La oxidación de la proteína tiol tiene implicaciones significativas en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas normales. Describimos los detalles de un método cuantitativo de proteómica redox, que utiliza captura asistida por resina, etiquetado isobárico y espectrometría de masas, lo que permite la identificación y cuantificación de proteínas de cisteína oxidadas reversibles.
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Artículo de método
Captura asistida por resina junto con etiquetado de etiqueta de masa isobárica en tándem para la cuantificación multiplexada de la oxidación de la proteína tiol
En este artículo
Resumen
Resumen
Las modificaciones oxidativas reversibles en los tioles proteicos han surgido recientemente como mediadores importantes de la función celular. Aquí describimos el procedimiento detallado de un método cuantitativo de proteómica redox que utiliza la captura asistida por resina (RAC) en combinación con el etiquetado isobárico de etiqueta de masa en tándem (TMT) y la cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS) para permitir la cuantificación estoquiométrica multiplexada de tioles de proteínas oxidadas a nivel de proteoma. La información cuantitativa específica del sitio sobre residuos de cisteína oxidada proporciona información adicional sobre los impactos funcionales de tales modificaciones.
El flujo de trabajo es adaptable a través de muchos tipos de muestras, incluidas las células cultivadas (por ejemplo, mamíferos, procariotas) y tejidos enteros (por ejemplo, corazón, pulmón, músculo), que inicialmente se lisan / homogeneizan y con tioles libres alquilados para evitar la oxidación artificial. Los tioles de proteínas oxidadas se reducen y capturan mediante una resina de afinidad por tiol, que agiliza y simplifica los pasos del flujo de trabajo al permitir que los procedimientos de digestión, etiquetado y lavado se realicen sin transferencia adicional de proteínas / péptidos. Finalmente, los péptidos marcados son eluyidos y analizados por LC-MS / MS para revelar cambios estequiométricos completos relacionados con la oxidación del tiol en todo el proteoma. Este método mejora en gran medida la comprensión del papel de la regulación dependiente de redox en estados fisiológicos y fisiopatológicos relacionados con la oxidación de proteínas tiol.
Introducción
En condiciones homeostáticas, las células generan especies reactivas de oxígeno, nitrógeno o azufre que ayudan a facilitar procesos, como el metabolismo y la señalización 1,2,3, extendiéndose tanto a procariotas como a eucariotas. Los niveles fisiológicos de estas especies reactivas son necesarios para la función celular adecuada, también conocida como "eustrés"1,4. Por el contrario, un aumento de oxidantes que conduce a un desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes puede causar estrés oxidativo, o "angustia"
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Protocolo
Todos los procedimientos descritos en el protocolo relacionados con muestras/tejidos animales o humanos fueron aprobados y siguieron las directrices institucionales del comité de ética de investigación humana y animal.
1. Homogeneización/lisis de la muestra
- Muestras de tejido congelado
- Picar tejido congelado (~ 30 mg) en un portaobjetos de microscopio de vidrio sobre hielo seco con una cuchilla de afeitar preenfriada y pinzas. Transfiera el tejido picado a un tubo de poliestireno de fondo redondo preenfriado de 5 ml que contenga 700 μL de tampón A (ver Tabla 1) e incube en hielo durante 30 minutos, protegid....
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Resultados
La finalización del protocolo resultará en un enriquecimiento altamente específico de péptidos que contienen cisteína previamente oxidados, a menudo con una especificidad del >95% 27,35,36. Sin embargo, varios pasos clave del protocolo requieren atención especial, por ejemplo, el bloqueo inicial de tioles libres antes de la lisis/homogeneización de la muestra, que prohíbe la oxidación artificial y el enriquecimiento no especí.......
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Discusión
La captura asistida por resina se ha utilizado en una variedad de tipos de muestras y sistemas biológicos para la investigación de modificaciones oxidativas de residuos de cisteína25,29,30. Este método permite la evaluación de muestras en múltiples niveles y lecturas, incluyendo proteínas y péptidos utilizando SDS-PAGE y análisis de Western blot, así como sitios individuales de cisteína utilizando espectrometría de masas. Indepe.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses, financieros o de otro tipo.
Agradecimientos
Partes del trabajo fueron apoyadas por las subvenciones de los NIH R01 DK122160, R01 HL139335 y U24 DK112349
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Clorhidrato de 2-(piridilitio)etilamina | Med Chem Express | HY-101794 | Reactivo para la síntesis interna de resinas |
| Tubos de centrífuga LoBind de 2,0 mL Tubos de centrífuga LoBind | 22431048 | Eppendorf | |
| de 5,0 mL | Eppendorf | 30108310 | |
| 5,0 mL Acetona | Falcon | 352054 | |
| Fisher | Scientific | A949-1 | |
| acetonitrilo | Sigma Aldrich | 34998 | |
| tiol activado; Sepharose 4B | Sigma Aldrich | T8512 | Posible sustituto de la resina de afinidad |
| tiol Amicon Ultra Filtro centrífugo de 0,5 ml | Millipore Sigma UFC5010BK | ||
| Bicarbonato de amonio | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ácido bicincónico (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | Centrífuga de reactivos para ensayo de proteínas |
| Eppendorf | 5810R | ||
| Centrífuga | Eppendorf | 5415R | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Tampón HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Homogeneizador | BioSpec Productos | 985370 | |
| Yodoacetimida (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| N-etilmaleimida | Sigma Aldrich | 4259 | |
| NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow | Cytiva | 17-0906-01 | Reactivo para la síntesis interna de resinas |
| QIAvac 24 Plus colector de vacío | Qiagen | 19413 | |
| Cloruro de sodio | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Sigma Aldrich | L6026 | |
| Sonicator | Branson | 1510R-MT | |
| Columnas de centrifugado | Thermo Scientific | 69705 | |
| Strata C18-E Columnas de fase inversa | Phenomenex | 8B-S001-DAK | Desalinizador de péptidos |
| Thermomixer | Eppendorf | 5355 | |
| Thiopropyl Sepharose 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | resina de afinidad con tiol; *El fabricante ha interrumpido la producción de resina de tiopropil sepharose 6B (consulte el protocolo para obtener más detalles). |
| Marcadores isobáricos TMT (16 plex) | Thermo Scientific | A44522 | Reactivo de marcado de péptidos; disponible en múltiples formatos Tampón de |
| bicarbonato de trietilamonio (TEAB) | Sigma Aldrich | T7408 | |
| Ácido trifluoroacético (TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tripsina | Promega | V5820 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Vacufuge Plus speedvac | Eppendorf | 22820001 | concentrador |
| vacío Mezclador de vórtice Scientific | Industries | SI-0236 |
Referencias
- Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
- Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. Reactive nitrogen species in cellular s....
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Reimpresiones y permisos
