Determinación analítica de la función mitocondrial de homogeneizados de tumores sólidos extirpados

Todas las células están íntimamente unidas por su necesidad de producir y consumir trifosfato de adenosina (ATP), la moneda de energía molecular. A medida que las mutaciones celulares dan lugar a la formación de tumores, las mitocondrias aseguran la supervivencia a través de la diversificación de la producción de energía que a menudo es fenotípicamente distinguible del tejido no canceroso^1,2,3. Como tal, existe una necesidad crítica de un perfil rápido y profundo de la función respiratoria mitocondrial para facilitar la clasificación del tipo de tumor, el inicio del cáncer, la progresión y la respuesta al tratamiento.

Las funciones respiratorias de las muestras de tejido extirpado no se pueden evaluar intactas ya que los sustratos primarios para OXPHOS no son permeables a las células. Para superar esta limitación, las mitocondrias se pueden preparar mediante aislamiento, permeabilización química u homogeneización mecánica. El aislamiento mitocondrial se considera durante mucho tiempo como un estándar de oro para la evaluación de la función respiratoria. Sin embargo, requiere grandes cantidades de tejido, consume mucho tiempo y es de bajo rendimiento con posible sesgo de selección para ciertas fracciones de mitocondrias⁴. La permeabilización consiste en la separación mecánica y la exposición de secciones de tejido o haces de fibra a un detergente suave que degrada selectivamente la membrana plasmática⁵. La permeabilización se emplea con frecuencia en tejidos estriados como el músculo esquelético y cardíaco, ya que los haces de fibra individuales se pueden separar. En comparación con el aislamiento, la permeabilización produce más mitocondrias en su entorno celular nativo y forma física⁵. La permeabilización se ha aplicado con éxito en otros tejidos como el tumor^6,7 y la placenta^8; sin embargo, la reproducibilidad de las preparaciones de fibra permeabilizada puede ser difícil debido a la consistencia de la disección y los requisitos de oxígeno para superar las limitaciones de difusión⁹. Además, las fibras permeabilizadas pueden ser inadecuadas en ciertos tipos de tumores que son densamente celulares y altamente fibróticos. Los homogeneizados tisulares se generan a través de la interrupción mecánica de la membrana plasmática y son similares a las fibras permeabilizadas en términos de rendimiento e integridad mitocondrial¹⁰. Los homogeneizados tisulares también minimizan las limitaciones de la difusión de oxígeno y se pueden emplear fácilmente en todos los tipos de tejidos a través de la optimización de la fuerza mecánica^11,12.

Aquí, describimos un método simple y rápido para cuantificar las tasas de fosforilación oxidativa (OXPHOS) y la capacidad de transferencia de electrones (ET) en homogeneizados de tumores sólidos recién extirpados. El protocolo está diseñado de manera óptima para evaluar el tejido fresco utilizando el respirómetro de alta resolución Oxygraph-2k (O2k), que requiere conocimientos previos de configuración y calibración instrumental, pero se puede adaptar de manera similar utilizando cualquier electrodo de tipo Clark, analizador Seahorse o lector de placas. El protocolo puede aplicarse de forma reproducible entre especies y tipos de tumores, así como adaptarse para evaluar una diversidad de vías ET mitocondriales.

Todos los experimentos y procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Investigación Biomédica de Pennington.

