Summary
मौजूदा मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी या पैच क्लैंप उपकरण का संशोधन एक्स विवो इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम को अधिक व्यापक रूप से सुलभ बनाता है। पूर्व विवो प्रकाश प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने और बनाए रखने के लिए बेहतर तरीके स्वस्थ रेटिना में फोटोरिसेप्टर और ओएन-द्विध्रुवी सेल फ़ंक्शन के अध्ययन की सुविधा प्रदान करते हैं, आंखों की बीमारियों के पशु मॉडल और मानव दाता रेटिना।
Abstract
रेटिना न्यूरोनल प्रकाश प्रतिक्रियाओं के माप स्वस्थ रेटिना के शरीर विज्ञान की जांच करने, रेटिना रोगों में पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का निर्धारण करने और चिकित्सीय हस्तक्षेप का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। एक्स विवो इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (ईआरजी) विशिष्ट औषधीय एजेंटों के अलावा और प्रणालीगत प्रभावों से स्वतंत्र रूप से ऊतक-आंतरिक परिवर्तनों के मूल्यांकन द्वारा पृथक रेटिना में अलग-अलग सेल प्रकारों से योगदान का परिमाणीकरण करने की अनुमति देता है। रेटिना प्रकाश प्रतिक्रियाओं को एक विशेष पूर्व विवो ईआरजी नमूना धारक और रिकॉर्डिंग सेटअप का उपयोग करके मापा जा सकता है, जो मौजूदा पैच क्लैंप या माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी उपकरण से संशोधित है। विशेष रूप से, ओएन-द्विध्रुवी कोशिकाओं का अध्ययन, लेकिन फोटोरिसेप्टर का भी, समय के साथ पूर्व विवो ईआरजी में प्रकाश प्रतिक्रियाओं की धीमी लेकिन प्रगतिशील गिरावट से बाधित हुआ है। छिड़काव की गति में वृद्धि और परफ्यूसेट तापमान का समायोजन पूर्व विवो रेटिना फ़ंक्शन में सुधार करता है और प्रतिक्रिया आयाम और स्थिरता को अधिकतम करता है। एक्स विवो ईआरजी विशिष्ट रूप से व्यक्तिगत रेटिना न्यूरोनल सेल प्रकारों के अध्ययन की अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रतिक्रिया आयामों और स्थिरता को अधिकतम करने के लिए सुधार बड़े जानवरों के साथ-साथ मानव दाता आंखों से रेटिना नमूनों में प्रकाश प्रतिक्रियाओं की जांच की अनुमति देता है, जिससे एक्स विवो ईआरजी रेटिना फ़ंक्शन की जांच के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीकों के प्रदर्शनों के प्रदर्शनों के लिए एक मूल्यवान अतिरिक्त बन जाता है।
Introduction
इलेक्ट्रोरेटिनोग्राफी प्रकाश के जवाब में रेटिना फ़ंक्शन कोमापता है 1. यह रेटिना फिजियोलॉजी और पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने और रेटिना रोगों के लिए उपचार की सफलता को मापने का अभिन्न अंग है। विवो ईआरजी का व्यापक रूप से बरकरार जीवों में रेटिना फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन इसकी महत्वपूर्ण सीमाएं 2,3 हैं। इनमें से, विवो ईआरजी में व्यक्तिगत रेटिना सेल प्रकारों का मात्रात्मक विश्लेषण बाधित होता है, क्योंकि यह संभावित परिवर्तनों के योग को रिकॉर्ड करता है, और इसलिए सभी रेटिना कोशिकाओं सेप्रकाश उत्तेजनाओं तक प्रतिक्रियाओं को ओवरले करता है। इसके अलावा, यह रेटिना में दवाओं को जोड़ने की आसानी से अनुमति नहीं देता है, प्रणालीगत प्रभावों के प्रति संवेदनशील है, और अपेक्षाकृत कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात है। इन नुकसानों को एक्स विवो ईआरजी में समाप्त कर दिया जाता है जो पृथक रेटिना 2,3,5,6 के कार्य की जांच करता है। एक्स विवो ईआरजी फार्माकोलॉजिकल इनहिबिटर और चिकित्सीय एजेंटों के आसान मूल्यांकन के अलावा विशिष्ट रेटिना सेल प्रकारों से बड़ी और स्थिर प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है, जिसे सुपरफ्यूसेट में जोड़ा जा सकता है। साथ ही, यह प्रणालीगत प्रभावों के प्रभावों को दूर करता है और शारीरिक शोर (जैसे, दिल की धड़कन या श्वास) को समाप्त करता है।
