Summary
אופטוגנטיקה היא כלי רב עוצמה עם יישומים רחבי היקף. פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג ביטוי גנים שאינו ניתן לניתוק לאור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 בעלת אור כחול.
Abstract
מערכות ביטוי גנים לא יסולא בפז הן כלי רב ערך לחקר תהליכים ביולוגיים. מערכות ביטוי אופטוגנטיות יכולות לספק שליטה מדויקת על תזמון ביטוי הגנים, המיקום והמשרעת באמצעות אור כסוכן המעורר. בפרוטוקול זה, מערכת ביטוי אופטוגנטית משמשת להשגת ביטוי גנים שאינו ניתן לניתוק לאור בעוברי דגי זברה. מערכת זו מסתמכת על גורם שעתוק מהונדס הנקרא TAEL המבוסס על גורם שעתוק המופעל על ידי אור ממקור טבעי מהחיידק E. litoralis. כאשר הוא מואר באור כחול, TAEL דימרייז, נקשר לאלמנט הרגולטורי הקוגניטיבי שלו הנקרא C120, ומפעיל תמלול. פרוטוקול זה משתמש בעוברי דגי זברה מהונדסים המבטאים את גורם התמלול של TAEL תחת שליטתו של מקדם ה- ubb בכל מקום. יחד עם זאת, האלמנט הרגולטורי C120 מניע את הביטוי של גן עיתונאי פלואורסצנטי (GFP). באמצעות לוח LED פשוט כדי לספק הפעלת אור כחול, אינדוקציה של ביטוי GFP ניתן לזהות תחילה לאחר 30 דקות של תאורה ומגיע לשיא של אינדוקציה יותר מפי 130 לאחר 3 שעות של טיפול באור. אינדוקציה של ביטוי יכולה להיות מוערכת על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) ועל ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו היא גישה רב-תכליתית וקלה לשימוש לביטוי גנים אופטוגנטיים.
Introduction
מערכות ביטוי גנים לא ניתנות לתקדים מסייעות לשלוט בכמות, בתזמון ובמיקום של ביטוי גנים. עם זאת, השגת שליטה מרחבית וטמפורלית מדויקת באורגניזמים רב-תאיים הייתה מאתגרת. בקרת זמן מושגת בדרך כלל על ידי הוספתתרכובות מולקולה קטנה 1 או הפעלה של מקדמי הלם חום2. עם זאת, שתי הגישות חשופות לסוגיות של תזמון, כוח אינדוקציה ותגובות לחץ מחוץ למטרה. שליטה מרחבית מושגת בעיקר על ידי שימוש ביזמים ספציפיים לרקמות3, אבל גישה זו דורשת מקדם מתאים או אלמנט רגולטורי, אשר לא תמיד זמינים, וזה לא תורם אינדוקציה ברמת תת רקמות.
בניגוד לגישות קונבנציונליות כאלה, מפעילי שעתוק אופטוגנטיים המופעלים על ידי אור יש פוטנציאל לשליטה מרחבית וטמפורלית עדינה יותר של ביטויגנים 4. מערכת TAEL/C120 בעלת אור כחול פותחה ומותבת לשימוש בעוברי דגי זברה5,6. מערכת זו מבוססת על גורם שעתוק אנדוגני המופעל על ידי אור מהחיידק E. litoralis7,8. מערכת TAEL/C120 מורכבת מפעיל תמלול בשם TAEL המכיל תחום הפעלה Kal-TA4, תחום LOV מגיב אור כחול (חישת מתח אור)ותחוםכריכת DNA של הסליל-תור-סליל (HTH). כאשר מוארים, תחומי LOV עוברים שינוי קונפורמציה המאפשר לשתי מולקולות TAEL לעמעם, להיקשר למקדם C120 מגיב TAEL, וליזום תמלול של גן במורד הזרם של עניין5,8. מערכת TAEL/C120 מציגה אינדוקציה מהירה וחזקה עם רעילות מינימלית, והיא יכולה להיות מופעלת על ידי מספר שיטות אספקת אור שונות. לאחרונה, שיפורים במערכת TAEL / C120 נעשו על ידי הוספת אות לוקליזציה גרעינית ל- TAEL (TAEL-N) ועל ידי צימוד האלמנט הרגולטורי C120 למקדם בסיס cFos (C120F) (איור 1A). שינויים אלה שיפרו את רמות האינדוקציה ביותר מפי 15.
