Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Shuttle Box Assay som et associativt læringsværktøj til kognitiv vurdering i lærings- og hukommelsesstudier ved hjælp af voksne zebrafisk

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62745
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Zebrafish Research, University of Notre Dame, 3Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Notre Dame

Summary

Læring og hukommelse er potente målinger i at studere enten udviklings-, sygdomsafhængige, eller miljømæssigt inducerede kognitive funktionsnedsættelser. De fleste kognitive vurderinger kræver specialiseret udstyr og omfattende tidsforpligtelser. Men shuttle box assay er en associativ læring værktøj, der udnytter en konventionel gel boks for hurtig og pålidelig vurdering af voksne zebrafisk kognition.

Abstract

Kognitive underskud, herunder nedsat læring og hukommelse, er et primært symptom på forskellige udviklings- og aldersrelaterede neurodegenerative sygdomme og traumatisk hjerneskade (TBI). Zebrafisk er en vigtig neurovidenskabsmodel på grund af deres gennemsigtighed under udvikling og robuste regenerative evner efter neurotrauma. Mens forskellige kognitive tests findes i zebrafisk, de fleste af de kognitive vurderinger, der er hurtige undersøge ikke-associativ læring. På samme tid, associative-learning assays ofte kræver flere dage eller uger. Her beskriver vi en hurtig associativ læringstest, der udnytter en negativ stimulus (elektrisk stød) og kræver minimal forberedelsestid. Shuttle box assay, præsenteret her, er enkel, ideel til nybegyndere efterforskere, og kræver minimalt udstyr. Vi viser, at denne shuttle box test efter TBI reroducibly vurderer kognitive underskud og genopretning fra unge til gamle zebrafisk. Derudover er analysen kan tilpasses til at undersøge enten øjeblikkelig eller forsinket hukommelse. Vi viser, at både en enkelt TBI og gentagne TBI-hændelser påvirker læring og øjeblikkelig hukommelse negativt, men ikke forsinket hukommelse. Vi konkluderer derfor, at shuttle box assay reproducerer progression og genopretning af kognitiv svækkelse.

Introduction

Læring og hukommelse bruges rutinemæssigt som målinger af kognitiv svækkelse, hvilket sker på grund af aldring, neurodegenerativ sygdom eller skade. Traumatiske hjerneskader (TBIs) er den mest almindelige skade, der resulterer i kognitive underskud. TBIs er af stigende bekymring på grund af deres tilknytning til flere neurodegenerative lidelser, såsom frontotemporal demens og Parkinsons sygdom1,2. Derudover tyder de øgede beta-amyloidaggregationer observeret hos nogle TBI-patienter på, at det også kan være forbundet med udviklingen af Alzheimers sygdom3,4. TBIs er ofte resultatet af stump-force traumer og spænder over en række sværhedsgrader5, med milde hjerneskader (miTBI) er den mest almindelige. MiTBIs er dog ofte urapporterede og fejldiagnosticeret, fordi de resulterer i mindre kognitive svækkelser i kun en kort periode, og de sårede personer kommer sig normalt fuldt6. I modsætning hertil har gentagne miTBI-hændelser været en voksende bekymring, fordi det er meget udbredt hos unge og midaldrende voksne, kan akkumuleres over tid7, kan forringe kognitiv udvikling og forværre neurodegenerative sygdomme1,2,3,4,5 ,svarendetil personer, der oplever enten en moderat eller alvorlig TBI8.