1. Preparación de reactivos.

1. Prepare los medios de crecimiento celular EO771 con 10 mM de HEPES, 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina (100 U/mL) y 0,2% de anfotericina B.
2. Preparar 1 L de solución de preservación de biopsia (BIOPS) en un vaso de precipitados de vidrio de 1000 ml.
   1. Añadir 3.180 g de Na₂ATP (concentración final de 5,77 mM).
   2. Añadir 1.334 g de MgCL₂·6H₂O (concentración final de 6.56 mM).
   3. Añadir 2.502 g de taurina (concentración final de 20 mM).
   4. Añadir 3.827 g de Fosfocreatina Na₂(concentración final de 15 mM).
   5. Añadir 1.362 g de Imidazol (concentración final de 20 mM).
   6. Añadir 0,077 g de ditiotreitol (concentración final de 0,5 mM).
   7. Añadir 9,76 g de hidrato MES (concentración final de 50 mM).
   8. Añadir 800 ml de H₂O y mezclar los componentes utilizando un agitador magnético a 30 °C.
   9. Añadir 72,3 mL de 100 mM K₂EGTA (concentración final de 7,23 mM).
      1. Disolver 7.608 g de EGTA y 2.3 g de KOH en 100 mL de H₂O.
      2. Ajuste el pH a 7.0 con 5 M KOH y lleve el volumen hasta 200 mL con H₂O.
   10. Añadir 27,7 mL de 100 mM CaK₂EGTA (concentración final de 2,77 mM).
       1. Disolver 7.608 g de EGTA en 200 mL de H₂O y calentar a 80 °C (concentración final de 100 mM).
       2. Disolver 2.002 g de CaCO₃ en 200 mL de solución de EGTA caliente de 100 mM.
       3. Mientras agita continuamente, agregue 2.3 g de KOH y ajuste el pH a 7.0.
   11. Ajuste el pH a 6,75 a 23 °C (pH 7,1 a 0 °C) con 5 M KOH. Lleve el volumen hasta 980 ml con H₂O y mezcle la solución. Verifique el pH una vez más, ajuste si es necesario y lleve el volumen final hasta 1000 ml con agua.
   12. Alícuota BIOPS en tubos cónicos (15 ml o 50 ml) y guárdela a -20 °C hasta su uso. Solo descongele una vez, justo antes de usarlo.
3. Preparar 1 L de medio de respiración mitocondrial (MiR05) en un vaso de precipitados de vidrio de 1000 ml.
   1. Añadir 0,190 g de EGTA (concentración final de 0,5 mM).
   2. Añadir 0,610 g de MgCL₂·6H₂O (concentración final de 3 mM).
   3. Añadir 2.502 g de taurina (concentración final de 20 mM).
   4. Añadir 1.361 g de KH₂PO₄ (concentración final de 10 mM).
   5. Añadir 4,77 g de HEPES (concentración final de 20 mM).
   6. Añadir 37,65 g de D-sacarosa (concentración final de 110 mM).
   7. Añadir 800 ml de H₂O y mezclar los componentes utilizando un agitador magnético a 30 °C.
   8. Añadir 120 mL de ácido lactobiónico de 0,5 M (concentración final de 60 mM).
      1. Disolver 35,83 g de ácido lactobiónico en 100 mL de H₂O.
      2. Ajuste el pH a 7.0 con 5 M KOH y lleve el volumen hasta 200 mL con H₂O.
   9. Mezclar la solución y ajustar el pH a 7,1 con 5 M KOH.
   10. Pesar 1 g de BSA, esencialmente libre de ácidos grasos (concentración final de 1 g/L), en un tubo cónico de 50 ml. Agregue 40 ml de la solución de pH 7.1 del paso 9 al tubo, invierta suavemente para mezclar y evite la formación de espuma. Transfiera el BSA disuelto a la solución de pH 7.1 restante del paso 9 y revuelva suave y continuamente. Verifique el pH una vez más, ajuste si es necesario y lleve el volumen final hasta 1000 ml con H₂O.
   11. Alícuota el medio MiR05 en tubos cónicos de 50 ml y guárdelo a -20 °C hasta su uso. Solo descongele una vez, justo antes de usarlo.
4. Prepare sustratos, desacopladores e inhibidores.
   1. Preparar 0.8 M de Malato: Disolver 536.4 mg de ácido L-Málico en 4 mL de H₂O. Neutralizar con 5 M KOH a pH 7 y llevar el volumen hasta 5 mL con H₂O. Dividir en alícuotas y luego almacenar a -20 °C.
   2. Preparar 1 M de piruvato: Disolver 550 mg de sal sódica de ácido pirúvico en 4 mL de H₂O. Neutralizar con 5 M KOH a pH 7 y llevar el volumen hasta 5 mL con H₂O. Dividir en alícuotas y luego almacenar a -20 °C.
   3. Preparar 0.5 M ADP (adenosina 5′-difosfato): Disolver 1.068 g de sal sódica ADP en 4 mL de H₂O. Neutralizar con 5 M KOH a pH 7 y llevar el volumen hasta 5 mL con H₂O. Dividir en alícuotas y luego almacenar a -20 °C.
   4. Preparar 2 M de Glutamato: Disolver 3.7426 g de ácido L-glutámico monohidrato en 8 mL de H₂O. Neutralizar con 5 M KOH a pH 7 y llevar el volumen hasta 10 mL con H₂O. Dividir en alícuotas y luego almacenar a -20 °C.
   5. Preparar 4 mM Citocromo c:Disolver 50 mg de Citocromo c en 1 mL de H₂O. Dividir en alícuotas y luego almacenar a -20 °C.
   6. Preparar 1 M de succinato: Disolver 2.701 g de succinato de sal disódica hexahidratado en 8 mL de H₂O. Neutralizar con 1 N HCl a pH 7 y llevar el volumen hasta 10 mL con H₂O. Dividir en alícuotas y luego almacenar a -20 °C.
   7. Preparar 1 mM FCCP (cianuro de carbonilo-4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona): Disolver 2,54 mg de FCCP en 10 mL de etanol puro. Dividir en alícuotas y luego almacenar a -20 °C.
   8. Preparar 150 μM de rotenona: Disolver 3,94 mg de rotenona en 10 ml de etanol puro para preparar 1 mM de caldo, vórtice hasta que se disuelva por completo. Diluir 225 μL de 1 mM de concentración de stock de rotenona con 1,275 ml de etanol puro para producir 1,5 ml de rotenona de 150 μM de rotenona. Proteger de la luz, dividir en alícuotas y luego almacenar a -20 °C.
   9. Preparar 125 μM de Antimicina A: Disolver 11 mg de Antimicina A en 4 mL de etanol puro para preparar 5 mM de concentración de antimicina A. Diluir 25 μL de 5 mM De antimicina A concentración de stock con 975 μL de etanol puro para hacer 1 mL de 0,125 mM de antimicina A. Dividir en alícuotas y luego almacenar a -20 °C.
   10. Preparar 0.8 M de Ascorbato: Disolver 1.584 g de sal de Ascorbato sódico en 8 mL de H₂O. Ajuste el pH con ácido ascórbico a pH 6 y lleve el volumen hasta 10 mL con H₂O. Proteja de la luz, divida en alícuotas y luego guárdelo a -20 ° C.
   11. Preparar 0.2 M TMPD (tetrametil-p-fenilendiamina): Disolver 32.85 mg de TMPD en 987.5 μL de DMSO. Añadir 12,5 μL de ascorbato de 0,8 M (concentración final de ascorbato de 10 mM). Proteger de la luz, dividir en alícuotas y luego almacenar a -20 °C.
   12. Preparar 4 M de azida de sodio: Disolver 2,6 g de azida de sodio en 10 ml de H₂O. Dividir en alícuotas y almacenar a -20 °C.

2. Crecimiento tumoral

1. Cultive células EO771 en medios de crecimiento RPMI 1640 y mantenga las células en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO_2.
2. Ratones hembra C57BL/6J de cuatro semanas de edad, manténgalos a 21-22 ° C en un ciclo de luz: oscuridad de 12 h. Proporcionar a los ratones ad libitum acceso a alimentos y agua.
3. Una vez que los ratones alcancen las 10 semanas de edad, prepare las células y los ratones para la implantación de células cancerosas.
   1. Tripsinizar las células, desactivar la tripsina con medios de crecimiento y centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante y resuspenda y combine los gránulos celulares (según sea necesario) en el medio. Cuente las células viables utilizando azul de tripano y prepare una dilución celular de 1 x^{10 6} células en un volumen total de 60 μL con una solución 1: 1: 1 Media / Matriz de membrana basal / PBS. Una vez que se agrega la matriz de la membrana basal, mezcle bien y mantenga la suspensión celular en hielo. Llene las jeringas con 60 μL de suspensión celular y colóquelas sobre hielo. Trabaje de manera eficiente e inyecte células en ratones dentro de las 1,5 h posteriores a la preparación.
   2. Anestesiar ratones por inhalación de isoflurano (3%-5% para inducción y 1%-3% para mantenimiento). Afeitarse entre las glándulas mamarias inguinales^4ª y^5ª derechas. Inyecte ortotópicamente a los ratones anestesiados con la suspensión celular EO771.
4. Use pinzas electrónicas para monitorear y medir el crecimiento del tumor dos veces por semana durante 4 semanas. En la necropsia, extirpe, pese y luego coloque el tumor (o un mínimo de 60 mg de sección tumoral) inmediatamente en 10 ml de BIOPS helado. Mantenga el tubo sobre hielo húmedo.

