In vivo Función de los subconjuntos diferenciales de células dendríticas cutáneas para inducir inmunidad Th17 en la infección intradérmica por Candida albicans

Resumen

Aquí, demostramos la función in vivo de los subconjuntos de células dendríticas cutáneas en la inmunidad Th17 de la infección dérmica profunda por Candida albicans .

Resumen

La piel es el órgano de barrera más externo del cuerpo, que contiene varios tipos de células dendríticas (CD), un grupo de células presentadoras de antígenos profesionales. Cuando la piel se encuentra con patógenos invasores, diferentes CD cutáneas inician una respuesta inmunitaria distinta de las células T para proteger el cuerpo. Entre los patógenos invasores, la infección fúngica impulsa específicamente una respuesta inmunitaria protectora Th17 productora de interleucina-17. Se desarrolló un protocolo para diferenciar eficientemente las células Th17 por infección intradérmica por Candida albicans para investigar un subconjunto de CD cutáneas responsables de inducir la inmunidad Th17. La citometría de flujo y los análisis de expresión génica revelaron una inducción prominente de la respuesta inmunitaria Th17 en los ganglios linfáticos que drenan la piel y en la piel infectada. Utilizando cepas de ratón que agotan el subconjunto de DC inducidas por la toxina diftérica, se descubrió que las DC dérmicas CD301b⁺ eran responsables del montaje de la diferenciación óptima de Th17 en este modelo. Por lo tanto, este protocolo proporciona un método valioso para estudiar la función in vivo de subconjuntos diferenciales de CD cutáneas para determinar la inmunidad Th17 contra la infección fúngica profunda de la piel.

Introducción

La piel es el órgano barrera más externo, que protege al cuerpo de los patógenos y estímulos externos invasores¹. La piel se compone de dos capas distintas, que incluyen la epidermis, un epitelio estratificado de queratinocitos, y la dermis subyacente, una densa red de colágeno y otros componentes estructurales. Como tejido de barrera epitelial primario, la piel proporciona principalmente barreras físicas y contribuye a barreras inmunológicas adicionales, ya que contiene numerosas células inmunitarias residentes ^2,3. Entre las células inmunitarias cutáneas, las células dendríticas (CD) son un tipo de células presentadoras de antígenos profesionales, que absorben activamente antígenos propios y no propios y migran a los ganglios linfáticos regionales (LN) para iniciar respuestas y tolerancia de células T específicas de antígeno de acuerdo con la naturaleza de los antígenos⁴.

La piel alberga células presentadoras de antígenos epidérmicos, a saber, las células de Langerhans (LC) y al menos dos tipos de CD, incluidas las CD convencionales dérmicas de tipo 1 (cDC1) y las DC convencionales dérmicas de tipo 2 (cDC2)⁵. Las LC epidérmicas son de origen monocítico embrionario y mantienen su número de células por autoperpetuación en condiciones homeostáticas⁶. Por el contrario, las cDC1 y cDC2 dérmicas son de origen de células madre hematopoyéticas y son repuestas continuamente por progenitores comprometidos con DC⁵. Las CD cutáneas se caracterizan por sus marcadores de superficie, divididos aproximadamente en poblaciones de Langerina⁺ (incluyendo LCs y cDC1) y CD11b⁺Langerina^- (principalmente cDC2). Además, este grupo ha revelado que la población CD11b⁺Langerin-DC se clasifica a su vez en dos subconjuntos según la expresión⁷ de CD301b.

Las características funcionales importantes de las CD cutáneas se centran en una división del trabajo, determinada principalmente por la naturaleza intrínseca de cada subconjunto de CD, la ubicación in situ de las CD, el microambiente tisular y las señales inflamatorias locales⁸. Estas características funcionales de las CD cutáneas requieren la investigación del papel de subconjuntos específicos de CD durante ciertos tipos de respuesta inmunitaria de la piel. Tras la estimulación antigénica por CDs cutáneas en las LN drenantes, los linfocitos T CD4⁺ vírgenes se diferencian en subconjuntos específicos de linfocitos T colaboradores, que producen un conjunto de citocinas definidas para ejercer su función efectora⁹. Entre los subconjuntos de linfocitos T colaboradores CD4⁺, los linfocitos Th17 productores de interleucina-17 (IL-17) desempeñan un papel crucial en las enfermedades autoinmunes y la inmunidad antifúngica¹⁰. En este sentido, la infección fúngica cutánea ha sido un modelo robusto para estudiar la inmunidad Th17 in vivo 11,12,13. Cuando las pieles con cinta adhesiva se exponen epicutáneamente a la levadura Candida albicans (C. albicans), las LC epidérmicas desempeñan un papel fundamental en la diferenciación Th17 específica del antígeno¹⁴.