Zebrafisk (Danio rerio) er en nyttig model til at udforske en række emner inden for neurovidenskab, herunder evnen til at regenerere tabte eller beskadigede neuroner i hele centralnervesystemet9,10,11,12,13. Neural regenerering blev også demonstreret i telencephalon, som indeholder archipallium i den dorsale-indre region. Denne neuroanatomiske region svarer til hippocampus og er sandsynligvis nødvendig for kognition i fisk og for den korte tid hukommelse hos mennesker14,15,16. Desuden har zebrafisk adfærd været omfattende karakteriseret og katalogiseret17. Læring er blevet undersøgt gennem forskellige teknikker, herunder habituation til forskrækkelse svar18, som kan repræsentere en hurtig form for ikke-associativ læring, når de udføres i korte blokke og med opmærksomhed på den hurtige henfaldstid19. Mere komplekse test af associativ læring, såsom T-bokse, plus-labyrinter og visuel diskrimination20,21 bruges, men ofte er tidskrævende, kræver dage eller ugers forberedelse og er afhængige af stime eller positiv forstærkning. Her beskriver vi et hurtigt paradigme for at vurdere både associativ læring og enten øjeblikkelig eller forsinket hukommelse. Denne shuttle box assay bruger en aversiv stimulus og negativ forstærkning konditionering til at vurdere kognitive underskud og nyttiggørelse efter stump kraft TBI. Vi viser, at ubeskadiget kontrol voksen zebrafisk (8-24 måneder) reproducere lære at undgå rødt lys inden for 20 forsøg (<20 minutters vurdering) i shuttle box, med en høj grad af konsistens på tværs af observatører. Derudover, ved hjælp af shuttle boks vi viser, at læring og hukommelse evner på tværs af voksne (8-24 måneder gamle) er konsekvente og er nyttige til assaying kognition med betydelige funktionsnedsættelser mellem enten forskellige TBI sværhedsgrader eller gentagne TBI. Desuden kan denne metode hurtigt anvendes som en metrik til at spore en bred vifte af sygdomsprogressioner eller effekten af lægemiddelinterventioner, der påvirker vedligeholdelse eller genopretning af kognition hos voksne zebrafisk.

Her giver vi et instruktionsoverblik over en hurtig kognitiv vurdering, der kan undersøge både kompleks associativ læring (afsnit 1) og hukommelse i form af både øjeblikkelig og forsinket hukommelse. Dette paradigme giver en vurdering af den korte og langsigtede hukommelse af en lært associativ kognitiv opgave (afsnit 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Zebrafisk blev opdrættet og vedligeholdt i Notre Dame Zebrafish facilitet i Freimann Life Sciences Center. De metoder, der er beskrevet i dette manuskript blev godkendt af University of Notre Dame Animal Care and Use Committee (Animal Welfare Assurance Number A3093-01).

1. Shuttle box learning paradigme (Figur 1A)

BEMÆRK: Læringsparadigmet giver en hurtig vurdering af kognition med hensyn til associativ læring.

  1. Forbered rumfærgen boksen ved at ændre en 30,5 x 19 x 7,5 cm gel boks med en 5 x 19 cm stykke akvarium kvalitet plexiglas tilføjet til hver side i en 45 ° vinkel. Lav en linje, der markerer tankens halvvejspunkt for at vurdere, hvornår fisk har krydset midten af tanken (Figur 1B).
  2. Tilsæt 800 mL systemvand til rumfærgen. Gør dette vand ved at opløse 60 mg Instant Ocean i 1 L deioniseret RO vand. Fyld vandet til midten af tanken til en dybde på 5 cm.
    BEMÆRK: Udskift med ferskvand ved 28 °C hver h eller efter test af 3 fisk.
  3. Placer 2-3 fisk i en bedrift tank, der indeholder systemvand, der er placeret i et mørkt rum, hvor shuttle box assay vil blive udført.
    1. I det mørke rum skal du placere 1 fisk i midten af rumfærgeboksen, fastgør låget og fastgør elektroderne til en strømforsyning.
      BEMÆRK: Rummet skal forblive så mørkt som muligt under akklimatiseret og test.
  4. Akklimatificer fisken i rumfærgen i 15 minutter.
    BEMÆRK: Investigator bør forblive i rummet i akklimatationsperioden eller stille vende tilbage til testrummet med rigelig tid før testen for at give fisk mulighed for at tilpasse sig investigatorens tilstedeværelse. Vellykket akklimatering kan overvejes, når fisken frit udforsker tanken.
    1. Hvis fisken ikke udforsker, skal du fortsætte akklimateringen i yderligere 15 minutter. Hvis fisken stadig ikke akklimatificer sig til rumfærgen, skal du fjerne fisken. Brug ikke denne fisk til test.
  5. Manuelt skinne en 800-lumen rød linse lommelygte ~ 2 cm fra gel box væggen på den side besat af fisken, efter akklimatiseret.
    BEMÆRK: Start ikke et forsøg, hvis fisken hviler ved siden af platintråden mod væggen nær de dybe ender af rumfærgeboksen.
  6. Shine lyset stimulus direkte på fisken og manuelt følge enhver lateral bevægelse af fisken med lyset for at sikre løbende visualisering af stimulus (Figur 1C). Fortsæt med at give lys stimulus, indtil en af følgende betingelser er opfyldt.
    1. Overvej sporet vellykket, hvis fisken krydser over halvvejs punkt af tanken inden for 15 s af lys eksponering. Når fisken krydser halvvejspunktet, skal du straks stoppe lysstimulansen (Figur 1D).
    2. Overvej sporet som mislykket, hvis fisken ikke krydser over halvvejs i kassen i 15 s. I dette tilfælde skal du bruge en elektroforese strømforsyning til at anvende en negativ stød stimulus (20 mV:1 A) skiftevis 2 s on, 2 s off i en 15 s periode (højst 4 stød), eller indtil fisken passerer halvvejs punkt af kassen, hvorefter opsige både lys og negativ stimulus.
  7. Lad fisken hvile i 30 s og gentag trin (r) 1.5-1.6.2. Føre en detaljeret fortegnelse over rækkefølgen af vellykkede forsøg (1.6.1) og mislykkede forsøg (1.6.2).
    BEMÆRK: Her definerede vi læring som afslutningen af 5 vellykkede forsøg i træk. Når læringen er blevet demonstreret, skal fisken fjernes fra rumfærgeboksen og humant aflives.