3. Configuración y calibración del instrumento

1. Caliente el medio MiR05 en un baño de agua a 37 °C.
2. Encienda el sistema Oroboros O2k, abra el software DATLAB, introduzca o seleccione Usuario. Haga clic en Conectar a O2k. Verifique la configuración de O2k y asegúrese de que el instrumento correcto esté etiquetado para Power-O2k y que cada cámara corresponda al sensor de oxígeno correcto; haga clic en Aceptar. Una vez que se abra la ventana de control O2k, en la pestaña Sistemas, configure la temperatura del bloque a 37 ° C, la velocidad del agitador a 750 rpm para ambas cámaras, ND el intervalo de grabación de datos a 2.0 s. Marque las casillas De potencia e iluminación del agitador en la cámara. En la pestaña Oxígeno, O2, establezca la ganancia para el sensor en 1 V / μA (es posible que sea necesario ajustar la ganancia para modelos de instrumentos más antiguos), el voltaje de polarización a 800 mV y luego haga clic en Conectar a O2k. Una vez que se abra un nuevo archivo de experimento, asigne un nombre al archivo y haga clic en Guardar. Una vez que el experimento esté activo, se abrirá una ventana de selección de protocolo; haga clic en Cancelar para ejecutar un SUIT personalizado (Substrate uncoupler inhibitor titration).
3. Después de la selección del protocolo, se abrirá una ventana de ejemplo para completar el código experimental, el tipo de muestra, la cohorte, el código de muestra, el número de muestra y el número de submuestra, según corresponda. Asigne la unidad a mg e introduzca la concentración de homogeneizado tumoral por ml (la cantidad por cámara se rellenará automáticamente). Asegúrese de que el medio indicado sea MiR05 y el volumen de la cámara sea de 2,00 ml. Agregue comentarios según sea necesario en el cuadro inferior y haga clic en Aceptar.
4. Retire los tapones y aspire el etanol al 70% de las cámaras. Nunca aspire cerca de la membrana que está expuesta en el interior de la cámara. Enjuague cuatro veces con agua pura y llene la cámara con 2,25 ml de MiR05.
5. Prueba del sensor: Haga clic en F9 para apagar los agitadores durante 30 s. Una vez que la barra agitadora vuelva a encenderse, asegúrese de que la pendiente O₂ aumente rápidamente en cada cámara. Si la cámara no pasa la prueba del sensor, verifique las conexiones eléctricas y limpie si se han acumulado sales; repita la prueba. Si el sensor continúa fallando la prueba, retire el conector del sensor polarográfico de oxígeno (POS) para inspeccionar la membrana. Si se observa un daño visible a la membrana, una oxidación intensa o una acumulación significativa de burbujas, detenga los procedimientos experimentales y proceda al mantenimiento del instrumento.
6. Calibración de oxígeno: Realice la calibración de oxígeno para obtener mediciones precisas de la respiración.
   1. Con un movimiento de torsión, inserte los tapones lentamente a su posición calibrada por volumen. Desvíe el exceso de medio expulsado a través del capilar de inyección que se acumula en el pozo del tapón. Con un movimiento de torsión, levante los tapones lo suficiente como para ajustar bien la herramienta tapón-espaciadora dejando un volumen de gas por encima de la fase líquida para el equilibrio final del aire (30-45 min.).
   2. Utilice el estado estacionario alcanzado durante este período para calibrar el sensor de oxígeno para obtener mediciones precisas de la respiración. La pendiente O₂ neg. (pendiente negativa de oxígeno) es de 0 ± 2 pmol/s·mL. Si el valor es superior a 2 pmol/s·mL, limpie la cámara y reponga con MiR05 recién descongelado. Si la pendiente es inestable, proceda al mantenimiento del instrumento.
   3. Después de alcanzar un estado estacionario, seleccione la curva de concentración de O₂ y resalte la región estable de la curva manteniendo presionada la tecla Mayús y haga clic con el botón izquierdo del mouse. Una vez seleccionada la región, haga clic en F5,seleccione la marca para la calibración del aire con la flecha desplegable y haga clic en Calibrar y copiar en el portapapeles.
7. Calibración instrumental de fondo (opcional)
   1. Después de la calibración del aire, asegúrese de que no haya volumen de gas por encima de la fase líquida para el equilibrio de fondo del flujo (~ 15 min) y cierre las cámaras por completo.
      NOTA: La tasa de estado estacionario alcanzada durante este período representa un fondo instrumental y se puede restar de los datos resultantes para mejorar la precisión analítica. La pendiente O₂ disminuirá inicialmente ligeramente y se estabilizará entre ± 2 a 4 pmol/s·mL.
   2. Si el valor es alto (>6 pmol/s·mL), existe una posible contaminación biológica. En este caso, limpie la cámara y reponga con MiR05 recién descongelado. Una vez que se alcanza un estado estacionario, seleccione la curva neg. de pendiente O₂ y resalte la región estable de la curva manteniendo presionada la tecla Mayús y haga clic con el botón izquierdo del mouse.
   3. Después de seleccionar la región, haga clic en F5, seleccione el cuadro Corrección de línea base y la marca de Línea base con la flecha desplegable, y haga clic en Aceptar.

