Este protocolo describe un método eficiente para disociar el esputo en una suspensión de una sola célula y la posterior caracterización de subconjuntos celulares en plataformas citométricas de flujo estándar.
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Artículo de método
Análisis de esputo de calidad controlada por citometría de flujo
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Resumen
Resumen
El esputo, ampliamente utilizado para estudiar el contenido celular y otras características microambientales para comprender la salud del pulmón, se analiza tradicionalmente utilizando metodologías basadas en citología. Su utilidad es limitada porque la lectura de las diapositivas requiere mucho tiempo y requiere personal altamente especializado. Además, los desechos extensos y la presencia de demasiadas células epiteliales escamosas (SEC), o células de la mejilla, a menudo hacen que una muestra sea inadecuada para el diagnóstico. Por el contrario, la citometría de flujo permite el fenotipado de alto rendimiento de las poblaciones celulares, al tiempo que excluye los desechos y las SEC.
El protocolo presentado aquí describe un método eficiente para disociar el esputo en una suspensión de una sola célula, teñir y fijar poblaciones celulares, y adquirir muestras en una plataforma citométrica de flujo. Aquí se presenta una estrategia de cierre que describe la exclusión de escombros, células muertas (incluidas las SEC) y dobletes celulares. Además, este trabajo también explica cómo analizar células viables de esputo único basadas en un grupo de poblaciones positivas y negativas de diferenciación (CD)45 para caracterizar subconjuntos de linaje hematopoyético y epitelial. También se proporciona una medida de control de calidad mediante la identificación de macrófagos específicos del pulmón como evidencia de que una muestra se deriva del pulmón y no es saliva. Finalmente, se ha demostrado que este método se puede aplicar a diferentes plataformas citométricas proporcionando perfiles de esputo de un mismo paciente analizados en tres citómetros de flujo; Navios EX, LSR II y Lyric. Además, este protocolo se puede modificar para incluir marcadores celulares adicionales de interés. Aquí se presenta un método para analizar una muestra completa de esputo en una plataforma citométrica de flujo que hace que el esputo sea susceptible de desarrollar diagnósticos de alto rendimiento de enfermedad pulmonar.
Introducción
Los avances técnicos en el hardware y el software de los citómetros de flujo han permitido identificar muchas poblaciones celulares distintas simultáneamente1,2,3,4. La utilización del citómetro de flujo en la investigación de células hematopoyéticas, por ejemplo, ha llevado a una comprensión mucho mejor del sistema inmune2 y la jerarquía celular del sistema hematopoyético5, así como a la distinción diagnóstica de una multitud de cánceres sanguíneos diferentes6,7,8.....
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Protocolo
Todos los pasos del procesamiento del esputo se realizan en un gabinete de seguridad biológica con el equipo de protección personal adecuado.
1. Preparación del reactivo antes de iniciar la disociación del esputo
- Descongele el 1% de paraformaldehído (PFA), 25 ml por muestra en hielo y manténgalo frío hasta su uso.
PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico por inhalación y contacto con la piel. Prepare el fijador de acuerdo con las instrucciones del fabricante y congele a -20 °C en alícuotas de 25 ml hasta su uso. - Aproximar el peso de la muestra y descongelar suficiente 0,1% de Ditiotreitol (TDT) para el paso 2.2 y llevarlo a 37 °C....
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Resultados
Este protocolo se desarrolló teniendo en cuenta un entorno de laboratorio clínico. El enfoque durante el desarrollo del protocolo fue en la simplicidad, la eficiencia y la reproducibilidad. Se encontró que el paso más lento en el procesamiento del esputo era contar las células. Por lo tanto, el protocolo está configurado de tal manera que el procesamiento del esputo y el etiquetado celular se pueden realizar independientemente del recuento de células sin pérdida de tiempo. Luego se puede obtener un recuento celular preci.......
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Discusión
El contenido celular del esputo incluye una gran variedad de células de gran alcance, a menudo acompañadas de una gran cantidad de escombros37. Además, el análisis del esputo requiere un control de calidad que confirme que la muestra se recoge del pulmón en lugar de de la cavidad oral38. Por lo tanto, no es tan sencillo analizar el esputo por citometría de flujo como lo es para la sangre, por ejemplo, que libera una suspensión celular mucho más limpia y homogénea. Este prot.......
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Divulgaciones
Todos los autores son empleados pasados o actuales de bioAffinity Technologies.
Agradecimientos
Queremos agradecer a David Rodríguez por su ayuda con la preparación de la figura. Las muestras de esputo se ejecutaron en el BD LSR II en el UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, con el apoyo de UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC en UT Health) y UL1 TR001120 (subvención de CTSA).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1% Paraformaldehído Flow-Fix | Polysciences | 25037 | |
| 100 µ M coladores de células de nylon, Falcon #352360 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 3 M NaOH | EMD | SX0593-1 | |
| 50 mL tubo cónico falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Alexa488 antihumano CD19 BioLegend | 302219 | ||
| Alexa488 antihumano CD3 | BioLegend | 300415 | |
| Alexa488 anti-citoqueratina humana | BioLegend | 628608 | |
| Alexa488 Isotipo PanCK, CD3 y CD19 | BioLegend | 400129 | |
| BV510 antihumano CD45 | BioLegend | 304036 | |
| CD66b Isotipo FITC | BD Biosciences | 555748 | |
| CompBead Plus Perlas de compensación | BD Biosciences | 560497 | |
| Corning Botella estéril desechable de poliestireno 250 mL | Fisher Scientific | 09-761-4 | |
| Corning Poliestireno desechable frasco estéril 500 mL | Fisher Scientific | 09-761-10 | |
| CS& Cuentas T | BD Biosciences | 655051 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| FITC anti-humano CD66b | GeneTex | GTX75907 | |
| Tinción de viabilidad fijable | BD Biosciences | 564406 | |
| FlowCheck | Beckman Coulter | A69183 | |
| FlowSet | Beckman Coulter | A69184 | |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| NAC | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Cuentas NIST, 05 μ M | Polysciences | 64080 | |
| Cuentas NIST, 20 μ M | Polysciences | 64160 | |
| Cuentas NIST, 30 μ M | Polysciences | 64170 | |
| PE antihumano CD45 | BioLegend | 304039 | |
| PE-CF594 antihumano EpCAM | BD Biosciences | 565399 | |
| PE-CF594 CD206/EpCAM Isotipo | BD Biosciences | 562292 | |
| PE-CR594 antihumano CD206 | BD Biosciences | 564063 | |
| Citrato de sodio dihidratado | EMD | SX0445-1 | |
| Solución de azul de tripano, 0,4 % | Fisher Scientific | 15250061 |
Referencias
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M.
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Reimpresiones y permisos