2. Hukommelse paradigme (Figur 1A)

BEMÆRK: Dette paradigme giver en vurdering af den korte og langsigtede hukommelse af en lært associativ kognitiv opgave.

  1. Uddannelsesperiode
    1. Tilsæt 800 mL systemvand til rumfærgen. Gør dette vand ved at opløse 60 mg Instant Ocean i 1 L deioniseret RO vand. Fyld vandet til midten af tanken til en dybde på 5 cm.
      BEMÆRK: Vand skal udskiftes med ferskvand ved 28 °C hver h eller efter test af 3 fisk.
    2. Placer 2-3 fisk i en bedrift tank, der indeholder system vand, der er placeret i et mørkt rum, hvor shuttle box assay vil blive udført.
    3. I det mørke rum skal du placere 1 fisk i midten af rumfærgeboksen, fastgør låget og fastgør elektroderne til en strømforsyning.
      BEMÆRK: Rummet skal forblive så mørkt som muligt under akklimatiseret og test.
    4. Akklimatificer fisk i rumfærgen i 15 minutter.
      BEMÆRK: Investigator bør forblive i rummet i akklimatationsperioden eller stille vende tilbage til testrummet med rigelig tid før test for at give fisk mulighed for at tilpasse sig investigators tilstedeværelse. Bestem vellykket akklimatering, når fisken frit udforsker tanken.
    5. Hvis fisken ikke udforsker, skal du fortsætte akklimateringen i yderligere 15 minutter. Hvis fisken stadig ikke akklimatificer sig til rumfærgen, skal du fjerne fisken og ikke bruge den til test.
    6. Efter den vellykkede akklimatering, manuelt skinne en 800-lumen rød linse lommelygte ~ 2 cm fra gel box sidevæg, på den side af shuttle boks, der er besat af fisk.
    7. Skinne lyset stimulus direkte på fisken og følg enhver lateral bevægelse af fisken med lyset for at sikre løbende visualisering af stimulus af fisken.
    8. Mens lyset skinner på fisken, samtidig anvende den negative chok stimulus (20 mV:1 A) skiftevis 2 s On, 2 s Off for 15 s (maksimalt 4 stød), eller indtil fisken passerer halvvejs punkt af kassen. Når dette er opnået, opsige både lyset og den negative stimulus.
      BEMÆRK: Lad fiskene hvile i 30 s og derefter gentage trin 2.1.6-2.1.8 for 25 gentagelser (figur 1A).
  2. Indledende test
    1. Tillad 15 minutters hvile til fisken efter træningsperioden. Fjern dem ikke fra rumfærgen. Test den indledende hukommelsesopbevaring ved at registrere hver prøve som strengt bestået/mislykkes umiddelbart efter denne hvileperiode.
    2. Anvend kun lys stimulus i op til 15 s og registrere svarene som følger.
      1. Overvej forsøget vellykket, hvis fisken krydser over halvvejs punkt af shuttle boksen inden for 15 s efter start lyset stimulus. Stop lyset stimulus straks, når fisken krydser halvvejs punkt.
      2. Overvej forsøget som mislykket, hvis fisken ikke krydser over halvvejs punkt af shuttle boks 15 s efter start af lys stimulus. Stop lys stimulus efter 15 s.
        BEMÆRK: Under den indledende test anvendes der ikke en negativ stimulus efter et mislykket forsøg.
    3. Gentag trin 2.2.2 med en hvileperiode på 30 s mellem forsøg og registrer vellykkede forsøg (2.2.2.1) og mislykkede forsøg (2.2.2.2) på tværs af 25 forsøg. Denne værdi vil tjene som en individuel reference for hver fisk.
  3. Umiddelbar hukommelse
    1. Fremkalde skader umiddelbart efter den første testperiode ved foretrukne skader paradigme (f.eks en stump kraft traumer ved hjælp af den modificerede Marmarou vægt drop). Hus fisk individuelt for en nem identifikation. Registrer deres oprindelige testværdier og returnere fisk til dyreanlægget.
      BEMÆRK: Fisk blev såret af stump kraft TBI som tidligere beskrevet22.
    2. Saml 2-3 ubeskadigede eller TBI fisk 4 timer efter indledende test og/eller 4 timer efter skaden (eller ved den pågældende forsøgsfrist) fra dyreanlægget. Opbevar alle fisk i det mørke rum i individuelle tanke, der indeholder systemvand.
    3. Placer fisk i midten af rumfærgen boksen (tilberedt med systemvand som beskrevet i 1.1), en fisk ad gangen, og fastgør låget. Fastgør strømforsyningen og lad fisken akklimatificere i 15 minutter.
    4. Efter akklimatiseret, vurdere øjeblikkelig hukommelse (strengt pass / fail) ved at anvende kun lys stimulus for op til 15 s og registrere svarene som følger.
      1. Overvej forsøget vellykket, hvis fisken krydser over halvvejs i kassen inden for 15 s testperioden. Afslut lysstimulansen ved at krydse halvvejspunktet.