La inmunidad protectora contra la infección intradérmica por C. albicans requiere inmunidad innata, como la actividad fibrinolítica de fibroblastos y fagocitos¹⁵. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel de los subconjuntos cutáneos de DC en el establecimiento de la inmunidad Th17 en la infección dérmica profunda por C. albicans . En este trabajo se describe un método de infección cutánea intradérmica de C. albicans, que produce respuestas inmunitarias locales y regionales Th17. La aplicación de cepas de ratón con depleción del subconjunto de DC inducida por la toxina diftérica (DT) reveló que las DC dérmicas CD301b⁺ son cruciales para la inmunidad Th17 en este modelo. El enfoque descrito aquí permite el estudio de la respuesta Th17 a la infección fúngica invasiva dérmica profunda.

Protocolo

NOTA: Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Institución (IACUC, ID de aprobación: 2019-0056, 2019-0055). Para este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6 de tipo salvaje (WT) de siete a 9 semanas de edad con un peso de 18 a 24 g. Algunos estudios se realizaron con ratones hembra con receptor de toxina Langerina-difteria (DTR) y CD301b-DTR de la misma edad y peso. Se utilizaron de cuatro a seis ratones en cada grupo para un experimento, y los datos son representativos de tres experimentos independientes. Este trabajo se realizó bajo condiciones de Nivel 3 de Bioseguridad, que también podría realizarse bajo condiciones de Nivel 2 de Bioseguridad de acuerdo a los lineamientos institucionales (temperatura ambiente 23 °C ± 3 °C, humedad 50% ± 10%).

1. Preparación de Candida albicans

NOTA: Los experimentos de esta sección se realizaron en una cabina de seguridad biológica.

1. Streak C. albicans cuela SC5314 en una placa de agar levadura-peptona-dextrosa-adenina (YPDA) utilizando un asa de inoculación y una aguja.
2. Incubar la placa boca abajo durante 2 días a 30 °C.
   NOTA: La placa de agar YPDA con C. albicans se puede almacenar a 4 °C hasta por 1 mes.
3. Aísle una sola colonia de la placa para inocularla en 10 mL de medio YPDA en un tubo de 50 mL utilizando una punta de pipeta estéril.
4. Incubar a 30 °C con agitación a 230-250 rpm durante ~17 h.
5. Coloque la suspensión de levadura en una cubeta y mida la densidad óptica (OD) a 600 nm cada 30 min utilizando un espectrofotómetro UV-VIS hasta que el OD₆₀₀ alcance 1,5-2,0.
   NOTA: Este paso puede tardar entre 16 y 18 h.
6. Girar la suspensión de levadura a 1000 × g durante 5 min.
7. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células de levadura en una cantidad adecuada de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
8. Cuente las células de C. albicans con un hemocitómetro y centrifuga la suspensión a 1000 × g durante 5 min.
9. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células de C. albicans en PBS a una concentración de 1 × 10⁷ células en 40 μL de PBS por almohadilla de pie.
10. Para la preparación de C. albicans matada por calor (HK), mate las células de levadura calentándolas a 65 °C durante 60 min utilizando un mezclador de calentamiento después de determinar el número de células.

2. Infección de la almohadilla del ratón con C. albicans

Figura 1: Diagrama esquemático del modelo de infección intradérmica por Candida albicans . (A) Las almohadillas traseras de los ratones se inyectaron por vía intradérmica con 1 × 10⁷ C. albicans. Después de 7 días, las almohadillas de los ratones se volvieron a exponer a 1 × 10⁷ HK C. albicans mediante inyección intradérmica, y la respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado se midió 24 h después de la exposición al antígeno. Se analizó la respuesta inmune local durante la sensibilización a C. albicans después de 7 días en LN que drenan la piel. (B, C) Imágenes de almohadillas para los pies antes de la inyección intradérmica de las almohadillas para los pies con C. albicans. (D, E) Inyección de C. albicans en la dermis profunda de la almohadilla del pie derecho. (F, G) Signos clínicos de enrojecimiento e hinchazón después de la inyección de la almohadilla derecha. (H) Un croquis que muestra las vías linfáticas desde la almohadilla del pie hasta los LN poplíteos después de la inyección de C. albicans . (I) LN poplíteas expuestas ubicadas detrás de la rodilla 7 días después de la inyección de C. albicans y (J) sin inyección. Abreviaturas: HK = muerto por calor; LNs = ganglios linfáticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Anestesiar a los ratones con isoflurano en una cámara de inducción hasta que los ratones tengan una frecuencia respiratoria lenta y no muestren respuestas de abstinencia a los pinzamientos de los dedos de los pies o la cola.
   NOTA: Durante la anestesia, se recomienda un ungüento ocular para prevenir la sequedad ocular, especialmente para anestesias que duran más de 5 minutos.
2. Retire el tapón de una aguja de 31 g y cargue la jeringa de insulina de 0,3 ml con C . albicans preparada del paso 1.9 después de mezclar las células.
3. Retire el ratón anestesiado de la cámara de inducción e inyecte suavemente 40 μL de las células de levadura (1 × 10⁷ células) en la dermis profunda de la almohadilla del pie derecho para la sensibilización a C. albicans .
   NOTA: El volumen máximo que se puede inyectar en una almohadilla para los pies es de 50 μL.
4. Retire lentamente la aguja de la jeringa del lugar de la inyección.
5. Coloque a cada ratón solo en una jaula hasta que se haya recuperado por completo de la anestesia y luego devuélvalo de manera segura a la jaula doméstica.
6. Para desarrollar una respuesta específica de antígeno a C. albicans , se debe desafiar la almohadilla del pie derecho de los ratones con el HK C. albicans preparado mediante inyección intradérmica 7 días después de la sensibilización, como se describió anteriormente (1 × 10⁷ células; 40 μL por almohadilla del pie; repetir los pasos 2.1-2.5).
7. Recoja los LN que drenan la piel 7 días después de la sensibilización a C. albicans o de los tejidos lesionales de las almohadillas de los pies 24 h después de la exposición al antígeno después de la eutanasia en una cámara de CO₂ .

3. Depleción de células dendríticas in vivo inducida por toxina diftérica

NOTA: En este estudio, tanto los ratones Langerin-DTR como CD301b-DTR fueron tratados con DT 1 día antes y después de la sensibilización intradérmica a C. albicans.

1. Prepare una solución de 10 μg/mL de DT en PBS.
2. Retire la tapa de la aguja de una jeringa de insulina de 1 ml, mezcle la DT y llene la jeringa con la DT.
3. Sujete adecuadamente a los ratones en una posición con la cabeza hacia abajo.
4. Desinfectar la cara ventral de los ratones con etanol al 70%.
5. Inyecte lentamente a cada ratón 100 μL de 1 μg de DT por vía intraperitoneal en el cuadrante inferior izquierdo del abdomen para agotar subconjuntos específicos de células dendríticas.
   NOTA: Tenga cuidado de no dañar los órganos durante la inyección.
6. Espere 5 s; Luego, retire lentamente la aguja.

4. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real

1. Coloque el ratón en una cámara de CO₂ hasta que no se observe ningún movimiento respiratorio.
2. Desinfecte el ratón con etanol al 70% y corte la lesión de la piel de la almohadilla de la pata trasera en pedazos pequeños con pinzas y tijeras.
3. Sumerja completamente los tejidos cortados en el reactivo de aislamiento de ARN.
4. Homogeneizar las muestras utilizando un homogeneizador de tejidos según las instrucciones del fabricante (2 ciclos de 3 min a 30 Hz).
   NOTA: En este estudio se utilizaron perlas de acero inoxidable para la lisis de tejidos.
5. Centrifugar a 10.000 × g durante 5 min, 4 °C.
6. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un tubo nuevo.
7. Aísle el ARN total de la piel lesional utilizando un kit de aislamiento de ARN total.
8. Determine la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro UV-Vis.
9. Sintetice ADNc utilizando un kit de transcripción inversa para la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) cuantitativa en tiempo real.
10. Realice qPCR en tiempo real con el sistema de PCR en tiempo real mediante la monitorización de la síntesis de ADN bicatenario durante los ciclos de PCR utilizando colorante fluorescente verde.
    NOTA: En este estudio, los resultados se normalizaron al nivel de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Hprt). Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 1 y el protocolo de PCR es el siguiente: desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s, amplificación durante 42 ciclos (95 °C durante 5 s, 60 °C durante 30 s).

5. Aislamiento celular y análisis de citometría de flujo

1. Después de la eutanasia con CO₂ , diseccione los ratones con pinzas y tijeras, exponiendo y extrayendo cuidadosamente los LN que drenan las almohadillas de los pies llamados LN poplíteos, ubicados detrás de la rodilla.
2. Prepare suspensiones unicelulares a partir de los LN drenantes de la almohadilla de cada ratón filtrando los tejidos a través de un colador de 70 μm después de la homogeneización utilizando el émbolo de una jeringa de 3 mL.
3. Lavar las células con PBS y centrifugar a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
4. Deseche el sobrenadante y vuelva a lavar las células con PBS.
5. Centrifugar a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
6. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un medio RPMI-10 completo que contenga 55 μM de β-mercaptoetanol, 50 ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y 500 ng/mL de ionomicina en una placa de 24 pocillos para la estimulación de células T.
7. Después de 1 h, agregue 10 μg/mL de brefeldina A y 1000x monensina a la suspensión celular y al cultivo durante 5 h adicionales.
8. Recoja las células y lávelas con tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS).
9. Girar a 500 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
10. Teñir las células muertas con un colorante fijable para tinción de células muertas e incubar durante 30 min a 4 °C.
11. Lavar las muestras con tampón FACS y centrifugarlas a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
12. Deseche el sobrenadante y tiña las células con anticuerpos marcadores de superficie conjugados con fluorocromo y bloqueadores del receptor Fc durante 30 min a 4 °C.
13. Lavar las muestras con tampón FACS y centrifugarlas a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
14. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células peletizadas en solución de fijación y permeabilización durante 15-20 min a 4 °C para la tinción intracelular.
15. Lavar las muestras con tampón de lavado 1x y centrifugarlas a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
16. Deseche el sobrenadante y realice la tinción de citocinas intracelulares durante 30 min a 4 °C.
17. Lavar las muestras con 1x tampón de lavado y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
18. Vuelva a suspender las células en el volumen adecuado (200-300 μL) de tampón FACS.
19. Analice la expresión de proteínas mediante citometría de flujo.

Resultados

Aquí, demostramos un modelo de infección intradérmica de C. albicans para estudiar el papel de la respuesta inmune Th17 mediada por DC cutánea in vivo. Después de una inyección intradérmica inicial con C. albicans en la almohadilla del pie, las LN que drenan la piel se agrandaron (Figura 2A). Durante el período de sensibilización, la proporción de linfocitos T efectores CD4⁺ a CD8⁺ aumentó notablemente (Figura 2B,C

Discusión

En este trabajo se describe un método de infección intradérmica por C. albicans que permite estudiar el papel de las CD cutáneas en la respuesta inmune Th17 in vivo. Mediante la aplicación de un análisis citométrico de flujo multiparamétrico con cepas de ratón inducidas por DT, descubrimos que las DC dérmicas CD301b⁺ son un subconjunto cutáneo de DC crucial para iniciar la inmunidad Th17 contra la infección dérmica profunda por C. albicans . Además, ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de insulina de 0,3 ml (31 g)	; BD	328822
1x  Tampón de permanente/lavado	BD	554723
jeringa de 1 mL (30 G) jeringa de insulina	BD	328818
24 pocillos	Falcon	353047
50 mL tubo cónico	Falcon	50050
70 μ filtro m	Falcon	352350
70% etanol
ABI Sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus	Biosystems
aplicados Cámara de anestesia	Harvard Apparatus
Brefeldin A	BD	BD
β-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Candida albicans cepa SC5314			proporcionada por Daniel Kaplan en la Universidad de Pittsburgh
CD3	BioLegend	100216	Clon 17A2
CD301b-DTR			ratones proporcionados por Akiko Iwasaki en la Universidad de Yale
CD4	BioLegend		100408 Clon GK1.5
CD44	eBioscience	47-0441-80	Clon IM7
CD8a	BD Biosciences		553031 Clon 53.6.7
Centrífuga
Contador
Cubeta	Kartell	KA.1938
Solución Cytofix/Cytoperm	BD	554722
Toxina diftérica (DT)	Solución
Dulbecco (DPBS)	Welgene	LB001-02
Tampón FACS (clasificación celular activada por fluorescencia)	Bloqueador interno
receptor Fc	BD	553142
Suero fetal bovino (FBS)	Welgene	S101-07
Pinzas	Roboz		para la extracción de muestras
Hemocitómetro	Fisher Scientific	267110
Kit de ARN total Hybrid-R	GeneAll Biotechnology	305-101
hidroxietil piperazina etano sulfónico ácido (HEPES)	Gibco	15630-080
IL-17A (citocina intracelular)	BioLegend	506912	Clon TC11-18H10.1
Ionomicina	Sigma	I0634
Isoflurano
Langerin-DTR			proporcionado por Heung Kyu Lee en el Instituto Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L34957
Loop and Needle	SPL	90010
Monensin	BD	BD554724
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Penicilina	Gibco	15140-122
Placa de Petri	SPL	10090
Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Sigma	P8139
PrimeScript RT Master Mix Takara	Bio	RR360A
RPMI 1640	Gibco	11875-093
Tijeras	Roboz		para la recolección de muestras
Perlas de acero inoxidable, 5 mm	QIAGEN	69989
			pipeta estéril
SYBR Green Premix Ex Taq II	Takara Bio	RR820A
TCRβ	BioLegend	109228	Clon H57-597
ThermoMixer  C	Eppendorf
TissueLyser	Espectrofotómetro QIAGEN
UV-VIS	PerkinElmer
Wild-type C57BL/6  ratones	Orient Bio		utilizaron ratones de 7 a 9 semanas de edad
Medio de levadura-peptona-dextrosa-adenina (YPDA), líquido, estéril (1% de extracto de levadura, 2% de peptona Bacto, 2% dextrosa)
Placa de agar YPDA, estéril (1% extracto de levadura, 2% Bacto peptona, 2% dextrosa, 2% Bacto agar)