruzSC-202814
SB431542StemCell Technologies72232
Stembeads FGF2StemCultureSB500
SacarosaSigma AldrichS7903-250G
Superfrost Plus Guías de adhesiónThermo ScientificJ1800AMNZ
Suplé ment N2- (100X)ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2'-tiodiethanolSigma Aldrich166782-500G
VitronectinaStemCell Technologies7180
Y-27632StemCell Technologies72304
Anticuerpos primarios
ARL13BAbcamAb1366481/200e
ARL13BProteintech17711-1-AP1/500e
CTIP2AbcamAb184651/500e
GLI2R& D SystemsAF35261/100
GPR161Proteintech13398-1-AP1/100
N-CadherinBD Transduction Lab6109211/500e
P-VimentinMBLD076-31/500e
PAX6BiolegendPRB-278P1/200e
PCNTAbcamAb44481/1000e
S0X2R& D SystemsMAB20181/200e
SATB2AbcamAb515021/200e
TBR2AbcamAb2168701/400e
TPX2NovusBioNB500-1791/500e
γ TUBULINSigma AldrichT65571/500e
Anticuerpos secundarios
burro anti-conejo AF488ThermoFisher ScientificA212061/500e
Cabra anti-ratón AF555ThermoFisher ScientificA214221/500e
Cabra anti-ratón AF647ThermoFisher ScientificA212361/500E
Cabra antirratas AF555ThermoFisher ScientificA214341/500E

Referencias

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