      2. Betragt forsøget som mislykket, hvis fisken ikke krydser over halvvejs i kassen inden for 15 s for at starte lysstimulansen. Afslut lys stimulus efter 15 s periode er overstået.
        BEMÆRK: Under denne test efter skaden anvendes der ikke negativ chok stimulus ikke efter et mislykket forsøg.
    5. Gentag trin 2.3.4 med en hvileperiode på 30 s mellem forsøg, og registrer antallet af vellykkede forsøg (2.3.4.1) og mislykkede forsøg (2.3.4.2) på tværs af 25 forsøg.
    6. Beregn procentforskellen i vellykkede forsøg efter skaden i den indledende testperiode ved hjælp af ligningen:
      Equation 1
  4. Forsinket hukommelse
    1. Returfisk, der er anbragt individuelt for nem identifikation og registrering af deres oprindelige testværdier, til dyreanlægget umiddelbart efter den indledende testperiode.
    2. Tillad fisk 4 dage (eller den pågældende eksperimentelle tidsramme) mellem den første test og skade og/eller forsinket hukommelsestest.
    3. Inducer skade ved det foretrukne skadesparadigme (såsom det modificerede Marmarou-vægtfald for at fremkalde et stumpt krafttraume). Hus fisk individuelt for nem identifikation af indledende testværdier, og returnere fisk til dyreanlægget.
      BEMÆRK: Fisk blev såret af stump kraft TBI som tidligere beskrevet22.
    4. Saml 2-3 ubeskadigede eller TBI fisk 4 timer efter indledende test og/eller 4 timer efter skaden (eller ved den pågældende forsøgsfrist) fra dyreanlægget.
    5. Opbevar alle fisk i det mørke rum i individuelle tanke, der indeholder systemvand, og placer en ad gangen i midten af rumfærgen (tilberedt med systemvand som beskrevet i 1.1), fastgør låget, fastgør strømforsyningen og lad fisk 15 minutter akklimatere.
    6. Efter akklimatiseret, vurdere øjeblikkelig hukommelse (strengt pass / fail) ved at anvende kun lys stimulus for op til 15 s og registrere følgende svar:
      1. Overvej sporet vellykket, hvis fisken krydser over halvvejs i kassen inden for 15 s testperiode. Afslut lysstimulansen ved at krydse halvvejspunktet.
      2. Overvej sporet som mislykkedes, hvis fisken ikke krydser over halvvejs i kassen inden for 15 s for at starte lysstimulansen, afslut lysstimulansen.
        BEMÆRK: Under denne test efter skaden anvendes en negativ chok stimulus ikke efter et mislykket forsøg.
    7. Gentag trin 2.4.6 med en hvileperiode på 30 s mellem forsøg, og registrer antallet af vellykkede forsøg (2.4.6.1) og mislykkede forsøg (2.4.6.2) på tværs af 25 forsøg.
    8. Beregn procentforskellen i vellykkede forsøg med post-skade til den oprindelige testperiode med ligningen:
      Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Læringsparadigmet, der er skitseret i protokollen og skematisk (figur 1), giver en hurtig vurdering af kognition med hensyn til associativ læring. Derudover har dette paradigme et højt niveau af stringens ved at definere læring som en gentagen og konsekvent visning af 5 på hinanden følgende positive forsøg. Dette paradigme gælder også for en række aldre og skader. Ubeskadigede fisk efter 8 måneder (ung voksen), 18 måneder (midaldrende voksen) og 24 måneder (ældre voksne) krævede et lignende antal forsøg for at lære adfærden ved at undgå det røde lys (ubeskadiget 8 m: 15,28 ± 4,92 forsøg, 18 m: 17,66 ± 5,5 forsøg, 24 m: 16,2 ± 4,79 forsøg, 8 m vs. 18 m p=0,92, 8 m vs. 24 m p=0,98 18 m vs. 24 m p=0,97, figur 2A). Vi har også udnyttet en alvorlig stump-force traumatisk hjerneskade (sTBI) model22 og observerede, at fisk i forskellige aldre krævede lignende antal forsøg for at mestre analysen på tværs af 1-5 dage efter skade (dpi; 8 m vs 18 m, p = 0,09, 8 m vs 24 m, p = 0,96, 18 m vs 24 m, p = 0,12, Figur 2A). På dag 1 efter sTBI, fisk i alle aldre (8, 18 og 24 m) krævede et tilsvarende antal forsøg for at lære adfærden (8 m: 73,3 ± 9,45 forsøg, 18 m: 79,33 ± 6,35 forsøg, 24 m: 68,25 ± 6,65 forsøg, 8 m vs. 18 m p=0,71, 8 m vs. 24 m p=0,76, 18 m vs. 24 m p=0,28, Figur 2A) og de var alle betydeligt større end de ubeskadigede kontroller (s<0.01). Kollektivt, disse data viser, at shuttle boksen kan udnyttes til at undersøge skade-induceret kognitive underskud på tværs af aldersgrupper og tyder på, at voksne zebrafisk kan inddrive kognitivt efter stump kraft skade.