4. Preparación homogeneizada del tumor

1. Coloque un homogeneizador de vidrio que contenga 1 ml de MiR05 y un mortero de vidrio ajustado sobre hielo húmedo.
2. En el momento del estudio, coloque el tejido en 1 ml de BIOPS en una placa de Petri helada.
3. Limpie y diseccione el tejido para maximizar el material soluble, evite las regiones necróticas y elimine el tejido tumoral marginal. Usando un microscopio de disección, bisturí y pinzas quirúrgicas, elimine cualquier vello, tejido necrótico, tejido conectivo y vascular periférico y grasa adyacente, según corresponda. Tenga cuidado de mantener el tumor en BIOPS helado durante la disección.
4. Corte el tumor en trozos pequeños (~ 5-10 mg cada uno) y vuelva a colocar los trozos de tumor restantes en 10 ml de BIOPS mantenidos en hielo. Use este tejido más tarde para preparaciones adicionales si es necesario.
   Nota : realice los pasos siguientes rápidamente para minimizar la cantidad de tiempo que la muestra no está completamente sumergida en BIOPS. Una vez que la muestra se coloca en MiR05, el tiempo es esencial. Mueva con cuidado el homogeneizado preparado a la cámara calibrada lo antes posible.
5. Seque las secciones de pañuelos con cuidado en un papel de filtro, colóquelas en un pequeño bote de pesaje de plástico alquitranado y registre el peso húmedo inicial. Vuelva a colocar las piezas no utilizadas en el tubo cónico de 10 ml de BIOPS para su conservación continua.
6. Sumerja las secciones de tejido en un homogeneizador helado que contenga MiR05 y registre el peso restante en el bote de pesaje, si corresponde.
7. Usando un mortero de vidrio (rango de aclaramiento 0.09-0.16 mm), interrumpa suavemente el tejido tumoral completando 5-7 golpes hacia abajo y hacia arriba. Para cada golpe, gire el mortero en un movimiento en sentido contrario a las agujas del reloj 3 veces mientras empuja el mortero hacia abajo y 3 veces adicionales mientras tira del mortero hacia arriba. Asegúrese de permitir que el tejido se asiente en la parte inferior del homogeneizador entre los golpes, pero evite llevar el mortero completamente por encima del volumen de líquido para evitar la formación de espuma.
   NOTA: El homogeneizado resultante debe aparecer turbio con restos mínimos de tejido sólido.
8. Vierta el homogeneizado en un tubo cónico de 15 ml y colóquelo sobre hielo.
9. Pipete 1-3 mL de MiR05 fresco sobre el mortero y en el homogeneizador para lavar cualquier tejido restante homogeneizado. Vierta el lavado MiR05 en el tubo cónico que contiene el homogeneizado. Repita el lavado de mortero y homogeneizador 2-3 veces para asegurar la transferencia completa del homogeneizado. Tenga en cuenta la concentración objetivo y el volumen requerido para no diluir en exceso la muestra durante los pasos de lavado.
10. Para calcular con precisión la concentración de homogeneizado tisular, inspeccione cuidadosamente el homogeneizador y el homogeneizado en busca de material no homogeneizado restante (es decir, tejido conectivo).
    1. Para eliminar el material no homogeneizado del homogeneizador que no se puede alcanzar con pinzas, agregue MiR05 al homogeneizador, aspire el volumen (incluido el tejido) con una pipeta y mueva el contenido a una placa de Petri.
    2. Para eliminar el material no homogeneizado del homogeneizado (asentado en trozos grandes en la parte inferior del tubo cónico), aspire los trozos grandes con una pipeta y colóquelos en la tapa de tejido del tubo cónico.
    3. Retire el tejido de la placa de Petri o la tapa del tubo cónico con pinzas y bloquéelo en papel de filtro. Agregue el homogeneizado restante de la tapa del tubo cónico de nuevo en el tubo cónico, cúbralo y luego invierta para mezclar.
    4. Vuelva a inspeccionar los homogeneizadores y homogeneice cualquier material adicional no homogeneizado, y repita los pasos 4.10.1-4.10.3 para eliminar el material según sea necesario.
11. Pesar y registrar la masa del material no homogeneizado recuperado del homogeneizador. Inspeccione la preparación homogeneizada en busca de cualquier tejido groseramente intacto transferido. Retire las piezas no homogeneizadas y pese según sea necesario.
12. Reste el peso tisular recuperado del bote de pesaje, homogeneizador y homogeneice (si es necesario) del peso húmedo inicial para calcular el peso final de la muestra.
13. Usando el peso final de la muestra, agregue MiR05 adicional para llevar el homogeneizado a la concentración deseada (consulte el paso 5 para obtener detalles sobre los experimentos de optimización).
14. Una vez pesado y preparado el homogeneizado, proceder al ensayo lo antes posible. Mantenga la muestra almacenada en hielo húmedo hasta que se transfiera al instrumento.

5. Sustrato, desacoplador, protocolo de titulación del inhibidor (SUIT)

1. Una vez calibrado el instrumento, y preparada la muestra, retire los tapones con un movimiento de torsión y aspire el MiR05 de las cámaras (evitando la membrana expuesta dentro de la cámara). Mezclar bien el homogeneizado y añadir 2,25 mL del homogeneizado a la cámara. Si agrega un homogeneizado a múltiples cámaras, pipetee 1 ml a la vez en cada cámara mientras mezcla el homogeneizado para garantizar una distribución equitativa del tejido. Haga clic en F4 para nombrar y marcar la hora del evento y luego haga clic en Aceptar.
2. Llene una jeringa de 50 ml con oxígeno de un tanque de oxígeno con un regulador y un tubo de gas con una aguja roma de 18 G. Hiperoxigeneizar las cámaras a ~500 μM de oxígeno. Para esto, inyecte oxígeno directamente en las cámaras. Inserte libremente los tapones y espere a cerrar hasta que el oxígeno alcance ~ 480 μM. Con un movimiento de torsión, cierre lentamente la cámara y permita que la respiración se equilibre (~ 15-20 min). Llene el tapón capilar central con MiR05 si es necesario.
3. Determinación analítica de la capacidad OXPHOS y ET (estado de transferencia de electrones) de la actividad N-linked y NS-linked y CIV (Complex IV): Utilice microjeringes dedicadas para inyectar sustratos, desacopladores e inhibidores en cámaras completamente cerradas. Haga clic en F4 con cada inyección para nombrar y marcar los eventos de cada cámara en tiempo real. A lo largo del estudio, seleccione F6 para ajustar la concentración de O₂ y las escalas de neg. de pendiente de O₂ según sea necesario. Después de cada inyección, lave las jeringas 3 veces en agua (para compuestos solubles en agua) o etanol al 70% (para compuestos disueltos en etanol o DMSO).
   NOTA: N-linked: Flujo de O₂ soportado por combinaciones definidas de sustrato generador de NADH, NS-linked: Flujo de O₂ soportado por la convergencia de combinaciones definidas de sustrato de NADH-generar y succinato.
   1. Añadir 5 μL de 0,8 M de malato (concentración final de 2 mM) y proceder inmediatamente a la siguiente inyección. Lave la jeringa de inyección 3 veces en agua.
   2. Añadir inmediatamente 5 μL de piruvato de 1 M (concentración final de 2,5 mM) y esperar a que la respiración se estabilice. Lave la jeringa de inyección 3 veces en agua.
   3. Añadir 10 μL de 0,5 M de ADP (concentración final de 2,5 mM) y esperar a que la respuesta de ADP se estabilice. Lave la jeringa de inyección 3 veces en agua.
      NOTA: Es posible que se requiera ADP adicional (2.5-10 mM) para garantizar que las concentraciones de adenilato no se limiten a los flujos respiratorios.
   4. Añadir 5 μL de 2 M de glutamato (concentración final de 5 mM) y esperar a que la respiración se estabilice. Lave la jeringa de inyección 3 veces en agua.
   5. Añadir 5 μL de 4 mM de citocromo c (concentración final de 10 μM) y esperar a que la respiración se estabilice. Lave la jeringa de inyección 3 veces en agua.
   6. Añadir 20 μL de succinato de 1 M (concentración final de 10 mM) y esperar a que la respiración se estabilice. Lave la jeringa de inyección 3 veces en agua.
   7. Valore incrementos de 0.5-1 μL de 1 mM FCCP (concentración final de 2-20 μM) y espere a que la respiración se estabilice después de cada inyección, continúe hasta que no haya un aumento adicional en la respiración. Lave la jeringa de inyección 3 veces en etanol al 70%.
   8. Añadir 2 μL de rotenona de 150 μM (concentración final de 150 nM-2 μM) y esperar a que la respiración se estabilice. Agregue otros 1 μL de rotenona para asegurarse de que no haya más inhibición. Si hay una disminución en la respiración, continúe con inyecciones adicionales hasta que no haya disminución en la respiración. Lave la jeringa de inyección 3 veces en etanol al 70%.
   9. Añadir 2 μL de 125 μM de antimicina A (concentración final de 125 nM-5 μM) y esperar a que la respiración se estabilice. Agregue otros 1 μL de antimicina A para asegurarse de que no haya más inhibición. Si hay una disminución en la respiración, continúe con inyecciones adicionales hasta que no haya disminución en la respiración. Lave la jeringa de inyección 3 veces en etanol al 70%.
   10. Verifique la concentración de oxígeno de la cámara; si la concentración es inferior a 125 μM, reoxigenar al aire ambiente o hiperoxigenar ligeramente para asegurarse de que el oxígeno no limite el flujo respiratorio. Añadir 5 μL de ascorbato de 0,8 M (concentración final de 2 mM). Lave la jeringa de inyección 3 veces en etanol al 70%.
   11. Agregue inmediatamente 10 μL de 0.2 M TMPD (concentración final de 1 mM) espere un aumento en la respiración lenta. Lave la jeringa de inyección 3 veces en etanol al 70%.
   12. Añadir 25 μL de 4 M de azida sódica (concentración final de 50 mM) inmediatamente cuando el flujo respiratorio de Ascorbato/TMPD se estabilice. Lave la jeringa de inyección 3 veces en etanol al 70%.
   13. Finalice el estudio: haga clic en Archivo, Guardar y Desconectar. Continúe lavando la cámara y la jeringa siguiendo los pasos 9.2-9.3.

6. Protocolo de sensibilidad ADP

1. Una vez calibrado el instrumento y preparada la muestra, retire los tapones con un movimiento de torsión y aspire el MiR05 de las cámaras (evitando la membrana expuesta en el interior de la cámara). Mezclar bien el homogeneizado y añadir 2,25 mL del homogeneizado a la cámara. Supongamos que agregamos un homogeneizado a múltiples cámaras, pipetea 1 ml a la vez en cada cámara mientras se mezcla el homogeneizado para garantizar una distribución equitativa del tejido. Haga clic en F4 para nombrar y marcar la hora del evento y haga clic en Aceptar.
2. Inserte los tapones y, con un movimiento de torsión, cierre lentamente la cámara y permita que la respiración se equilibre (~ 15-20 min). Llene el tapón capilar central con MiR05 si es necesario.
3. Determinación analítica de la sensibilidad al ADP mitocondrial ligada al succinato: Haga clic en F4 con cada inyección para nombrar y marcar el tiempo de los eventos para cada cámara en tiempo real. A lo largo del estudio, seleccione F6 para ajustar la concentración de O₂ y las escalas de neg. de pendiente de O₂ según sea necesario.
   1. Añadir 2 μL de rotenona de 150 μM (concentración final de 150 nM).
   2. Agregue inmediatamente 20 μL de succinato de 1 M (concentración final de 10 mM) y espere a que la respiración se estabilice.
   3. Valorar el ADP mediante la adición gradual de concentraciones subsaturantes hasta alcanzar la tasa de respuesta máxima (V_MAX;concentración final de 2,5-10 mM).
      NOTA: La tasa puede estabilizarse después de la inyección debido a un pequeño cambio en la concentración de ADP, por lo tanto, aumentar la concentración de inyección después de cada meseta y continuar con la titulación hasta que no haya un aumento adicional en la respiración, incluso con un aumento de pliegue en la concentración de inyección de ADP.

7. Experimentos de optimización recomendados

1. Determinar la concentración óptima de homogeneizado y oxígeno para el protocolo.
   1. Realice el protocolo SUIT (pasos 5.1-5.3) a múltiples concentraciones tisulares (por ejemplo, 30 mg/ml, 20 mg/ml, 10 mg/ml, 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1 mg/ml y/o 0,5 mg/ml).
   2. Seleccione una concentración que maximice el flujo respiratorio al tiempo que limita la frecuencia de las reoxigenaciones (no más de 1-2). Si se requieren reoxigenaciones más frecuentes, disminuya la concentración del homogeneizado.
2. Determine el número óptimo de trazos con el homogeneizador.
   1. Realice el protocolo SUIT (pasos 5.1-5.3) en múltiples niveles de homogeneización (por ejemplo, 5 golpes, 10 golpes, 15 golpes, 20 accidentes cerebrovasculares).
   2. Dado que no hay datos suficientes en la literatura para determinar un umbral del aumento porcentual del citocromo c con la preparación de homogeneizado tumoral, elija la preparación con una respuesta limitada del citocromo c pero una respiración adecuada energizada por el sustrato (s) de interés.
3. Determinar las concentraciones óptimas de sustrato, ADP, desacoplador e inhibidor requeridas para los flujos respiratorios cuantitativos y reproducibles.
   1. Realizar el protocolo SUIT (pasos 5.1-5.3.9) a la concentración tisular elegida (paso 7.1). Valore cada sustrato, desacoplador, inhibidor y ADP hasta que no se observe ninguna respuesta adicional. Valore la inhibición con azida de sodio en experimentos separados.
      1. Añadir 5 μL de 0,8 M de malato (concentración final de 2 mM) y proceder inmediatamente a la siguiente inyección.
      2. Valore incrementos de 1 μL de piruvato de 1 M y espere a que la respiración se estabilice después de cada inyección, continúe hasta que no haya un aumento adicional en la respiración.
      3. Valore incrementos de 2 μL de 0,5 M ADP y espere a que la respiración se estabilice después de cada inyección, continúe hasta que no haya un aumento adicional en la respiración.
      4. Valore incrementos de 1 μL de 2 M de glutamato y espere a que la respiración se estabilice después de cada inyección, continúe hasta que no haya un aumento adicional en la respiración.
      5. Añadir 5 μL de 4 mM de citocromo c (concentración final de 10 μM) y esperar a que la respiración se estabilice.
      6. Valore incrementos de 5 μL de succinato de 1 M y espere a que la respiración se estabilice después de cada inyección, continúe hasta que no haya un aumento adicional en la respiración.
      7. Valore incrementos de 5 μL de 0,5 M ADP y espere a que la respiración se estabilice después de cada inyección, continúe hasta que no haya un aumento adicional en la respiración.
      8. Valore incrementos de 0.5 μL de 1 mM FCCP y espere a que la respiración se estabilice después de cada inyección, continúe hasta que no haya un aumento adicional en la respiración.
      9. Valore incrementos de 1 μL de 150 μM de rotenona y espere a que la respiración se estabilice después de cada inyección, continúe hasta que no haya disminución del aumento de la respiración.
      10. Valore incrementos de 1 μL de 125 μM de antimicina A y espere a que la respiración se estabilice después de cada inyección, continúe hasta que no haya una disminución adicional en la respiración.
      11. Añadir 5 μL de ascorbato de 0,8 M (concentración final de 2 mM).
      12. Agregue inmediatamente 5 μL de 0.2 M TMPD (concentración final de .5 mM) espere el aumento de la respiración lentamente. En un experimento separado, agregue 10 μL de 0.2 M TMPD (concentración final de 1 mM).
      13. En experimentos separados agregue, 10 μL, 25 μL, 50 μL y 100 μL de 4 M de azida de sodio (20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM concentración final, respectivamente) inmediatamente cuando el flujo respiratorio de Ascorbato / TMPD se estanca.
   2. Elija el sustrato y las concentraciones de inhibidores que se saturan dentro de la primera inyección para mejorar el momento del experimento. Utilice ADP en concentraciones saturantes o subsaturantes para combinar las evaluaciones de sensibilidad de ADP con los protocolos SUIT tradicionales.
   3. Utilice concentraciones submáximas de desacoplador para demostrar la capacidad de respuesta a la dosis sin inhibición del flujo respiratorio.

8. Análisis de datos

1. Análisis SUIT
   1. Seleccione las tasas de estado estacionario o pico de cada titulación y exporte para la reducción analítica.
   2. Expresar los datos como pmol O₂ por segundo por mg de tejido (pmol/s/mg).
   3. Lograr la reducción analítica de PM-L, PM-P, PMG-P, PMGS-P y PMGS-E restando la tasa insensible de antimicina A de la tasa respectiva (es decir, la tasa de estado estacionario obtenida después de la adición de ADP).
      NOTA: PM: Piruvato + Malato; PMG: Piruvato + Malato + Glutamato; PMGS: Piruvato + Malato + Glutamato + Succinato; -L:Estado de fuga; -P: Estado de fosforilación oxidativa, -E: Estado de transferencia de electrones.
   4. Lograr la reducción analítica de CIV-E restando la tasa insensible a la azida de sodio de la tasa máxima de ascorbato/TMPD.
   5. Lograr la reducción analítica de PMG-E restando la tasa insensible a la rotenona de la tasa PMGS-E.
   6. Lograr la reducción analítica de S-E restando la tasa insensible de antimicina A de la tasa insensible a la rotenona.
   7. Lograr la reducción analítica de la eficiencia de control del citocromo c, un marcador de la integridad de la membrana externa, mediante la siguiente ecuación:
      j_c = ((J_CHNOc - J_CHNO)/J_CHNO) x 100
      En la ecuación, j_c es el % de aumento al agregar el citocromo c,J_CHNOc es el flujo de oxígeno después de la adición del citocromo c, y J_CHNO es el flujo de oxígeno antes de la adición del citocromo c.
2. Análisis de sensibilidad ADP
   1. Determinar analíticamente la cinética de la sensibilidad ADP en relación con la tasa de fuga de succinato + rotenona (no la tasa de homogeneizado tisular).
   2. Trazar el flujo de O₂ (eje Y) contra la concentración relativa de ADP (eje X). Determine la velocidad respiratoria máxima (V_máx.)como la velocidad máxima alcanzada durante la titulación de ADP.
   3. Determinar la cinética de Michaelis-Menten utilizando un software de ajuste de curvas (PRISM, versión 10.1) para revelar la concentración de ADP a la que se alcanza 1/2 V_MAX (Aparente K_M).

9. Control de calidad instrumental

1. Realice el fondo instrumental O₂ sobre el rango de concentración de oxígeno deseado (0-600 μM) y calibración cero.
   1. Complete los pasos 3.1 y 3.2
   2. Retire los tapones y aspire el etanol al 70% de las cámaras (evitando la membrana expuesta en el interior de la cámara). Enjuague 4 veces con doble destilado H₂O, y llene la cámara con 2.25 mL de MiR05
   3. Hiperoxigeneizar las cámaras a ~600 μM de oxígeno.
   4. Inserte los tapones lentamente en su posición completamente cerrada. Desvíe el exceso de medio expulsado a través del capilar de inyección y recogido en el pozo del tapón y permita que la señal de oxígeno se estabilice (30-45 min).
   5. Para realizar la calibración de oxígeno, seleccione la región donde tanto la concentración de oxígeno como la pendiente son estables, abra la ventana de calibración de la cámara respectiva y seleccione la marca R1.
   6. Prepare la solución de ditionita disolviendo 20 mg de hidrosulfito de sodio en 0,5 ml de agua. Limite la exposición al aire ya que la ditionita se oxida con el tiempo con la exposición al oxígeno.
   7. Una vez que la señal de oxígeno se estabilice, inyecte 1 μL y observe la disminución de la concentración de oxígeno. Ajuste la potencia de la solución de ditionita según sea necesario.
   8. Inyecte suficiente solución de ditionita para reducir la concentración de oxígeno a 450 μM, 300 μM, 225 μM, 150 μM, 75 μM y 0 μM, respectivamente. En cada inyección, permita que el oxígeno se estabilice y seleccione una marca para la pendiente de estado estacionario. Una vez que la concentración de oxígeno es ~ 0 μM, marque la concentración de oxígeno.
   9. Para realizar la corrección de fondo instrumental O_2, seleccione la ventana de flujo/pendiente para la cámara respectiva, seleccione Calibración de fondo O₂ y haga clic en Calibrar para las marcas de interés.
   10. Para realizar la calibración cero, abra la ventana de calibración de la cámara respectiva y seleccione la marca R0 alcanzada después de la titulación de ditionita.
2. Limpieza de instrumentos
   1. Enjuague rápidamente cada cámara con agua pura tres veces. Para el primer lavado, aspire el homogeneizado, llene la cámara completamente con agua y luego aspire el agua. Para el segundo lavado, llene la cámara 3/4 lleno de agua, inserte los tapones para forzar el agua a través del capilar de inyección, aspire parte del agua a través del capilar de inyección y luego retire los tapones para aspirar el lavado por completo.
   2. Lavar las cámaras con etanol al 70% durante 5 min.
   3. Sobre un fregadero o vaso de precipitados, limpie los tapones con agua pura, etanol al 70% y etanol al 100%, forzando el líquido a través de los capilares de inyección con una botella de lavado.
   4. Enjuague rápidamente cada cámara con agua pura dos veces.
   5. Incubar las cámaras con 2 ml de PBS que contengan ~ 2 mg de mitocondrias congeladas, lisado celular o fibroblastos vivos durante 15 min.
   6. Lave las cámaras con agua pura durante 5 minutos dos veces.
   7. Lave las cámaras con etanol al 70% durante 5 min dos veces.
   8. Lavar las cámaras con etanol al 100% durante 10 min.
   9. Llene las cámaras con etanol al 70%.
      1. Si ejecuta un experimento consecutivo, deje las cámaras en etanol al 70% durante 5 minutos y luego continúe con el paso 3.3.
      2. Si se completan los experimentos, coloque tapas en los tapones y apague el instrumento.
3. Después de cada uso, limpie adecuadamente las jeringas de inyección y mantenga las jeringas dedicadas para el uso de compuestos específicos para evitar el arrastre.
   1. Inserte la jeringa en el líquido de lavado y sumerja completamente la aguja de inyección.
   2. Extraiga el líquido de lavado en la jeringa hasta el volumen máximo.
   3. Retire la jeringa del recipiente de lavado, expulse el líquido de lavado en un vaso de precipitados y luego seque la jeringa en una toalla de papel.
   4. Repita los pasos 9.3.1-9.3.3 tres veces lo antes posible después de cada uso.

Los estudios iniciales revelaron que los tumores EO771 eran de baja oxidación y, por lo tanto, requerían altas concentraciones de homogeneizados para una evaluación adecuada del flujo de O2. Se realizaron experimentos de optimización para determinar el rango óptimo de concentración de homogeneizado tisular para el estudio. Los homogeneizados tumorales se prepararon inicialmente a 40 mg/ml y luego se diluyeron linealmente. El flujo de O2 normalizado a la masa tisular fue consistente a través de las concentraciones (Figuras 1A-D). Se observó que 40 mg/ml resultaron en un rápido agotamiento de oxígeno y no fue adecuado para la experimentación (Figura 1A). El consumo de oxígeno disminuyó sustancialmente con 30 mg/mL y 20 mg/mL, pero aún así disminuyó rápidamente en poco tiempo en ausencia de sustratos o ADP(Figura 1B,C). La concentración de 10 mg/ml dio como resultado la tasa óptima de consumo de oxígeno(Figura 1D)que soportaría un protocolo SUIT más largo de 90 minutos.

Se utilizó un protocolo SUIT para evaluar OXPHOS y ET ligados a NADH y succinato, así como la actividad civ(Figura 2A). El piruvato y el malato se agregaron al homogeneizado tisular en ausencia de ADP para impulsar la fuga (L) a través de NADH. Luego se agregó ADP saturante para impulsar oxphos (P) máximo ligado a NADH, seguido de la adición de glutamato. Luego se agregó citocromo c para garantizar la integridad de la membrana externa; el aumento de la frecuencia respiratoria fue inferior al 20% en todas las muestras (Figura 2B). Dada la muy baja respuesta a los sustratos ligados a NADH, la liberación de citocromo c también se evaluó en presencia de succinato y rotenona y se observó una estimulación mínima del citocromo c (Figura 2B). Curiosamente, oxfos ligado a NADH fue insignificante en tumores EO771(Figura 2C). Luego se agregó succinato en presencia de piruvato, malato y glutamato para estimular el flujo de electrones a través de la succinato deshidrogenasa. FCCP se tituló para impulsar el flujo máximo de electrones (E), lo que reveló que en los tumores EO771, la fosforilación en lugar de la oxidación limitaba la respiración(Figura 2C). La rotenona y la antimicina A se ajustaron posteriormente para inhibir el complejo I y el complejo III, respectivamente. Luego se agregaron ascorbato y TMPD para impulsar el flujo máximo de electrones a través de CIV, que luego es inhibido por la azida de sodio. La Tabla 1 ilustra las ecuaciones analíticas de reducción de los datos brutos (Tabla 2) para cuantificar los parámetros respiratorios trazados en la Figura 2C. En general, los perfiles respiratorios homogeneizados del tumor (Figura 2C) son similares a los de las células EO771 no implantadas con digitonina permeabilizada (Figura 2D) con la excepción de la transferencia máxima de electrones disminuida soportada por sustratos ligados a N y S en el tumor.

Dado que la respiración ligada a NADH era insignificante, la cinética respiratoria del succinato se evaluó aún más mediante titulaciones graduales de ADP subsaturante hasta que se alcanzó la tasa máxima (VMAX)(Figura 3A,3B). La concentración medio máxima (KM)de ADP en presencia de succinato + rotenona fue de 37,5 μM, mientras que la VMAX fue de ~10,5 pmol/s/mg(Figura 3C). Por lo tanto, a pesar de las tasas de oxidación relativamente bajas, los tumores EO771 fueron altamente sensibles a ADP y mantuvieron la síntesis de ATP a concentraciones relativamente bajas de ADP.

La selección de regiones apropiadas de los datos brutos para la extracción es fundamental para la reproducibilidad de los experimentos y la cuantificación precisa. Para el citocromo c,es necesario seleccionar una marca en el estado estacionario inmediatamente antes de la inyección(Figura 4A,marca 1). A menudo hay un artefacto de inyección inicial que puede ser seguido por un período de tiempo (alrededor de 5-10 min) donde el flujo de O2 no es constante. La evaluación de la eficiencia del citocromo c se realiza haciendo una selección adicional una vez que el flujo de O2 se ha estabilizado(Figura 4A,marca 2). Las selecciones después de la adición de sustratos, ADP o la mayoría de los inhibidores también se realizan después del artefacto de inyección y una vez que el flujo de O2 se ha estabilizado(Figura 4B). La selección utilizada para determinar la respiración máxima desacoplada se realiza en el aumento máximo logrado durante la titulación de FCCP, que a menudo no es la última inyección realizada(Figura 4C). La selección para TMPD se realiza después de que se hayan agregado ascorbato y TMPD y en el pico de aumento de la respiración(Figura 4D,marca 1). Justo después de este pico, se agrega el inhibidor, la azida de sodio, que disminuye rápidamente la respiración, pero también a menudo tiene un artefacto de inyección más bajo que la tasa de respiración inhibida(Figura 4D). La marca del inhibidor se realiza inmediatamente después del artefacto de inyección(Figura 4D,marca 2). El flujo de O2 normalmente no se estabilizará y continuará disminuyendo.

Tabla 1: Notación respiratoria y derivación analítica. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Muestra y características respiratorias de los homogeneizados del tumor mamario luminal B. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura 1: Optimización de la concentración de homogeneizados tumorales. O2 Flujo (rojo) y O2 Concentración (azul) en homogeneizados tumorales mamarios preparados a (A) 40 mg/mL, (B) 30 mg/mL, (C) 20 mg/mL, y (D) 10 mg/mL. Thom: Respiración homogeneizada de tejidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Evaluación de la capacidad de OXPHOS y ET mediante respirometría de alta resolución en homogeneizados tumorales recién extirpados. (A) Gráfica representativa del consumo de oxígeno (rojo) y las concentraciones (azul) en el transcurso de un protocolo de sustrato, inhibidor, desacoplador. PM: Piruvato + Malato, D: ADP, G: Glutamato, c: Citocromo c,S: Succinato, F: FCCP, Podredumbre: Rotenona, Ama: Antimicina A, Asc/TMPD: Ascorbato/Tetrametil-p-fenilendiamina. (B) Aumento porcentual en el flujo de O2 tras la adición de citocromo c. (C-D) Respiración soportada por malato, piruvato, glutamato y succinato en presencia de ADP, FCCP y ascorbato/TMPD en (C) homogeneizados tumorales derivados de EO771 y (D) células permeabilizadas con digitonina EO771 no implantadas. Thom: Respiración homogeneizada tisular; PM: Piruvato + Malato; PMG: Piruvato + Malato + Glutamato; PMGS: Piruvato + Malato + Glutamato + Succinato; CIV: Complejo IV; -L: Estado de fuga; -P: Estado de fosforilación oxidativa, -E: Estado de transferencia de electrones; N-vinculado: flujo de O2 soportado por combinaciones definidas de sustrato generador de NADH; Ligado a NS: Flujo de O2 apoyado por la convergencia de combinaciones definidas de sustrato y succinato generado por NADH. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Los tumores mamarios EO771 mostraron una alta sensibilidad a ADP (adenosina 5′-difosfato). (A) Gráfico representativo del consumo de oxígeno (rojo) y las concentraciones (azul) a lo largo de un protocolo de titulación de ADP ligado a S. Thom: Respiración homogeneizada tisular; S/Podredumbre: Succinato/Rotenona; D: ADP. (B) Respiración apoyada por succinato en presencia de rotenona y aumento de las concentraciones de ADP (0 μM ADP = S/Rot-L). (C) Velocidad máxima (VMAX) y concentración semimáxima (KM) de ADP en presencia de succinato + rotenona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Trazado representativo que ilustra la selección de marcas de flujos de O2 en bruto para la extracción de datos. (A) Selección del citocromo c: selección número 1 antes de la inyección del citocromo c y selección número 2 después de la inyección cuando el flujo de O2 se ha estabilizado. c Citocromo c. (B) Selección de sustrato, ADP e inhibidor: selección número 1 después de la inyección (succinato en esta gráfica representativa) donde el flujo de O2 se ha estabilizado. S: Succinato. (C) Selección de desacoplador: selección número 1 en el aumento máximo de la respiración durante la titulación del desacoplador. En esta gráfica de titulación representativa de FCCP, la tercera inyección disminuye ligeramente la respiración y, por lo tanto, no se utiliza para la selección. F: ACCP. (D) Selección de TMPD: selección número 1 en el pico de aumento de la respiración después de las inyecciones de ascorbato y TMPD. Selección de azida de sodio: selección número 2 después del artefacto de inyección aguda cuando la respiración disminuye inicialmente. As/Tm: Ascorbato/TMPD; Azd: Azide. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen conflictos de intereses relacionados con este trabajo.