पूर्व विवो ईआरजी में, रेटिना या रेटिना नमूने अलग किए जाते हैं और नमूना धारक 3,5 के गुंबद पर फोटोरिसेप्टर-साइड पर लगाए जाते हैं। नमूना धारक को इकट्ठा किया जाता है, एक छिड़काव प्रणाली से जोड़ा जाता है जो रेटिना को गर्म, ऑक्सीजन युक्त मीडिया के साथ आपूर्ति करता है, और एक माइक्रोस्कोप के चरण पर रखा जाता है, जिसे कंप्यूटर-नियंत्रित प्रकाश उत्तेजनाओं को वितरित करने के लिए संशोधित किया गया है। प्रकाश द्वारा प्राप्त प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए, नमूना धारक एक एम्पलीफायर, डिजिटाइज़र और रिकॉर्डिंग सिस्टम से जुड़ा हुआ है (चित्रा 1)। यह तकनीक प्रकाश उत्तेजनाओं के मापदंडों को बदलकर और औषधीय एजेंटों को जोड़कर रॉड और शंकु फोटोरिसेप्टर, ओएन-द्विध्रुवी कोशिकाओं और मुलर ग्लिया से प्रतिक्रियाओं के अलगाव की अनुमति देती है।
एक मौजूदा पैच क्लैंप या मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) सेटअप को पूर्व विवो ईआरजी रिकॉर्ड करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है, या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक्स विवो ईआरजी एडाप्टर या कस्टम पॉली कार्बोनेट कंप्यूटर न्यूमेरिकल कंट्रोल (सीएनसी)-मशीन्ड नमूना धारक के साथ संयोजन में, चूहों जैसे छोटे पशु मॉडल से रेटिना में प्रकाश प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए। यह संशोधन विशेष उपकरणों की आवश्यकता को कम करते हुए एक्स विवो ईआरजी की पहुंच को बढ़ाता है। नमूना धारक का डिजाइन माउंटिंग तकनीक को सरल बनाता है और इलेक्ट्रोड को एकीकृत करता है, जो पहले रिपोर्ट किए गए ट्रांसरेटिनल एक्स विवो ईआरजी विधियों की तुलना में माइक्रोइलेक्ट्रोड्स के हेरफेर की आवश्यकता को समाप्त करताहै। नमूना धारक के अंदर छिड़काव दर और तापमान महत्वपूर्ण कारक हैं जो फोटोरिसेप्टर और ओएन-द्विध्रुवी कोशिकाओं से प्रतिक्रिया गुणों को प्रभावित करते हैं। इन स्थितियों को समायोजित करके, एक्स विवो ईआरजी को लंबे समय तक पृथक माउस रेटिना से मज़बूती से दर्ज किया जा सकता है। अनुकूलित प्रयोगात्मक स्थितियां बड़े रेटिना से रेटिना पंच में एक्स विवो ईआरजी रिकॉर्डिंग की अनुमति देती हैं, जिसमें बड़ी जानवरों की आंखें और मानव दाता आंखेंशामिल हैं।
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Protocol
चूहों का उपयोग करने वाले सभी प्रयोग प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड के अनुसार आयोजित किए गए थे और यूटा विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु अध्ययन समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे। इस वीडियो के प्रदर्शन के लिए सुअर की आंखों को बूचड़खाने (सस्टेनेबल स्वाइन रिसोर्सेज, जॉनसनविले) से पोस्टमॉर्टम प्राप्त किया गया था। यूटा लायंस आई बैंक, सैन डिएगो आई बैंक या लाइफशेयरिंग के माध्यम से अनुसंधान उपयोग के लिए सहमति के साथ मस्तिष्क या हृदय की मृत्यु के बाद मानव दाताओं से आंखें प्राप्त की गईं, जो एफडीए, एसोसिएशन ऑफ ऑर्गन प्रोक्योरमेंट ऑर्गेनाइजेशन (एओपीओ) और आई बैंक्स ऑफ अमेरिका एसोसिएशन द्वारा पूरी तरह से मान्यता प्राप्त हैं। मानव दाता आंखों के उपयोग को यूटा विश्वविद्यालय (आईआरबी नंबर 00106658) और स्क्रिप्सहेल्थ आईआरबी (आईआरबी नंबर 16-6781) में छूट की स्थिति थी।
1. पूर्व विवो ईआरजी स्थापित करना
- मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी सेटअप को परिवर्तित करने के लिए, एक्स विवो ईआरजी नमूना धारक को एक हेड स्टेज के माध्यम से एक अंतर एम्पलीफायर से कनेक्ट करें, जिसे मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी सिस्टम के इंटरफ़ेस बोर्ड के एनालॉग इनपुट में प्लग किया जाता है। पूर्व विवो ईआरजी से इनपुट डेटा रिकॉर्ड और संग्रहीत करने के लिए मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी के लिए रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। विभेदक एम्पलीफायर के लाभ को 100 पर सेट करें और डिजिटाइज़र विनिर्देशों के आधार पर एक अतिरिक्त 10x वोल्टेज प्रवर्धन जोड़ें। कम पास फ़िल्टर को 100 Hz पर सेट करें।
- पैच क्लैंप सेटअप को बदलने के लिए, एक्स विवो ईआरजी नमूना धारक को एक हेड स्टेज के माध्यम से एक डिफरेंशियल एम्पलीफायर से कनेक्ट करें, जो पैच क्लैंप एम्पलीफायर के हेड स्टेज से जुड़ा हुआ है। एक्स विवो ईआरजी से इनपुट डेटा रिकॉर्ड और स्टोर करने के लिए पैच क्लैंप सिस्टम सॉफ़्टवेयर और डिजिटाइज़र का उपयोग करें। विभेदक एम्पलीफायर के लाभ को 100 पर सेट करें और पैच क्लैंप हेड स्टेज के माध्यम से अतिरिक्त 10x वोल्टेज प्रवर्धन लागू करें। कम पास फ़िल्टर को 100 Hz पर सेट करें।
- माइक्रोस्कोप के लिए उचित तरंग दैर्ध्य (उदाहरण के लिए, रॉड फोटोरिसेप्टर और ओएन-बाइपोलर सेल प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए लगभग 530 एनएम) के साथ एलईडी कनेक्ट करें। रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के साथ एलईडी को नियंत्रित करें जो प्रकाश उत्तेजनाओं के ट्रिगर को सक्षम बनाता है। प्रकाश उत्तेजनाओं को नियंत्रित करने के लिए, डिजिटाइज़र से एनालॉग आउटपुट द्वारा नियंत्रित एलईडी ड्राइवर का उपयोग करें।
- फोटोडायोड का उपयोग करके नमूना धारक में रेटिना की स्थिति में एलईडी के प्रकाश उत्पादन को कैलिब्रेट करें। यदि आवश्यक हो, तो प्रकाश की तीव्रता को कम करने के लिए प्रकाश पथ में तटस्थ घनत्व फिल्टर डालें।
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या कस्टम निर्मित पूर्व विवो ईआरजी नमूना धारक का उपयोग करें।
नोट: पॉली कार्बोनेट से सीएनसी मशीनिंग के लिए चित्र अनुरोध पर लेखकों से प्राप्त किए जा सकते हैं। - इलेक्ट्रोड तैयार करने के लिए, एक थ्रेडेड ल्यूर कनेक्टर में एजी / एजीसीएल गोली इलेक्ट्रोड डालें। गर्म गोंद के साथ ल्यूर कनेक्टर के अंदर भरें और गैर-थ्रेडेड साइड से गर्म गोंद में 2 मिमी सॉकेट डालें। सोल्डर ईपी 1 इलेक्ट्रोड का एक चांदी का तार 2 मिमी सॉकेट तक। तैयार इलेक्ट्रोड को, धागे पर एक ओ-रिंग के साथ, एक्स विवो ईआरजी नमूना धारक के इलेक्ट्रोड पोर्ट में स्क्रू करें।
नोट: इलेक्ट्रोड का उपयोग लंबे समय तक किया जा सकता है। यदि पेलेट की सतह गंदगी जमा करती है और / या अंधेरा हो जाता है (यह उच्च ऑफसेट वोल्टेज और / या विद्युत बहाव का कारण बन सकता है), तो इसे ठीक सैंडपेपर का उपयोग करके "पॉलिश" किया जा सकता है। - प्रयोग से कम से कम 1 दिन पहले, एपॉक्सी गोंद का उपयोग करके एक्स विवो ईआरजी नमूना धारक के गुंबदों पर गोंद फिल्टर पेपर, यह सुनिश्चित करता है कि गोंद इलेक्ट्रोड चैनल को बाधित नहीं करता है (वीडियो के लिए 3 देखें)।
2. पशु तैयारी
- अंधेरे कम से कम 6 घंटे या रात भर के लिए जानवरों को अनुकूलित करते हैं।
3. उपकरण तैयार करना
- एक्स विवो ईआरजी की छिड़काव लाइन को एम्स के माध्यम के साथ भरें जो 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 95% ऑक्सीजन के साथ बुलबुला है। एम्स के माध्यम को गर्म करने के लिए नमूना धारक के पास डीसी वर्तमान स्रोत या गर्मी नियंत्रक के साथ छिड़काव लाइन को एक हीटिंग तत्व से कनेक्ट करें, ताकि रेटिना को लगभग 35-38 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सके।
- इलेक्ट्रोड समाधान के साथ पूर्व विवो ईआरजी नमूना धारक के दोनों हिस्सों को भरें, ल्यूर स्टॉपर के साथ छिड़काव लाइन को सील करें, इलेक्ट्रोड को कनेक्ट करें, और नमूना धारक को चार स्क्रू के साथ इकट्ठा करें (वीडियो के लिए 3 देखें)।
- इलेक्ट्रोड में मल्टीमीटर की जांच डालकर इकट्ठे नमूना धारक में इलेक्ट्रोड के बीच प्रतिरोध और ऑफसेट वोल्टेज की जांच करें।
नोट: यदि कोई रुकावट नहीं है, और इलेक्ट्रोड अच्छी स्थिति में हैं, तो प्रतिरोध 100 k3 से नीचे होना चाहिए और 5 mV से नीचे वोल्टेज होना चाहिए। - इकट्ठे नमूना धारक को छिड़काव लाइन से कनेक्ट करें और प्रकाश चमक देने के लिए स्थापित माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें। सुनिश्चित करें कि नमूना धारक और छिड़काव लाइन में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
4. ऊतक तैयार करना
- सीओ2 के साथ जानवर का बलिदान करें और तुरंत आंखों को एन्यूक्लिएट करें, या बड़े जानवर या मानव दाता आंखें प्राप्त करें।
- शेष संयोजी ऊतक और एक्स्ट्राओकुलर मांसपेशियों के ग्लोब को साफ करें। ऑप्टिक तंत्रिका को ट्रिम करें।
- फिल्टर पेपर पर, माउस आंख में लिम्बस से लगभग 1 मिमी की दूरी पर ओरा सेराटा के साथ रेजर ब्लेड के साथ सावधानीपूर्वक एक छोटा सा चीरा रखें। चीरा में बारीक वैनस कैंची डालें और लेंस के साथ आंख के पूर्ववर्ती हिस्से को हटाने के लिए लिम्बस के साथ काट लें।
- आंखों के कप को एम्स के माध्यम वाले पकवान में ले जाएं। रेटिना को न छूने का ध्यान रखते हुए, बारीक बल के साथ श्वेतपटल को पकड़ें। रेटिना और श्वेतपटल के बीच वैनस कैंची डालें और परिधीय से मध्य भाग की ओर श्वेतपटल को काटें। ध्यान रखें कि रेटिना को छूने या नुकसान न पहुंचाने के लिए।
- विच्छेदन डिश के तल के खिलाफ वैनस कैंची के साथ चीरा के एक तरफ पकड़कर श्वेतपटल को स्थिर करें। चीरे के दूसरी तरफ बल के साथ श्वेतपटल को पकड़ें। ऊतक को न्यूनतम नुकसान के साथ रेटिना के अलगाव की अनुमति देने के लिए चीरा के दोनों ओर श्वेतपटल को अलग करके रेटिना को स्पर्श या नुकसान पहुंचाए बिना हटा दें।
- साथी आंख से लेंस के साथ पूर्ववर्ती खंड को हटा दें और आंख के कप को कमरे के तापमान पर एम्स के घोल में 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 95% ऑक्सीजन के साथ स्टोर करें।
नोट: इस तरह से संग्रहीत आंखों से कार्यात्मक प्रकाश प्रतिक्रियाएं कई घंटों तक प्राप्त की जा सकती हैं। - मानव दाता आंखों सहित बड़ी आंखों में, शेष संयोजी ऊतक के ग्लोब को साफ करें और माउस आंख के लिए वर्णित प्रक्रिया के समान पूर्ववर्ती खंड और लेंस को हटा दें। लिम्बस से लगभग 3 मिमी की कटौती करने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। चीरा में घुमावदार विच्छेदन कैंची डालें और लेंस के साथ आंख के पूर्ववर्ती हिस्से को हटाने के लिए लिम्बस के साथ काट लें। 3-6 मिमी डिस्पोजेबल बायोप्सी पंच के साथ एक्स विवो इलेक्ट्रोरेटिनोग्राफी के लिए रेटिना नमूने प्राप्त करें।
5. नमूना धारक पर ऊतक को बढ़ाना
- नमूना धारक के निचले आधे हिस्से को एक बड़े पेट्री डिश में रखें और ऑक्सीजन युक्त एम्स के माध्यम से भरें ताकि नमूना धारक का गुंबद बस जलमग्न हो जाए।
- रेटिना के किनारे को बारीक बल के साथ ध्यान से समझें और रेटिना को पूर्व विवो नमूना धारक, फोटोरिसेप्टर साइड के गुंबद पर स्थानांतरित करें।
- एम्स के घोल से नमूना धारक को उठाएं, इस बात का ध्यान रखते हुए कि रेटिना जगह पर रहे।
- शोर, इलेक्ट्रिकल क्रॉसस्टॉक और सिग्नल शंटिंग को कम करने के लिए नमूना धारक की प्लेट को पूरी तरह से सुखा लें।
- नमूना धारक के दोनों हिस्सों को चार स्क्रू के साथ इकट्ठा करें और छिड़काव लाइन को कनेक्ट करें। नमूना धारक के निचले आधे हिस्से में इलेक्ट्रोड को सुखाएं और एनोड केबल को आंतरिक रेटिना साइड और कैथोड केबल को फोटोरिसेप्टर साइड से कनेक्ट करें।
- नमूना धारक को 10-20 मिनट के लिए कम से कम 1 एमएल / मिनट ऑक्सीजन युक्त एम्स के माध्यम के साथ तैयार करें ताकि प्रकाश प्रतिक्रियाओं को स्थिर करने के लिए समय मिल सके।
6. रेटिना न्यूरोनल सेल फ़ंक्शन रिकॉर्ड करना
- रेटिना को बढ़ती तीव्रता की प्रकाश चमक के संपर्क में लाकर प्रतिक्रिया परिवारों को रिकॉर्ड करें। उदाहरण के लिए, लगभग 10 से 1,000 फोटॉन / μm2 तक की हल्की तीव्रता वाले माउस रॉड फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रिया परिवारों को रिकॉर्ड करें और माउस ON-बाइपोलर कोशिकाओं से लगभग 0.6 से 20 फोटॉन / μm2 तक की प्रकाश तीव्रता के साथ।
- 100 μM बेरियम क्लोराइड की उपस्थिति में फोटोरिसेप्टर प्रकाश प्रतिक्रियाओं (ए-तरंग) को मापें, जो मुलर ग्लियल कोशिकाओं में पोटेशियम चैनलों को अवरुद्ध करता है, और 40 μM डीएल-एपी 4, जो ओएन-बाइपोलर कोशिकाओं में ग्लूटामेटर्जिक सिग्नल ट्रांसमिशन को अवरुद्ध करता है (चित्रा 2 बी)।
- बी-तरंग को अलग करने के लिए, जो ओएन-द्विध्रुवी कोशिकाओं के कार्य से उत्पन्न होता है, पहले अकेले बेरियम क्लोराइड की उपस्थिति में फोटोरिसेप्टर और ओएन-द्विध्रुवी य कोशिकाओं दोनों से संयुक्त प्रकाश प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करें (चित्रा 2 ए)। फिर, बेरियम क्लोराइड युक्त एम्स के माध्यम के साथ-साथ डीएल-एपी 4 के साथ 5-10 मिनट के लिए उपयोग करें, और पहले की तरह ही प्रकाश उत्तेजनाओं के लिए फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करें (चित्रा 2 बी)। संयुक्त फोटोरिसेप्टर और ओएन-बाइपोलर सेल प्रतिक्रियाओं से फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रियाओं को घटाएं, इस प्रकार अकेले ऑन-बाइपोलर सेल प्रकाश प्रतिक्रियाओं की गणना करें (चित्रा 2 सी)।
7. ऑन-बाइपोलर सेल फ़ंक्शन का अनुकूलन
नोट: बी-वेव, जो ओएन-द्विध्रुवी कोशिकाओं से उत्पन्न होता है, नमूना धारक में तापमान और छिड़काव दर के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है।
- बी-वेव प्राप्त करने के लिए कम से कम 0.5 एमएल / मिनट की छिड़काव दर बनाए रखें।
नोट: ओएन-द्विध्रुवी कोशिकाओं से एक बड़ी और स्थिर प्रतिक्रिया बनाए रखने के लिए 1-2 एमएल / मिनट की उच्च छिड़काव दर बेहतर है। - सुनिश्चित करें कि किसी दिए गए छिड़काव दर के लिए, रेटिना के पास नमूना धारक में तापमान शरीर के तापमान (यानी, लगभग 35-38 डिग्री सेल्सियस) के करीब है।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि परफ्यूसेट के तापमान को समायोजित किया जाए, जिसे एक्स विवो ईआरजी नमूना धारक तक पहुंचने से पहले गर्म किया जाता है, ताकि यह रेटिना पर इष्टतम तापमान सीमा के भीतर हो। - बाद के प्रयोग के लिए आंखों के कप को कमरे के तापमान पर प्रकाश और ऑक्सीजन युक्त एम्स के माध्यम में स्टोर करें ताकि कई घंटों तक सामान्य ए- और बी-तरंगों को बनाए रखा जा सके।
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Representative Results
पूर्व विवो ईआरजी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और स्थिर फोटोरिसेप्टर और ओएन-द्विध्रुवी सेल प्रकाश प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग को सक्षम बनाता है, उदाहरण के लिए, माउस रेटिना (चित्रा 2 ए-सी) से। मानव दाता रेटिना से फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग न्यूक्लियेशन (चित्रा 2 डी) के 5 घंटे तक पोस्टमॉर्टम देरी और <20 मिनट न्यूक्लियेशन देरी के साथ ओएन-बाइपोलर सेल प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग संभव है (चित्रा 2 ई)। बड़ी प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों में सावधानीपूर्वक विच्छेदन तकनीक, उच्च छिड़काव दर और शारीरिक मूल्यों (स्तनधारी रेटिना में 35-38 डिग्री सेल्सियस) के करीब छिड़काव तापमान शामिल हैं। इन स्थितियों के तहत, दोनों सेल प्रकारों में प्रतिक्रिया आयाम और कैनेटीक्स समय के साथ अपेक्षाकृत स्थिर थे, लेकिन नमूना धारक पर रेटिना लगाए जाने के बाद धीरे-धीरे लगभग 40-45 मिनट में गिरावट आई (चित्रा 3)।
फोटोरिसेप्टर की तुलना में, ओएन-बाइपोलर सेल फ़ंक्शन अधिक आसानी से बाधित होता है, उदाहरण के लिए, विच्छेदन और माउंटिंग के दौरान रेटिना को नुकसान या तापमान और / या छिड़काव गति में गिरावट से। जबकि नमूना धारक में कम तापमान ने फोटोरिसेप्टर और ओएन-द्विध्रुवी य कोशिकाओं दोनों के कैनेटीक्स को बहुत धीमा कर दिया, इसने बी-तरंग के आयाम को कम कर दिया लेकिन ए-तरंग (चित्रा 4 ए) नहीं। इसके विपरीत, छिड़काव दर को 2.1 एमएल / मिनट से 0.6 एमएल / मिनट तक धीमा करने से फोटोरिसेप्टर और ओएन-बाइपोलर सेल प्रतिक्रियाओं दोनों के आयाम कम हो गए, लेकिन ए- या बी-वेव (चित्रा 4 बी) के अंतर्निहित समय (उत्तेजना की शुरुआत से प्रतिक्रिया शिखर तक का समय) को प्रभावित नहीं किया। 10 मिनट के लिए छिड़काव की समाप्ति के बाद रीपरफ्यूजन के परिणामस्वरूप संरक्षित फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रियाओं के साथ ओएन-बाइपोलर सेल फ़ंक्शन का पूर्ण नुकसान हुआ (चित्रा 5)।
चित्र 1: एक्स विवो इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम नमूना धारक और रिकॉर्डिंग सेटअप। (A, B) पूर्व विवो ईआरजी नमूना धारक में पृथक रेटिना को माउंट करने के लिए एक गुंबद शामिल है, जो एम्स के माध्यम को लगातार वितरित करने के लिए एक छिड़काव रेखा से जुड़ा हुआ है। इलेक्ट्रोड संकीर्ण चैनलों के माध्यम से छिड़काव रेखा के माध्यम से रेटिना के फोटोरिसेप्टर पक्ष और गुंबद से चिपके फिल्टर पेपर के माध्यम से आंतरिक रेटिना दोनों से जुड़े होते हैं। ये इलेक्ट्रोड एक अंतर एम्पलीफायर से जुड़े होते हैं, जो प्रकाश उत्तेजनाओं के जवाब में रेटिना में संभावित अंतर के माप को सक्षम बनाता है। (सी) नमूना धारक को माइक्रोस्कोप के चरण पर रखा जाता है, जिसे प्रकाश चमक देने के लिए संशोधित किया गया है और छिड़काव रेखा से जोड़ा गया है, जो गुरुत्वाकर्षण द्वारा गर्म, ऑक्सीजन युक्त एम्स के माध्यम को वितरित करता है। पूरे रिकॉर्डिंग सेटअप को विद्युत शोर को कम करने के लिए फैराडे पिंजरे द्वारा परिरक्षित किया गया है। इस आंकड़े को 9 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्त नाम: ईआरजी = इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एक्स विवो फोटोरिसेप्टर और ओएन-बाइपोलर सेल प्रतिक्रियाओं के उदाहरण निशान। पर्फ्यूसेट में फार्माकोलॉजिकल एजेंटों को जोड़ने से पूर्व विवो इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम के लिए व्यक्तिगत रेटिना सेल प्रकारों से योगदान का परिमाणीकरण करने की अनुमति मिलती है। फोटोरिसेप्टर (पीआर) प्रकाश प्रतिक्रियाओं को 100 μM बेरियम क्लोराइड (BaCl 2) की उपस्थिति में अलग किया जाता है, जो मुलरग्लियल कोशिकाओं द्वारा व्यक्त K + चैनलों का एक अवरोधक है, साथ ही 40 μM DL-AP4, एक ग्लूटामेट रिसेप्टर ब्लॉकर, जो फोटोरिसेप्टर से ओएन-बाइपोलर कोशिकाओं (बी) तक सिग्नल ट्रांसमिशन को रोकता है। ऑन-बाइपोलर सेल (ओएन-बीपीसी) फ़ंक्शन (सी) को अकेले बेरियम क्लोराइड (ए) की उपस्थिति में संयुक्त फोटोरिसेप्टर और ओएन-बाइपोलर सेल प्रतिक्रिया से फोटोरिसेप्टर घटक (बी) को घटाकर निर्धारित किया जाता है। फोटोरिसेप्टर प्रकाश प्रतिक्रियाएं मानव दाता रेटिना से प्राप्त की जा सकती हैं, जिसमें <5 घंटे (डी) की न्यूक्लियेशन देरी होती है, जबकि मृत्यु के 20 मिनट के भीतर एन्यूक्लिएटेड रेटिना अक्सर ऑन-बाइपोलर सेल प्रतिक्रियाएं (ई) भी देते हैं (अधिक जानकारी के लिए 8 देखें)। चित्र 2A-C को 9 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्तीकरण: पीआर = फोटोरिसेप्टर; ऑन-बीपीसी = ऑन-बाइपोलर सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: समय के साथ एक्स विवो इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम में फोटोरिसेप्टर और ओएन-बाइपोलर सेल फ़ंक्शन की स्थिरता। (A) प्रकाश प्रतिक्रियाएं 100 μM बेरियम क्लोराइड और 40 μM DL-AP4 दोनों की उपस्थिति में अकेले फोटोरिसेप्टर से हर मिनट दर्ज की गईं। (बी) अकेले 100 एसएम बेरियम क्लोराइड की उपस्थिति में मंद प्रकाश चमक ओएन-द्विध्रुवी सेल फ़ंक्शन पर भारी हावी है, हालांकि उनमें एक छोटा फोटोरिसेप्टर घटक होता है। पृथक रेटिना से प्रकाश प्रतिक्रियाएं आम तौर पर 15-20 मिनट के लिए पूर्व विवो नमूना धारक को प्रभावित करने के बाद स्थिर होती हैं, और गिरावट शुरू होने से पहले कम से कम 20-25 मिनट तक स्थिर होती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: विभिन्न तापमानों और छिड़काव गति पर संयुक्त फोटोरिसेप्टर और ओएन-बाइपोलर सेल प्रतिक्रियाएं। (ए) नमूना धारक के अंदर तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस से कमरे के तापमान तक कम करने से फोटोरिसेप्टर और ओएन-बाइपोलर सेल कैनेटीक्स बहुत धीमा हो गया, लेकिन केवल मिश्रित फोटोरिसेप्टर और ओएन-बाइपोलर सेल प्रतिक्रिया में ओएन-द्विध्रुवीय सेल आयाम कम हो गया। (बी) छिड़काव दर को 2.1 एमएल/मिनट से घटाकर 0.6 एमएल/मिनट करने के परिणामस्वरूप फोटोरिसेप्टर और ऑन-बाइपोलर सेल आयामों में कमी आई लेकिन प्रतिक्रिया कैनेटीक्स में कोई बदलाव नहीं हुआ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5: ऑन-बाइपोलर सेल प्रतिक्रियाएं छिड़काव की समाप्ति के प्रति अधिक संवेदनशील होती हैं। (A) बड़े फोटोरिसेप्टर और ON-बाइपोलर सेल प्रतिक्रियाओं को 20 मिनट के लिए 2.1 mL/min के साथ छिड़काव के बाद दर्ज किया गया था। (B) 10 मिनट के लिए छिड़काव की समाप्ति के बाद 2.1 mL/min पर 10 मिनट के लिए रीपरफ्यूजन के बाद, फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रियाएं मौजूद थीं, जबकि ON-द्विध्रुवी कोशिकाओं की प्रतिक्रियाएं पूरी तरह से खो गई थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
मूल रूप से 1865 में होल्मग्रेन द्वारा उभयचर रेटिना10 से रेटिना प्रकाश प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए विकसित किया गया था, तकनीकी बाधाओं ने शुरू में ईआरजी को व्यापक रूप से उपयोग करने से रोका। फिर भी, रैग्नार ग्रैनिट और अन्य लोगों द्वारा मौलिक अध्ययनों ने ईआरजी की सेलुलर उत्पत्ति की पहचान की और फोटोरिसेप्टर और ओएन-द्विध्रुवी सेल प्रतिक्रियाओं को विवो11,12,13 से मापा। तब से, परिष्कृत तरीकों ने एक्स विवो ईआरजी रिकॉर्डिंग14,15 के अधिक व्यापक उपयोग की अनुमति दी है, हालांकि प्रतिक्रिया आयाम, विशेष रूप से ओएन-द्विध्रुवी कोशिकाओं से, तुलनात्मक रूपसे छोटे रहे। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, रेटिना फ़ंक्शन को आज विवो ईआरजी में अधिक सामान्य रूप से मापा जाता है, प्रयोगात्मक बाधाओं और रिकॉर्ड किए गए तरंगों की अधिक जटिल व्याख्या के बावजूद। यद्यपि पूर्व विवो ईआरजी शारीरिक स्थितियों को यथासंभव बारीकी से दोहराने का प्रयास करता है, फिर भी यह कृत्रिम वातावरण में और प्रणालीगत कारकों और पैथोलॉजिकल परिवर्तनों की अनुपस्थिति में रेटिना फ़ंक्शन को मापता है। हालांकि, जब विवो ईआरजी के साथ जोड़ा जाता है, तो इस सीमा का उपयोग महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि क्या बीमारी में रेटिना फ़ंक्शन में परिवर्तन रेटिना कोशिकाओं के लिए आंतरिक हैं या प्रणालीगतपरिवर्तनों के कारण होते हैं।
हाल ही में, नए डिज़ाइन किए गए पूर्व विवो ईआरजी नमूना धारकों ने कार्यप्रणाली को सरल बनाया है, जिससे एक्स विवो ईआरजी एक व्यापक शोध समुदाय 2,3,5,18 के लिए सुलभ हो गया है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित मौजूदा पैच क्लैंप या मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी उपकरण में संशोधन अधिक प्रयोगशालाओं को न्यूनतम वित्तीय निवेश और अंतरिक्ष आवश्यकताओं के साथ पूर्व विवो ईआरजी करने में सक्षम करेगा। विशेष रूप से, एक्स विवो ईआरजी तकनीक में हाल के विकास ने स्तनधारी पृथक रेटिना की प्रतिक्रिया को बढ़ाया है और इसके परिणामस्वरूप एक बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात है, जो इस प्रोटोकॉल में वर्णित अतिरिक्त प्रवर्धन चरणों के बावजूद अच्छा बना हुआ है। फिर भी, प्रकाश प्रतिक्रियाओं की गिरावट, मुख्य रूप से ओएन-द्विध्रुवी कोशिकाओं19 से, शायद एक्स विवो ईआरजी के अधिक व्यापक उपयोग में बाधा उत्पन्न की है। एम्स या लोके के माध्यम के उपयोग के परिणामस्वरूप बड़े फोटोरिसेप्टर और ओएन-बाइपोलर सेल प्रतिक्रियाएं होती हैं, जिससे उन्हें पूर्व विवो ईआरजी3 के लिए एचईपीईएस-बफर्ड रिंगर समाधान के लिए बेहतर बना दिया जाता है। अन्य प्रयोगशालाओं ने ग्लूटामाइन या ग्लूटामेट19 के साथ पूरक करके पूर्व विवो ओएन-द्विध्रुवी सेल फ़ंक्शन को स्थिर किया। यह रिपोर्ट दर्शाती है कि मानव दाता आंखों सहित पृथक रेटिना से बड़ी और स्थिर प्रकाश प्रतिक्रियाएं कैसे प्राप्त करें, जैसा कि पहले बताया गयाथा।
महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक मापदंडों में रेटिना का तापमान शामिल है, जिसे शारीरिक सीमा के भीतर रखा जाना चाहिए, और तेजी से छिड़काव दर। एक्स विवो ईआरजी नमूना धारक में तापमान को कम करने के सबसे ध्यान देने योग्य प्रभाव फोटोरिसेप्टर और ओएन-बाइपोलर कोशिकाओं दोनों में धीमी प्रतिक्रिया कैनेटीक्स और एक क्षीण ऑन-बाइपोलर सेल आयाम हैं। हालांकि तापमान को कम करने से फोटोरिसेप्टर और ओएन-बाइपोलर कोशिकाओं से संयुक्त प्रतिक्रिया में फोटोरिसेप्टर आयाम पर बहुत कम प्रभाव पड़ता है, यह दोनों सेल प्रकारों से प्रतिक्रिया कैनेटीक्स में अंतर परिवर्तन के कारण एक कलाकृति हो सकती है।
रेटिना फ़ंक्शन के लिए पर्याप्त छिड़काव दर विशेष रूप से महत्वपूर्ण प्रतीत होती है, ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति करने और अपशिष्ट उत्पादों को हटाने की सबसे अधिक संभावना है। जबकि फोटोरिसेप्टर और ओएन-बाइपोलर सेल आयाम दोनों छिड़काव दर में मध्यम कमी से कुछ हद तक कम हो जाते हैं, यहां तक कि छिड़काव की एक छोटी समाप्ति ने ओएन-बाइपोलर को समाप्त कर दिया लेकिन फोटोरिसेप्टर फ़ंक्शन को नहीं। इसका तात्पर्य यह है कि फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रियाएं अधिक मजबूत होती हैं और आंखों में अधिक आसानी से संरक्षित हो सकती हैं जो एक महत्वपूर्ण देरी के साथ प्रयोग से गुजरती हैं, जैसे कि मानव दाता आंखें8। इस संदर्भ में, यह उल्लेखनीय है कि ओएन-बाइपोलर सेल फ़ंक्शन कई घंटों तक ऑक्सीजन युक्त एम्स के माध्यम में आंखों के कप को संग्रहीत करके कम नहीं होता है। इसलिए हम अनुमान लगाते हैं कि पूर्व विवो नमूना धारक में छिड़काव बंद होने पर ओएन-बाइपोलर सेल फ़ंक्शन का नुकसान नमूना धारक में रेटिना के आसपास की छोटी मात्रा में ऑक्सीजन और अन्य पोषक तत्वों की तेजी से कमी के कारण हो सकता है। यह उन रिपोर्टों द्वारा समर्थित है कि फोटोरिसेप्टर और विशेष रूप से, मानव रेटिना से ओएन-बाइपोलर सेल प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए मृत्यु से न्यूक्लियेशन तक एक छोटी देरी महत्वपूर्ण है, और यह कि पोस्टमॉर्टम हाइपोक्सिया रेटिना न्यूरोनल फ़ंक्शन8 को अपरिवर्तनीय क्षति के लिए सबसे संभावित उम्मीदवार है। जबकि पूर्व विवो ईआरजी के लिए प्रयोगात्मक मापदंडों को माउस रेटिना में अनुकूलित किया गया था, फिर भी उन्होंने बड़े जानवरों और मानव दाता आंखों से रेटिना नमूनों के लिए रिकॉर्डिंग स्थितियों में सफलतापूर्वक सुधार किया।
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Disclosures
लेखकों में से किसी के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को नेशनल आई इंस्टीट्यूट अनुदान ईवाई02665 और ईवाई031706 और इंटरनेशनल रेटिना रिसर्च फाउंडेशन द्वारा डॉ विनबर्ग, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ कोर ग्रांट (ईवाई014800) और अंधापन को रोकने के लिए अनुसंधान से अप्रतिबंधित अनुदान, न्यूयॉर्क, एनवाई द्वारा ओप्थाल्मोलॉजी और विजुअल साइंसेज विभाग, यूटा विश्वविद्यालय को समर्थित किया गया था। डॉ. फ्रैंस विनबर्ग अंधेपन को रोकने के लिए एक शोध / डॉ एच जेम्स और कैरोल फ्री करियर डेवलपमेंट अवार्ड के प्राप्तकर्ता भी हैं, और एआरवीओ आईफाइंड अनुदान के डॉ सिल्के बेकर। हम द स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट से डॉ ऐनी हैनेकेन को चित्रा 2 ई में दिखाए गए रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग की जाने वाली दाता आंख प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
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