Fordi gentagne miTBI-hændelser i stigende grad kan forringe kognitiv funktion, brugte vi shuttle box assay som en metrik til at spore dosisafhængig progression ved hjælp af gentagne TBI. Vi anvendte denne analyse til at vurdere læring efter en miTBI stump kraft skade22, der gentages dagligt for de forskellige længder af tid. Som tidligere observeret, ubeskadigede fisk hurtigt mestrer shuttle-box opnå 5 på hinanden følgende positive forsøg i 16,4 ± 3,5 forsøg (Figur 2B). En dag efter en enkelt miTBI viser fisk en betydelig stigning i antallet af forsøg for at lære adfærden (40,25 ± 12,65 forsøg, p<0,05, Figur 2B). Dette underskud steg efter 2 miTBI-hændelser (48 ± 14,9 forsøg) og blev yderligere forhøjet efter 3 miTBI-skader (56,63 ± 12,75 forsøg, figur 2B). Derudover observerede vi en betydelig stigning i kognitiv svækkelse mellem miTBI fisk, som fik en enestående skade og 3 skader (p<0.05).

Vi undersøgte også, hvordan hukommelsen blev påvirket efter gentagne miTBI-hændelser ved hjælp af protokollen til umiddelbare og forsinkede hukommelsesparadigmer (Figur 1A). Naive ubeskadigede fisk fik en uddannelsesperiode og en indledende testperiode, hvorefter en del af fisken blev såret for øjeblikkelig hukommelse, og andre blev returneret til fiskeanlægget i 4 dage for at få adgang til forsinket hukommelse (Figur 2C). Ubeskadigede fisk udviser en lille stigning i procents forskel af vellykkede forsøg i både umiddelbar hukommelse (6,22% ± 4,7%) og forsinket hukommelse (6,13% ± 5,57%) i forhold til den oprindelige testperiode. Vi undersøgte derefter effekten af flere stumpe kraft TBI begivenheder havde på hukommelsen. Betydelige underskud blev observeret efter miTBI i umiddelbar hukommelse, men ikke i forsinket hukommelse. Efter en enkelt miTBI udviste fisk betydelige umiddelbare hukommelsesunderskud (-26,77 % ± 8,93 %) sammenlignet med ubeskadigede fisk (p<0.0001, figur 2C). Denne tendens fortsatte med gentagne skader med stigende underskud efter både 2x miTBI (-37,42% ± 10,01%) og 3x miTBI (-39,71% ± 11,39%). Desuden observerede vi en lignende dosiseffekt mellem fisk behandlet med en enkelt (1x) miTBI og 3x miTBI (p<0.05, Figur 2C). Disse data tyder på, at læring og hukommelse er reduceret i miTBI fisk med det stigende antal skader, hvilket øger underskuddet og shuttle box assay og protokoller, der er beskrevet ovenfor, er følsomme nok til at opdage disse forskelle.