בפרוטוקול זה, לוח LED פשוט משמש להפעלת מערכת TAEL / C120 ולזירוז הביטוי בכל מקום של גן כתב, GFP. אינדוקציה של ביטוי יכולה להיות מנוטרת באופן איכותי על ידי התבוננות בעוצמת הפלואורסצנטיות או כמותית על ידי מדידת רמות התמליל באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR). פרוטוקול זה יציג את מערכת TAEL/ C120 ככלי רב-תכליתי וקל לשימוש המאפשר רגולציה חזקה של ביטוי גנים ב- vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה בוצע באישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה מרסד.
1. חציית דגי זברה ואוסף עוברים
- שמור על קווי דגי זברה מהונדסים נפרדים המכילים את מפעיל התמלול של TAEL או את הגן הכתב הנשלט על ידי C120 כדי למזער הפעלה מזויפת.
- לחצות 6-8 דגי זברה בוגרים מכל שורה בשיטות סטנדרטיות9 כדי לייצר עוברים מהונדסים כפולים המכילים הן את רכיבי TAEL והן את רכיבי C120(איור 1B).
הערה: לחלופין, שני הרכיבים יכולים לבוא לידי ביטוי באופן ארעי באמצעות מיקרו-ינון של mRNA או DNA פלסמיד בשיטות סטנדרטיות10. - לאסוף עוברים במנות פטרי המכילות מי ביצים (60 מיקרוגרם / מ"ל מלח ים מיידי האוקיינוס מומס במים מזוקקים), עם כ 30 עוברים לכל תנאי להיבדק.
- מניחים את הכלים בקופסה אטומה לאור או מכסים בנייר אלומיניום כדי למזער הפעלה לא מכוונת באור הסביבה (ראו טבלה 1).
2. אינדוקציה אור גלובלית
- השתמש בלוח LED באור כחול (465 ננומטר) כדי לספק הפעלת אור כחול למספר עוברים בו-זמנית.
- מקם את לוח ה- LED ביחס לצלחות הפטרי המכילות עוברים כך שכוח האור בפועל המתקבל על ידי העוברים הוא כ - 1.5 מ"ר / ס"מ2 כפי שנמדד על ידי מד כוח אור ואנרגיה (איור 2A).
- פעמו את האור במרווחי זמן של שעה אחת בהפעלה/שעה באמצעות ממסר טיימר אם הוא מאיר במשך יותר מ-3 שעות כדי להפחית את הסיכון לצילום להפעלה של תמלול TAEL5,8.
הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב את משך התאורה המדויק עבור יישומים ספציפיים. בפרוטוקול זה, דוגמאות של משך תאורה של 30 דקות, 1 שעות, 3 שעות ו 6 שעות מסופקות. - הסר מכסי צלחת פטרי כדי למזער את פיזור האור מן ה עיבוי.
- מניחים מנות פטרי המכילות עוברי בקרה בקופסה חסינת אור או מכסים בנייר אלומיניום לבקרות כהות.
3. הערכה כמותית של אינדוקציה על ידי qRT-PCR
- יש להסיר עוברים מההארה לאחר משך ההפעלה הרצוי.
- לחלץ RNA כולל מ 30-50 אור מופעל ו 30-50 עוברים כהים באמצעות ערכת בידוד RNA בעקבות הוראות הערכה.
- מעבירים עוברים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ומסירים עודפי מי ביצים. מוסיפים חוצץ תמוגה ומותגנים את העוברים עם עלי פלסטיק.
- העבר את ה- lysate לעמודה שסופקה על-ידי ערכה והמשיך בהוראות הערכה. מיד להמשיך לשלב 3.3 או לאחסן RNA מטוהר ב -20 °C (50 °F) עד -80 °C (70 °F).
- השתמש RNA כולל של 1 מיקרוגרם לסינתזת cDNA באמצעות ערכת סינתזה של cDNA בהתאם להוראות הערכה.
- קח צינור PCR 0.2 מ"ל דק, הוסף 1 מיקרוגרם של RNA ל 4 μL של 5x cDNA תגובה מאסטר תערובת (המכיל חיץ ממוטב, אוליגו-dT פריימרים אקראיים, ו- dNTPs), 1 μL של פתרון תמלול הפוך 20x, ומים ללא נוקלאז לנפח כולל של 20 μL.
- מניחים את הצינור בתרמוציקלר המתוכנת כדלקמן: 22 °C (70 °F) למשך 10 דקות, 42 °C (55 °F) למשך 30 דקות, 85 °C (5 דקות), ולאחר מכן להחזיק ב 4 °C (70 °F). המשך מיד לשלב 3.4 או לאחסן cDNA ב -20 °C (70 °F).
- הכן תגובות qPCR המכילות תערובת מאסטר אנזימים ירוקים SYBR, cDNA מדולל פי 5 (שלב 3.3) ו- 325 ננומטר של כל פריימר עבור GFP.
