Optimización de la configuración y las condiciones del electrorretinograma ex vivo para estudiar la función de la retina en ojos pequeños y grandes

Resumen

La modificación de la matriz de electrodos múltiples existente o del equipo de abrazadera de parche hace que el electrorretinograma ex vivo sea más accesible. Los métodos mejorados para registrar y mantener las respuestas de luz ex vivo facilitan el estudio de la función de los fotorreceptores y las células bipolares ON en la retina sana, modelos animales de enfermedades oculares y retinas de donantes humanos.

Resumen

Las mediciones de las respuestas neuronales a la luz de la retina son fundamentales para investigar la fisiología de la retina sana, determinar los cambios patológicos en las enfermedades de la retina y probar intervenciones terapéuticas. El electrorretinograma ex vivo (ERG) permite la cuantificación de las contribuciones de tipos de células individuales en la retina aislada mediante la adición de agentes farmacológicos específicos y la evaluación de los cambios intrínsecos al tejido independientemente de las influencias sistémicas. Las respuestas a la luz retiniana se pueden medir utilizando un soporte de muestra ERG ex vivo especializado y una configuración de grabación, modificada a partir de la abrazadera de parche existente o el equipo de matriz de microelectrodos. En particular, el estudio de las células ON-bipolares, pero también de los fotorreceptores, se ha visto obstaculizado por la disminución lenta pero progresiva de las respuestas a la luz en el ERG ex vivo a lo largo del tiempo. El aumento de la velocidad de perfusión y el ajuste de la temperatura de perfusión mejoran la función retiniana ex vivo y maximizan la amplitud y estabilidad de la respuesta. El ERG ex vivo permite de manera única el estudio de tipos individuales de células neuronales de la retina. Además, las mejoras para maximizar las amplitudes de respuesta y la estabilidad permiten la investigación de respuestas de luz en muestras de retina de animales grandes, así como en ojos de donantes humanos, lo que hace que el ERG ex vivo sea una valiosa adición al repertorio de técnicas utilizadas para investigar la función de la retina.

Introducción

La electrorretinografía mide la función retiniana en respuesta a la luz¹. Es esencial para estudiar la fisiología y fisiopatología de la retina, y medir el éxito de las terapias para las enfermedades de la retina. El ERG in vivo es ampliamente utilizado para evaluar la función retiniana en organismos intactos, pero tiene limitaciones significativas ^2,3. Entre estos, el análisis cuantitativo de los tipos de células retinianas individuales en el ERG in vivo se ve obstaculizado, ya que registra la suma de los cambios potenciales y, por lo tanto, las respuestas superpuesta....

Protocolo

Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Estudios Animales de la Universidad de Utah. Los ojos de cerdo para la demostración de este video se obtuvieron postmortem del matadero (Sustainable Swine Resources, Johnsonville). Los ojos se obtuvieron de donantes humanos después de la muerte cerebral o cardíaca con el consentimiento para uso en investigación a través del Utah Lions Eye Bank, el San Diego Eye Bank o Lifesharing, que están totalmente acreditados por la FDA, la Asociación de Organizaciones de Obtención de Órganos (AOPO) y ....

Resultados

Ex vivo ERG permite el registro de respuestas de luz de fotorreceptores y células bipolares reproducibles y estables, por ejemplo, de la retina del ratón (Figura 2A-C). El registro de las respuestas de los fotorreceptores de las retinas de donantes humanos es posible con un retraso postmortem de hasta 5 h de la enucleación (Figura 2D) y de las respuestas de las células ON-bipolares con un retraso de enucleación de <2.......

Discusión

Originalmente desarrollado en 1865 por Holmgren para medir las respuestas de luz retiniana de la retina de anfibios¹⁰, las limitaciones técnicas inicialmente impidieron que el ERG fuera ampliamente utilizado. Sin embargo, los estudios seminales realizados por Ragnar Granit y otros identificaron los orígenes celulares del ERG y midieron las respuestas de los fotorreceptores y las células bipolares ON ex vivo^11,12,13

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vaso de 2 mm	WPI	2026-10	materiales para preparar electrodo
Ag/AgCl Electrodo	World Precision Instruments	EP1	materiales para preparar electrodo
Medio de Ames	Sigma Aldrich	A1420	medio de perfusión
cloruro de bario	Sigma Aldrich	B0750	bloqueador de canales de potasio
DL-AP4	Tocris	0101	antagonista glutamatérgico de amplio espectro
OcuScience Ex vivo Adaptador ERG	OcuScience	n/a	ex vivo Portamuestras ERG
Conector luer roscado	McMaster-Carr	51525K222 o 51525K223	Materiales para preparar electrodos