Figure 1
Figur 1: Shuttle Box Assay. (A) Instruktionsoversigt over indlærings- og hukommelsesparadigmer til kognitiv vurdering. (B) Skematisk af en konverteret stor DNA gel boks til shuttle box assay. (C,D) Grafisk repræsentation af stimuli ansøgning under forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Zebrafisk udviser kognitive underskud efter stump kraft TBI. (A) Efter sTBI udviser zebrafisk på 8, 18 og 24 måneder indlæringsunderskud, der ikke er signifikant forskellige mellem aldersgrupper. Signifikante stigninger i antallet af forsøg for at lære shuttle box paradigme i forhold til alder-matchede kontrol blev observeret på 1 dpi vender tilbage til ubeskadigede niveauer med 4-5 dpi. (B,C) Gentagne miTBI-fisk udviste både indlæringsunderskud (B) og hukommelsesunderskud (C) på en dosisafhængig måde. Middelværdi ± SEM er afbildet i A og B, mens middelværdi ± Standardafvigelse afbildes i C. Hvert datapunkt på alle tre grafer repræsenterer en enkelt voksen zebrafisk. Statistiske analyser blev udført med enten en One-Way eller Two-Way ANOVA efterfulgt af en Tukey post-hoc test. # p<0,05, # # p<0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kognitiv svækkelse kan have en betydelig og negativ indvirkning på livskvaliteten. På grund af den øgede synlighed og forekomst af hjernerystelser og traumatiske hjerneskader i hele befolkningen, er det vigtigt at forstå, hvordan de forårsager kognitiv svækkelse, og hvordan skaden kan minimeres eller vendes. Af disse grunde spiller modelorganismer, der kan testes for kognitiv tilbagegang, en afgørende rolle i disse undersøgelser. Gnavere har længe været den primære model til at undersøge neurobehavior og kognition, men zebrafisk har vist sig som en nyttig model med mange forskellige adfærd for at undersøge en række udviklingsmæssige, aldersrelaterede og erhvervede kognitive underskud17,20,23,24,25,26. Forskellige metoder til at vurdere kognition er blevet udnyttet fra endimensionel læring i form af habituation, til kompleks læring og rumlig hukommelse, nyt objekt og placering anerkendelse, og beslutningstagning18,19,20,21,27,28. Disse kognitive tests er dog begrænset til at teste ikke-associativ kognition eller kræver en kompleks opsætning, finansielle investeringer i udstyr eller en omfattende tidsforpligtelse, før test kan udføres. I modsætning hertil bruger rumfærgeboksen og de lærings- og hukommelsesparadigmer, der er beskrevet her, en kompleks associativ læringsanalyse, der er omkostningseffektiv, en hurtigt vurderet og let ansat af en nybegynder investigator. Vigtigst er det, i overensstemmelse med de andre kognitive tests, vores analyse viser, at ubeskadigede fisk hurtigt lære associative opgave og kan huske opgaven dage senere uden intermitterende uddannelse29.

Analysens tilpasningsevne giver muligheder for at undersøge forskellige lærings- og hukommelsespunkter som en metrik af sygdomsprogression eller mekanistiske interventioner. Der er to primære funktioner i analysen. For det første er metoden enkel. Analysen er hurtigt sat op og har klare og særskilte slutpunkter med hensyn til vellykkede og mislykkede forsøg, hvilket gør det tilgængeligt for en række efterforskere. Vi fandt, at på grund af enkelheden i denne analyse, er der meget lidt fejlfinding er nødvendig for at bruge shuttle boksen med succes. For det andet er analysen ekstremt hurtig i forhold til andre kognitive eksamener, hvilket giver fleksibilitet eller evnen til at undersøge et stort antal fisk hurtigt på en enkelt dag. Tiden til at vurdere læring er på mindst 19,75 min (figur 1), med fisk, der kræver 15 minutter at akklimatificer sig til shuttle box (bestemt af tank udforskning), efterfulgt af en enkelt mislykket forsøg (15 s lys stimulus, 15 s aversion stimulus, 30 s mellem forsøg) og 5 umiddelbare og på hinanden følgende positive forsøg (<15 s lys stimulus). I praksis observerede vi, at ubeskadigede fisk kræver 6-30 forsøg (19,75 min-43,75 min), mens de mest alvorlige underskud i ekstreme tilfælde (efter et alvorligt stumpt krafttraume) kan kræve 100 forsøg (113,75 min). Hukommelsesstudier udføres også hurtigt. Efter protokoloversigten er den mindste tid, der er nødvendig for akklimatisering, træning og indledende testning, 67,5 min (15 min akklimatisering, 25 gentagelser af lys og stød i 15 s, 30 s hvile mellem forsøg og gentag til indledende test uden de negative stimuli). Mens testning enten øjeblikkelig eller forsinket hukommelse kræver kun 33,75 min (15 min akklimatering, 25 gentagelser af kun lys stimulus for 15 s, og 30 s hvile mellem forsøg), uanset skade, behandling, eller kognitive underskud.