הערה: פריימרים המשמשים בפרוטוקול זה באופן הבא. GFP קדימה: 5'-ACGACGGCAACTACACACACC-3'; GFP הפוך: 5'-GTCCTCCTTGAATGTCGATGC-3'; ef1a קדימה 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a reverse: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3'). - בצע תגובות qPCR במחשב PCR בזמן אמת.
הערה: תוכנית PCR: הפעלה ראשונית ב 95 °C (55 °F) במשך 10 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 30 s ב 95 °C (55 °F), 30 s ב 60 °C (50 °F), ו 1 דקות ב 72 °C (72 °F). - בצע ניתוח עקומת המסה לאחר השלמת ה- PCR כדי לקבוע את הספציפיות לתגובה. בצע שלושה שכפולים טכניים עבור כל דגימה.
- חשב אינדוקציה המופעלת על ידי אור כשינוי קיפול ביחס לעוברים שנשמרו בחושך באמצעות שיטת2 -ΔΔCt 11. ניתן לקבוע משמעות סטטיסטית באמצעות חבילת תוכנה לסטטיסטיקה.
4. הערכה איכותית של אינדוקציה על ידי מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות
- הסר את העוברים מן התאורה לאחר משך ההפעלה הרצוי.
- לשתק עוברים להדמיה ב 3% methylcellulose המכיל 0.01% tricaine בשקופיות דיכאון זכוכית.
- השג תמונות פלואורסצנטיות וב brightfield בסטריומקרוסקופ פלואורסצנטי המחובר למצלמה דיגיטלית באמצעות הגדרות מסנן GFP סטנדרטיות. השתמש בהגדרות זהות של רכישת תמונות עבור כל הדוגמאות.
- מזג תמונות Brightfield ופלואורסצנטיות לאחר הרכישה עם תוכנת עיבוד תמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עבור הדגמה זו, קו כתב GFP מגיב C120(Tg(C120F:GFP)ucm107)נחצה עם קו מהונדס המבטא TAEL-N בכל מקום מן ubiquitin b (ubb) מקדם (Tg (ubb:TAEL-N)ucm113))כדי לייצר עוברים מהונדסים כפולים המכילים את שני האלמנטים. 24 שעות לאחר ההפריה, העוברים נחשפו להפעלת האור הכחול, פעמו בתדר של 1 שעות על /1 שעה כבויה. אינדוקציה של ביטוי GFP כותמה על-ידי qRT-PCR ב- 30 דקות, שעה אחת, 3 שעות ו- 6 שעות לאחר ההפעלה (איור 2B וטבלה 1). בהשוואה לעוברים אחים שליטה שנשמרו בחושך, אינדוקציה של ביטוי GFP זוהתה ברגע 30 דקות לאחר החשיפה לאור הכחול. רמות ביטוי GFP המשיכו לעלות עד 6 שעות לאחר ההפעלה בהתמדה.
אינדוקציה GFP הוערך גם באופן איכותי על ידי בחינת עוצמת הפלואורסצנטיות בו זמנית נקודות לאחר ההפעלה (איור 2C-F). פלואורסצנטיות GFP מעל רמות הרקע נצפתה לראשונה ב 3 שעות לאחר ההפעלה והפך בהיר יותר באופן ניכר ב 6 שעות לאחר ההפעלה. לעומת זאת, עוברים שליטה בכל נקודות הזמן שנשמרו בחושך לא הציגו פלואורסצנטיות GFP ניכרת (איור 2G-J).
איור 1: סכמטי של פונקציית TAEL/C120 ועיצוב ניסיוני. (A)מערכת TAEL/C120 מורכבת מפעיל תמלול הנקרא TAEL התמזג לאות לוקליזציה גרעיני (TAEL-N) ואלמנט רגולטורי רספונסיבי TAEL הנקרא C120 בשילוב עם מקדם בסיס cFos (C120F) ביטוי נהיגה של גן עניין. תמלול תלוי TAEL פעיל בנוכחות אור כחול אך לא בחושך. אן-אל-אס, אות לוקליזציה גרעינית. (B)בפרוטוקול זה, קו מהונדס מבטא TAEL-N בכל מקום (Tg (ubb:TAEL-N)נחצה לקו כתב GFP מונחה C120 (Tg(C120F:GFP)) כדי לייצר עוברים מהונדסים כפולים. החל מ-24 כ"ס, העוברים חשופים להפעלת אור כחול למשך זמן שונים של עד 6 איורים של h שנוצרו באמצעות כלי איור מדעי מבוסס אינטרנט (ראו טבלת חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות מייצגות של ביטוי גנים המופעל באמצעות אור עם TAEL/C120. (A)מערך הפעלת אור טיפוסי כולל מקור אור LED כחול הממוקם באינקובטור. מנות פטרי המכילות עוברים של דגי זברה ממוקמות ביחס למקור האור, כך שהספק המתקבל של האור הוא כ-1.5 מ"ק/ס"מ2 (קו מנוקד). מכסי צלחת פטרי מוסרים במהלך הפעלת אור כדי למזער את פיזור האור. (B)כימות של רמות mRNA GFP על-ידי qRT-PCR בנקודות הזמן שצוינו לאחר ההפעלה עם אור כחול. הנתונים מוצגים כגיוס קיפול GFP ביחס לעוברי בקרת אחים שנשמרים בחושך. נקודות מייצגות שכפולים ביולוגיים (מצמדים). פסים אופקיים מלאים מייצגים את הממוצע. קווי שגיאה, סטיית תקן. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. ANOVA חד-כיוונית קבעה ערכי p. (C-J) תמונות מייצגות המציגות את עוצמת הפלואורסצנטיות של העוברים שנחשפים לאור כחול (C-F) או נשמרים בחושך (G-J). תמונות פלואורסצנטיות (ירוקות) מוזגו עם תמונות בהירות תואמות (גווני אפור): סרגלי קנה מידה, 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| אינדוקציה לקפל GFP אור כחול (465 ננומטר) |
אינדוקציה לקפל GFP תאורת סביבה |
||||||
| זמן לאחר הארה | התכוון | גבול עליון | גבול תחתון | התכוון | גבול עליון | גבול תחתון | ערך p |
| 30 דקות | 5.363121044 | 8.15857193 | 3.525502696 | 0.661534683 | 1.097728244 | 0.398667102 | 0.005291 |
| שעה 1 | 23.44 | 46.35044081 | 11.85160592 | 2.638682529 | 4.368971424 | 1.593657823 | 0.011145 |
| 3 שעות | 48.09177693 | 71.99347359 | 32.12539822 | 8.280376038 | 24.86850106 | 2.757087255 | 0.059959 |
| 6 שעות | 131.4637117 | 163.4891638 | 105.7116392 | 16.66536842 | 27.94334716 | 9.939199585 | 0.003102 |
טבלה 1: השוואה בין ביטוי המושרה על-ידי TAEL/C120 לאור כחול והסביבה. קפל את האינדוקציה של רמות ה- mRNA של GFP לאחר חשיפה להפעלת אור כחול (465 ננומטר) או אור הסביבה למשך פרק הזמן שצוין, מנורמל לשליטה בעוברים אחים שנשמרו בחושך. רמות mRNA היו מכומתות על ידי qRT-PCR. הנתונים מדווחים כגיוס קיפול ממוצע +/- גבולות עליונים ותחתונים. ערכי p נקבעו על-ידי בדיקות tמרובות. n = 3 מצמדים עבור כל נקודות הזמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת TAEL/C120 האופטוגנטית להשגת ביטוי גנים כחול שאינו ניתן לתפוקה באור. מערכת זו מורכבת מפעיל תמלול, TAEL, כי dimerizes על תאורה עם אור כחול ומפעיל שעתוק של גן עניין במורד הזרם של אלמנט רגולטורי C120. ביטוי מושרה של כתב GFP ניתן לזהות לאחר מעט כמו 30 דקות של חשיפה לאור, דבר המצביע על כך גישה זו בעלת קינטיקה מהירה יחסית מגיבה.
מספר גורמים יכולים להשפיע על רמות האינדוקציה. הקריטיים ביותר הם אורך הגל והעוצמה של הפעלת האור. בפרוטוקול זה נעשה שימוש 465 ננומטר נורות LED ב- 1.5 W / cm2. אורכי גל קצרים וארוךים יותר (אור סגול וירוק, בהתאמה) וכוח תאורה נמוך יותר אינם מפעילים ביטוי ביעילות (הנתונים אינם מוצגים). מצד שני, יותר כוח אור מגביר את הסיכון לצילום העוברים. כך, לשימוש מוצלח במערכת TAEL, הפעלת האור חייבת להיות (1) בטווח הכחול של ספקטרום האור הנראה ו-(2) בעוצמה מספקת כדי לאזן הפעלה יעילה של TAEL עם סיכון פוטודאם מופחת. עוצמת האור היעילה עשויה להשתנות בהתאם לתנאי הניסוי ולכן ייתכן שיהיה צורך לקבוע אותו אמפירית. יש להקפיד גם להגן על העוברים מאור הסביבה, המכיל כמות מסוימת של אור כחול, לפני ההפעלה. נמצא כי ביטוי תלוי TAEL / C120 יכול להיות מושרה על ידי אור סביבה רחב טווח, אם כי ברמות נמוכות בהרבה בהשוואה לאור כחול בלבד (טבלה 1).
בעוד ביטוי GFP ניתן לזהות תחילה על ידי qPCR לאחר 30 דקות של תאורה, רמות הביטוי אינן יציבות. ובכל זאת, הם ממשיכים לעלות עד שהגיעו לשיא של 3 שעות של טיפול קל, ולאחר מכן רמות ביטוי גבוהות אלה נשמרות עד 6 שעות. תוצאות אלה מצביעות על כך שבנוסף לאורך הגל וכוח האור, רמות הביטוי הנגרמות על-ידי TAEL/C120 תלויות גם הן במשך התאורה, לפחות עד שהמערכת תגיע למצב מרבי או רווי. בניגוד לתוצאות qPCR אלה, איננו מבחינים באופן איכותי בפלואורסצנטיות GFP ניכרת עד לאחר 3 שעות של תאורה, ועוצמת הפלואורסצנטיות ממשיכה לגדול עד 6 שעות של תאורה. הפער בין התצפיות של עוצמת ה-qPCR לעוצמת הפלואורסצנטיות מוסבר ככל הנראה על ידי הזמן הנוסף הדרוש לסינתזה, קיפול וגורמי התבגרות GFP שעשויים להשתנות בהתאם לגן העניין. לכן, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה מסוימת של משך התאורה בהתאם ליישום.
פרוטוקול זה הציג את השיטה הפשוטה ביותר להפעלת מערכת TAEL/ C120 באמצעות לוח LED באור כחול להארת עוברים של דגי זברה ברחבי העולם. לגישה זו יש את היתרונות של קלות השימוש והחסכונות. עם זאת, הפעלת אור יכולה גם להיות נשלטת מרחבית במידת הצורך. הוכח בעבר כי ביטוי המושרה על ידי TAEL יכול להיות מוגבל מרחבי באמצעות שיטות מרובות כדי לספק את המשתמש מוגדר, בדוגמת אור כחול5. ספציפיות מרחבית נוספת ניתן להשיג באמצעות מקדמים ספציפיים לרקמות כדי לווסת את הביטוי של מפעיל תמלול TAEL6.
בהשוואה למערכות ביטוי שאינן מאפשרות שימוש בתרופות או בחום, מערכות ביטוי אופטוגנטיות עשויות להציע ביטוי יתר של שליטה מרחבית וטמפורלית טובה יותר באמצעות אור כסוכן המעורר. בנוסף ל- TAEL/ C120, פותחו מערכות תמלול אחרות המופעלות באור12,13,14,15. עם זאת, TAEL/ C120 עשוי להיות מתאים במיוחד לשימוש דגי זברה (ומערכות רב תאיות אחרות) מכמה סיבות. ראשית, מפעיל התמלול של TAEL מתפקד כהומודימר, המפשט את מספר הרכיבים הנדרשים. בנוסף, חלבונים המכילים תחום LOV כגון TAEL דורשים כרומופור פלאבין לספיגת אור16. קופקטור זה נמצא אנדוגני בתוך תאים בעלי חיים, הסרת הצורך להוסיף כרומופור אקסוגני כמו עם מערכות אחרות. לבסוף, TAEL מופעל צפוי להיות מחצית חיים קצרה יחסית של כ 30 s בהיעדר אור כחול8, המאפשר שליטה מדויקת יותר על / כיבוי. עם זאת, מחצית חיים קצרה זו פירושה גם כי ביטוי ארוך טווח או כרוני ידרוש הארה ארוכת טווח של עוברים, אשר עשוי או לא עשוי להיות רצוי בהתאם לנסיבות.
לסיכום, פרוטוקול זה מדגים כי מערכת TAEL/C120 היא מערכת ביטוי גנים המופעלת באור כחול, קלה לשימוש, בעלת קינטיקה מהירה ומגיבה, ומתאימה במיוחד ליישומי vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לסטפן מטרנה ולחברים במעבדות וו ומטורנה על הצעות והערות מועילות על פרוטוקול זה. אנו מודים לאנה ריד, קווין גרדנר ולורה מוטה-מינה על דיון ותובנות יקרי ערך בעת פיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH; R03 DK106358) והוועדה לתיאום חקר הסרטן של אוניברסיטת קליפורניה (CRN-20-636896) ל- S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C.
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).