Ved vurdering af neurobehavior bruger forskellige paradigmer enten positive eller negative stimuli. Positive stimuli i form af mad eller social interaktion, der ofte bruges i klassiske T-box labyrinter, kan hjælpe i en stærk reaktion på en lært opgave. Men, assays udnytte positiv tilknytning gøre det på bekostning af tid. I modsætning hertil, mens konditionering som reaktion på en negativ stimulus giver en hurtig sammenhæng og stærk adfærdsmæssig respons, er det på bekostning af den negative stimulus. Ubeskadigede fisk ofte lære shuttle box assay hurtigt og er derfor udsat for et minimalt antal chok, og som følge heraf synes at have nogen bivirkninger. Men neurologisk kompromitteret fisk (TBI), med alvorlige kognitive underskud, kræver et betydeligt antal forsøg og elektriske stød. Disse mange chok er blevet observeret for lejlighedsvis at resultere i tonisk-kloniske anfald. Enhver fisk, der oplever en tonic-klonisk beslaglæggelse, mens inden for shuttle boksen bør straks fjernes og etisk aflives. Alle forsøg for den aflivede fisk, til og med beslaglæggelseshændelsen, bør udelukkes i enhver statistisk analyse. Desuden er det værd at bemærke, at elektrisk stød til en neurologisk beskadiget emne kan pålægge utilsigtede forskelle mellem beskadigede fisk, der er og ikke er resultatet af shuttle box. Derfor foreslår vi, at alle fisk, der underkastes neurobehavior-vurdering, ikke bør anvendes til nogen anden kvantitativ metrikværdi (serumbiomarkør, IHC osv.). Det er også vigtigt at forstå, at denne metode til læring er baseret på en visuel stimulus og ikke er egnet til skader, der kan kompromittere visuelle kredsløb, da det vil forvirre resultaterne.

Vores resultater viser, at efter stump kraft TBI, zebrafisk udviser en hurtig kognitiv underskud, der resulterer i øgede forsøg for at mestre en associativ opgave i shuttle box assay. Lignende umiddelbare underskud ses i gnavermodeller af TBI, men disse underskud kan mindskes, de fortsætter ofte og forbliver betydelige30. I modsætning hertil viser zebrafisk kognitiv genopretning inden for 7 dage efter skade. Den regenerative kapacitet af den voksne zebrafisk er veldokumenteret9,10,11,12,13,14,15, med kendte neurogene nicher i ventrikulære / subventrikulære zoner i telencephalon31,32. Den kognitive opsving observeret i vores analyse efter TBI giver indsigt i nødvendige eksamener for at identificere, om disse neurogene nicher stimuleres og spiller en rolle i væv og kognitiv genopretning.

Afslutningsvis giver shuttleboksen en hurtig vurdering af kognition med hensyn til associativ læring og hukommelse. Analysen udnytter minimalt og conventual udstyr og er teknisk enkel. Fremtidige anvendelser kan udnyttes til at vurdere genetiske og farmakologiske indgreb til neurologisk fornærmet fisk med hensyn til neuroprotection samt andre skade paradigmer eller neurodegenerative modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Hyde lab medlemmer for deres tankevækkende diskussioner og Freimann Life Sciences Center teknikere til zebrafisk pleje og opdræt. Dette arbejde blev støttet af Center for Zebrafish Research ved University of Notre Dame, Center for Stamceller og Regenerativ Medicin ved University of Notre Dame, og tilskud fra National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Sentinels of Freedom Fellowship (JTH), og Pat Tillman Scholarship (JTH). Figur 1 lavet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flashlight Ultrafire 9145
Instant Ocean Instant Ocean SS15-10
Large DNA Gel Box Fisher Scientific FB-SB-1316 Shuttle Box
Power Supply Fisher Scientific FB-105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deutsch, M., Mendez, M., Teng, E. Interactions between traumatic brain injury and frontotemporal degeneration. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 39, 143-153 (2015).
  2. Gardner, R., et al. Traumatic brain injury in later life increases risk for Parkinson disease. Annals in Neurology. 77, 987 (2015).
  3. Fleminger, S., Oliver, D., Lovestone, S., Rabe-Hesketh, S., Giora, A. Head injury as a risk factor for Alzheimer's disease: the evidence 10 years on; a partial replication. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 74, 857-886 (2003).
  4. Johnson, V., Stewart, W., Smith, D. Traumatic brain injury and amyloid-β pathology: a link to Alzheimer's disease. Nature Reviews Neurosciences. 11, 361-370 (2010).
  5. Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31, 379-387 (2016).
  6. Corrigan, J. D., Selassie, A. W., Orman, J. A. L. The epidemiology of traumatic brain injury. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 25, 72-80 (2010).
  7. Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14, 506-517 (2015).
  8. GBD 2016 Traumatic Brain Injury and Spinal Cord Injury Collaborators. Global, regional, and national burden of traumatic brain injury and spinal cord injury, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet, Neurology. 18 (1), 56-87 (2019).
  9. Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
  10. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
  11. Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
  12. Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342, 26-38 (2010).
  13. Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Reviews of Vision Sciences. 6, 171-193 (2020).
  14. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), Cambridge, England. 4831-4841 (2011).
  15. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
  16. Bhattarai, P., et al. Neuron-glia interaction through Serotonin-BDNF-NGFR axis enables regenerative neurogenesis in Alzheimer's model of adult zebrafish brain. PLoS Biology. 18 (1), 3000585 (2020).
  17. Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  18. Chanin, S., et al. Assessing startle responses and their habituation in adult zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Humana Press. (2012).
  19. López-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 54, 134-139 (2019).
  20. Maheras, A. L., et al. Genetic pathways of neuroregeneration in a novel mild traumatic brain injury model in adult zebrafish. eNeuro. 5 (1), (2018).
  21. Gaspary, K. V., Reolon, G. K., Gusso, D., Bonan, C. D. Novel object recognition and object location tasks in zebrafish: Influence of habituation and NMDA receptor antagonism. Neurobiology of Learning and Memory. 155, 249-260 (2018).
  22. Hentig, J., Cloghessy, K., Dunseath, C., Hyde, D. R. A scalable model to study the effects of blunt-force injury in adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  23. Wu, Y. J., et al. Fragile X mental retardation-1 knockout zebrafish shows precocious development in social behavior. Zebrafish. 14 (5), 438-443 (2017).
  24. Rea, V., Van Raay, T. J. Using zebrafish to model autism spectrum disorder: A Comparison of ASD risk genes between zebrafish and their mammalian counterparts. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 575575 (2020).
  25. Zhdanova, I. V., et al. Aging of the circadian system in zebrafish and the effects of melatonin on sleep and cognitive performance. Brain Research Bulletin. 75 (2-4), 433-441 (2008).
  26. Yu, L., Tucci, V., Kishi, S., Zhdanova, I. V. Cognitive aging in zebrafish. PloS One. 1 (1), 14 (2006).
  27. Bahl, A., Engert, F. Neural circuits for evidence accumulation and decision making in larval zebrafish. Nature Neuroscience. 23 (1), 94-102 (2020).
  28. Ngoc Hieu, B. T., et al. Development of a modified three-day t-maze protocol for evaluating learning and memory capacity of adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1464 (2020).
  29. Williams, F. E., White, D., Messer, W. S. A simple spatial alternation task for assessing memory function in zebrafish. Behavioural Processes. 58 (3), 125-132 (2002).
  30. Zohar, O., et al. Closed-head minimal traumatic brain injury produces long-term cognitive deficits in mice. Neuroscience. 118 (4), 949-955 (2003).
  31. Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  32. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration, and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).

Tags

Neurovidenskab zebrafisk regenerering traumatisk hjerneskade stump-kraft traumer læring hukommelse
Shuttle Box Assay som et associativt læringsværktøj til kognitiv vurdering i lærings- og hukommelsesstudier ved hjælp af voksne zebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hentig, J., Cloghessy, K., Hyde, D.… More

Hentig, J., Cloghessy, K., Hyde, D. R. Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (173), e62745, doi:10.3791/62745 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter