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Neuroscience

In vivo Métodos para evaluar la función y estructura de las células ganglionares de la retina y el nervio óptico en animales grandes

Published: February 26, 2022 doi: 10.3791/62879
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1The Eye Hospital, School of Ophthalmology & Optometry, Wenzhou Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Aquí demostramos varias pruebas in vivo (flash visual evoked potential, electrorretinograma de patrón y tomografía de coherencia óptica) en macaco cabra y rhesus para comprender la estructura y función del nervio óptico y sus neuronas.

Abstract

El nervio óptico recoge las señales de los axones de las células ganglionares de la retina y transmite la señal visual al cerebro. Los modelos animales grandes de lesión del nervio óptico son esenciales para traducir nuevas estrategias terapéuticas de modelos de roedores a la aplicación clínica debido a sus similitudes más cercanas con los humanos en tamaño y anatomía. Aquí describimos algunos métodos in vivo para evaluar la función y la estructura de las células ganglionares de la retina (RGC) y el nervio óptico (ON) en animales grandes, incluido el potencial evocado visual (VEP), el electrorretinograma de patrón (PERG) y la tomografía de coherencia óptica (OCT). Tanto la cabra como los primates no humanos fueron empleados en este estudio. Al presentar estos métodos in vivo paso a paso, esperamos aumentar la reproducibilidad experimental entre diferentes laboratorios y facilitar el uso de grandes modelos animales de neuropatías ópticas.

Introduction

El nervio óptico (ON), que consiste en axones de las células ganglionares de la retina (RGC), transmite la señal visual de la retina al cerebro. Las enfermedades ON, como el glaucoma, la neuropatía óptica traumática o isquémica, a menudo causaban degeneración irreversible de ON / RGC y pérdida visual devastadora. Aunque actualmente hay muchos avances en la regeneración de ON y la protección de RGC en modelos de roedores1,2,3,4,5,6, los tratamientos clínicos para la mayoría de las enfermedades ON se mantuvieron esencialmente iguales durante el último medio siglo con resultados insatisfactorios7,8 . Para llenar el vacío entre la investigación básica y la práctica clínica, los estudios traslacionales que utilizan modelos animales grandes de enfermedades ON a menudo son necesarios y beneficiosos debido a su similitud anatómica más cercana a los humanos que a los modelos de roedores.

Los macacos de cabra y rhesus son dos grandes especies animales utilizadas en nuestro laboratorio para modelar la enfermedad ON humana. El tamaño del globo ocular de una cabra, ON, y la estructura adyacente (cavidad orbitaria y nasal, base del cráneo, etc.) es similar al de un humano basado en la tomografía computarizada del cráneo9. Como tal, el modelo de cabra brinda la oportunidad de evaluar y refinar dispositivos terapéuticos o procedimientos quirúrgicos antes de su uso en humanos. El macaco rhesus, como primate no humano (NHP), tiene un sistema visual único similar al humano que no existe en otras especies10,11. Además, las respuestas fisiopatológicas a las lesiones y tratamientos en la NHP son muy similares a las de los seres humanos12.

Las pruebas in vivo para evaluar longitudinalmente la estructura y función del ON y el RGC son importantes en estudios con animales grandes. El electrorretinograma de patrón (PERG) se ha utilizado para evaluar la función RGC. El potencial evocado visual flash (FVEP) refleja la integridad de la vía retino-geniculo-cortical en el sistema visual. Así, PERG combinado con FVEP puede reflejar la función ON9,13,14 . La tomografía de coherencia óptica retiniana (OCT) puede mostrar la estructura retiniana con alta resolución temporal y espacial, lo que permite medir el grosor del complejo ganglionar retiniano (CCG)9,15. Para los exámenes electrofisiológicos en este estudio, el monitoreo de los signos vitales (tasa de calor, tasa de ruptura, presión arterial) y el nivel de saturación de oxígeno (SpO2) antes de las pruebas son cruciales ya que estos parámetros tienen un impacto potente en el flujo sanguíneo ocular y, por lo tanto, en la función del sistema visual. Sin embargo, no monitoreamos los signos vitales al realizar imágenes de retina octianas en aras de la simplicidad. Según nuestro estudio anterior9, el grosor del CCG medido por imágenes retinianas octeales es bastante estable, con un coeficiente de variación entre sesiones cercano al 3%. Estas pruebas in vivo en cabra y macaco rhesus han sido descritas en detalle en nuestro estudio anterior9. Aquí presentamos estos métodos para ayudar a aumentar la transparencia experimental y la reproducibilidad.

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Protocol

Los experimentos se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con las directrices de ARRIVE y la guía de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y se adhieren a los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad Médica de Wenzhou (WMU) y joinn Laboratory (Suzhou). Los machos de cabras Saanen, de 4 a 6 meses de edad con un peso de 19-23 kg, fueron alojados en las instalaciones de animales de la UMM. Los macacos Rhesus machos, de edades comprendidas entre los 5 y los 6 años con un peso de 5-7 kg, fueron alojados en el centro de animales de Joinn. Todos los animales fueron mantenidos en una habitación con aire acondicionado y temperatura controlada (21 ± 2 °C) bajo un ciclo de luz de 12 h / 12 h de oscuridad con alimentos ad libitum.

1. Flash visual evoked potential (FVEP) en cabra

  1. Anestesia general
    1. Afeitar el pelo del corvejón con una maquinilla de afeitar electrónica.
    2. Prepare la piel frotando con alcohol al 70% tres veces para limpiar la piel y luego exponga la vena subcutánea.
    3. Inserte un catéter venoso periférico por vía intravenosa (0,9 mm x 25 mm) y luego inyecte atropina (0,025 mg/kg) y propofol (5 mg/kg).
    4. Intubar la cabra con un tubo traqueal de 6 mm y conectarla a un respirador artificial.
    5. Mantener la anestesia con isoflurano al 3,5% en oxígeno a un caudal constante de 2 L/min.
      NOTA: La cabra se recupera de la anestesia inducida por el propofol en cuestión de minutos, así que sea rápido para intubar a la cabra.
  2. Monitorización cardiopulmonar
    1. Coloque el sensor de temperatura debajo de la lengua.
    2. Conecte el oxímetro de pulso al extremo proximal del oído.
    3. Ate el manguito de presión arterial a la base del muslo.
    4. Sujete los clips de ECG en las extremidades en consecuencia.
      NOTA: La frecuencia cardíaca normal de las cabras es de 68-150 lpm. Debido al uso de anestesia gaseosa, la frecuencia cardíaca de las cabras aumentará. Por lo tanto, nuestra frecuencia cardíaca durante la inspección es de 170 ± 30 lpm. La presión arterial sistólica de las cabras en condiciones normales es de 110-130 mmHg, y la presión arterial diastólica es de 50-60 mmHg. En el estado de inhalación de oxígeno, la saturación de oxígeno en la sangre de la cabra siempre se puede mantener en un 99%. La frecuencia respiratoria de las cabras bajo anestesia está sincronizada con la del ventilador, que es de 10 respiraciones / min. Dado que la temperatura se midió desde debajo de la lengua de la cabra, no la temperatura central, la temperatura de la cabra es generalmente de 35 ± 2 ° C.
  3. Implantación de tornillos craneales y colocación de electrodos
    1. Afeitarse el cabello con un cortapelos. Desinfecte la piel en el centro del hueso frontal frotando con una bola de algodón empapada en betadina y alcohol al 70% tres veces.
    2. Use tornillos y tijeras esterilizados.
      NOTA: Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos para esterilización (121 °C, 20 min).
    3. Haga una incisión en la piel de 5 mm para exponer el hueso frontal con una tijera oftálmica, y luego implante un tornillo esterilizado en el centro del hueso frontal con un destornillador.
    4. Afeitar el cabello y desinfectar la piel en el hueso occipital central entre dos orejas con betadina y alcohol al 70%, una seguida de la otra, tres veces.
    5. Haga una incisión en la piel de 5 mm para exponer el hueso occipital con una tijera oftálmica, y luego implante un tornillo esterilizado en el centro del hueso occipital.
      NOTA: El electrodo de la aguja de tierra se inserta por vía subcutánea debajo del tornillo frontal del cráneo. Los electrodos activos y de referencia están conectados a los tornillos occipital y frontal, respectivamente, con clips de cocodrilo para reducir la impedancia del electrodo16.
  4. Preparación animal
    1. Use un paño a prueba de luz para cubrir el ojo y fije por la venda de los ojos para parchear un ojo.
    2. Aplique gotas oftálmicas anestésicas tópicas (gotas oftálmicas de clorhidrato de proparacaína) en ambos ojos. Las pupilas bilaterales se dilatan mediante la administración tópica de gotas oftálmicas midriáticas con tropicamida (5%) y fenilefrina (5%).
    3. Coloque la cabeza de la cabra en el estimulador de Ganzfeld y atenúe la luz ambiental.
      NOTA: Se encontró que las cabras pueden mantener una buena fijación del globo ocular bajo anestesia, por lo que no se requiere una intervención adicional de la operación de fijación del globo ocular.
    4. Cubra el estimulador y la cabeza de cabra con una manta negra durante 5 minutos para la adaptación.
    5. Use el espéculo del párpado para exponer la conjuntiva bulbar. Doble el anillo superior, tire del párpado superior hacia arriba e inserte el anillo superior primero en el saco conjuntival del párpado superior y luego en el párpado inferior de manera similar.
    6. Pulse el botón Impedancia para comprobar la impedancia de contacto electrodo-tejido y se mostrarán los valores de impedancia en cada canal.
    7. Asegúrese de que la impedancia sea inferior a 10 kΩ para cada electrodo para evitar interferencias electromagnéticas de otros dispositivos eléctricos en la misma habitación.
      NOTA: Si está por encima de 10 kΩ, vuelva a conectar o reemplace el electrodo. La impedancia puede parecer anormalmente alta si la cama quirúrgica de metal eléctrico, donde se encuentra la cabra, está tapada. La impedancia debe diferir en menos de 1 kΩ entre los electrodos activos y de referencia para reducir la interferencia eléctrica17.
    8. Pulse el botón Oscilógrafo para comprobar el ruido basal sin estimulación lumínica.
      NOTA: Si hay un gran ruido de referencia, desenchufe todos los demás dispositivos eléctricos en la misma habitación y apague los teléfonos celulares. Si el problema de referencia persiste, vaya al paso 1.3.10. para comprobar si se puede obtener una forma de onda FVEP típica. De lo contrario, reprograme la prueba FVEP en otro momento.
    9. Inicie la grabación FVEP eligiendo la intensidad de luz de 0.025, 0.5 y 3.0 cd·s/m2, respectivamente, en el cuadro de fondo blanco en la esquina superior derecha. Luego, presione el botón Examen . Tenga en cuenta que la grabación FVEP en cada intensidad de luz se realiza dos veces.
      NOTA: Si las dos formas de onda parecen obviamente diferentes, se necesita una repetición más.
    10. Humedezca la córnea con lágrimas artificiales para los ojos, si parece seca en la cámara infrarroja.
      NOTA: Monitoree la posición de los ojos desde la cámara infrarroja incorporada antes de grabar para asegurarse de que la mirada visual sea correcta y que la pupila esté completamente expuesta (de modo que el tamaño del campo de un estímulo de flash sea de 90 °. La posición de los ojos de una cabra anestesiada se puede ajustar girando la cabeza en consecuencia. Según nuestra observación, la mirada errante rara vez ocurre durante el registro FVEP (~10 min) en cabra bajo anestesia general9. Por lo tanto, no hay necesidad de pausar y reajustar la mirada durante la grabación.
    11. Repita los pasos anteriores para el ojo contralateral.
    12. Cese el suministro de isoflurano y aumente ligeramente el volumen corriente en el ventilador para ayudar a la cabra a recuperarse de la anestesia general.
    13. Después de la anestesia general, trate a la cabra con gentamicina (4 mg/kg, IM) y ceftiofur sódico (una cefalosporina, 2 mg/kg, IM) para prevenir la infección.
  5. Medición FVEP y análisis cuantitativo
    NOTA: Como se muestra en la Figura 1A, los primeros picos positivos y negativos en la forma de onda FVEP se designan como P1 y N1, y el segundo pico positivo como P2. El tiempo implícito típico de P1, N1 y P2 es de alrededor de 40, 60 y 120 ms, respectivamente. Las amplitudes P1 y P2 se miden desde el valle de la forma de onda N1 hasta los picos de las formas de onda P1 y P2, respectivamente.
    1. En caso de lesión monocular, utilice la comparación interocular de amplitud y tiempo implícito para ayudar a reducir la variación entre sesiones y aumentar la sensibilidad17.

2. PVEP en macaco rhesus

NOTA: Los VEP de patrón podrían obtenerse en macacos rhesus9 y son más estables que los VEP flash en amplitud y tiempo implícito17. Por lo tanto, se utilizó PVEP para detectar la integridad de la vía retino-geniculo-cortical en primates no humanos.

  1. Preparación animal
    1. Anestesiar al mono con isoflurano (1,5%-2%) después de la inducción con Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamine/zolazepam).
    2. Coloque el electrodo de tierra esterilizado en el lóbulo de la oreja. Inserte los electrodos activos y de referencia esterilizados por vía subcutánea a lo largo de la línea media en el hueso frontal y occipital, respectivamente.
    3. Aplicar espéculo palpebral para exponer la conjuntiva bulbar.
    4. Use cinta negra opaca adhesiva para parchear el ojo contralateral.
  2. Grabación PVEP
    1. Presione el botón de impedancia para verificar la impedancia de contacto electrodo-tejido y los valores de impedancia se mostrarán en cada canal; asegúrese de que esté por debajo de 10k Ω. De lo contrario, vuelva a conectar o reemplace el electrodo.
    2. Compruebe los valores de impedancia en la ventana de prueba de impedancia y asegúrese de que la impedancia difiere en menos de 1 kΩ entre los electrodos activos y de referencia para reducir la interferencia eléctrica17.
    3. Pulse el botón Oscilógrafo para comprobar el ruido basal sin estimulación.
      NOTA: Si hay un gran ruido de referencia, desenchufe todos los demás dispositivos eléctricos en la misma habitación y apague los teléfonos celulares. Si el problema de referencia persiste, vuelva a hacer la prueba de PVEP en otro día.
    4. Registre las respuestas PVEP del ojo sin parchear eligiendo la intensidad de luz de 0.5 y 1.0 ciclo / grado, respectivamente en el cuadro de fondo blanco en la esquina superior derecha, y luego presione el botón Examen .
      NOTA: Para cada grabación, se promedian 64 trazas para producir una forma de onda. Para cada frecuencia, se adquiere un mínimo de dos grabaciones para verificar la reproducibilidad de las señales PVEP.
    5. Repita el procedimiento para el ojo contralateral.
    6. Una vez hecho esto, suspenda el suministro de isoflurano para despertar al mono.
    7. Después de la anestesia general, trate al mono con gentamicina (4 mg/kg IM) y ceftiofur sódico (2 mg/kg IM) para prevenir la infección.
  3. Medición de PVEP y análisis cuantitativo
    1. Como se muestra en la Figura 1B, los primeros picos negativos y positivos en la forma de onda PVEP se designaron como N1 y P1, que generalmente ocurren alrededor de 50 y 90 ms. La amplitud P1 se mide desde la vaguada de N1 hasta el pico de P1.
    2. En caso de lesión monocular, utilice la comparación interocular de amplitud y tiempo implícito para ayudar a reducir la variación entre sesiones y aumentar la sensibilidad17.

3. Patrón ERG (PERG) en cabra

NOTA: En el estudio anterior, no se observó diafonía interocular de la señal PERG en cabras, por lo que las respuestas PERG se pueden registrar simultáneamente desde ambos ojos9.

  1. Preparación de exámenes
    1. Anestesiar a la cabra usando xilazina (3 mg/kg, IM) y colocar en una mesa de examen.
    2. Coloque un sensor de temperatura debajo de la lengua de la cabra.
    3. Conecte el oxímetro de pulso al extremo proximal de la oreja de cabra.
    4. Ate el manguito de presión arterial al muslo.
    5. Sujete los clips de ECG en las extremidades en consecuencia.
    6. Para reducir la impedancia del electrodo, coloque un tornillo de cráneo esterilizado en el hueso frontal y conéctelo al electrodo de tierra con un clip de cocodrilo.
    7. Coloque dos electrodos de referencia de aguja esterilizados por vía subcutánea 1 cm detrás del canthi lateral en ambos lados.
    8. Use el espéculo del párpado para exponer la conjuntiva bulbar.
    9. Coloque dos electrodos de registro ERG-Jet desinfectados en el centro de las córneas bilaterales después de la aplicación tópica de lágrima artificial.
    10. Coloque dos monitores LED de 47,6 cm x 26,8 cm delante de ambos ojos con una distancia de visión de 50 cm.
    11. Ajuste cada monitor para que sea paralelo al plano de la pupila en el mismo lado y alinee el centro del monitor con el plano de la pupila.
    12. Asegúrese de que el tablero de ajedrez de inversión de contraste (frecuencia temporal, 2,4 Hz) se muestre en ambos monitores y tenga una relación de aspecto máxima de 4:3, que se establece mediante la configuración del equipo.
    13. Asegúrese de que el contraste entre las damas blancas y negras se mantenga en un 96%, y la luminancia media sea de 200 cd/m2 (Candela por metro cuadrado), que se comprueba con el medidor de luminancia.
      NOTA: Según ISCEV, se requiere una luminancia fotópica media de 40-60 cd/m2 en humanos17. En otro estudio con modelo de ratones, el patrón se mantuvo en una luminancia media de 800 cd/m2,18. Se necesita un tamaño de campo de al menos 15° en su dimensión más estrecha para una prueba PERG estándar en humanos17. Ajuste la posición del electrodo corneal si no está en el centro de la superficie corneal.
  2. Grabación PERG
    1. Atenúe la luz ambiental y presione el botón de impedancia para verificar la impedancia de contacto electrodo-tejido. Los valores de impedancia se mostrarán en cada canal.
    2. Compruebe los valores de impedancia en la ventana de prueba de impedancia y asegúrese de que la impedancia es inferior a 10 kΩ. De lo contrario, vuelva a conectar o reemplace el electrodo.
    3. Pulse el botón Oscilógrafo para comprobar el ruido basal sin estimulación lumínica.
      NOTA: Preste atención para proteger los frágiles electrodos de grabación ERG-Jet. El ruido de referencia en PERG suele ser menor que el de FVEP en cabra.
    4. Inicie la grabación PERG desde ambos ojos simultáneamente a las frecuencias espaciales de 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 y 12.6 ciclos / grado consecutivamente. Para cada frecuencia espacial, se promedian 64 trazas para producir una lectura.
    5. Finalmente, apague el monitor para grabar PERG sin estímulo visual como control negativo.
      NOTA: Las señales PERG suelen ser estables y no necesitan repetirse.
    6. Retire el tornillo frontal del cráneo y despierte a la cabra inyectando Idzoxan (1,5 mg / kg), que es un antagonista de la xilazina.
    7. Después de la anestesia general, trate a la cabra con gentamicina (4 mg/kg IM) y ceftiofur sódico (2 mg/kg IM) para prevenir la infección.
  3. Medición PERG y análisis cuantitativo
    1. Configure el filtro de paso de banda para que varíe de 1 a 75 Hz. Para 3.0 cpd PERG, el filtro de paso de banda está configurado para ser de 1 a 50 Hz para suavizar la traza sin afectar su amplitud.
    2. Como se muestra en la Figura 1C, los primeros picos positivos y negativos en la forma de onda se designan como P1 (típicamente alrededor de 25 ms) y N1 (típicamente alrededor de 55 ms). La amplitud PERG se mide de N1 a P1.
    3. En caso de lesión monocular, utilizamos la comparación interocular de amplitud y tiempo implícito para ayudar a reducir la variación entre sesiones y reducir la sensibilidad17.

4. PERG en macaco rhesus

NOTA: No está claro si hay diafonía interocular de la señal PERG en el macaco rhesus, por lo que las respuestas PERG de ambos ojos se registran por separado.

  1. Preparación de exámenes
    1. Anestesiar al mono con isoflurano (1,5%-2%) después de la inyección de Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamina/zolazepam) y la intubación traqueal.
    2. Coloque un electrodo de tierra esterilizado por vía subcutánea sobre el hueso frontal. Inserte un electrodo de referencia de aguja esterilizado por vía subcutánea, 1 cm detrás del canto lateral en el mismo lado.
    3. Coloque un electrodo de grabación ERG-Jet desinfectado en la córnea central después de la aplicación tópica de lágrima artificial.
      NOTA: Ajuste la posición del electrodo corneal, si no está en el centro de la superficie corneal.
    4. Use cinta adhesiva negra opaca para parchear un ojo.
    5. Coloque un monitor (47,6 x 26,8 cm) a una distancia de visión de 50 cm.
    6. Asegúrese de que el monitor esté ajustado para que sea paralelo al plano de la pupila. Alinee el centro del monitor con el plano de la pupila.
    7. Asegúrese de que el tablero de ajedrez en blanco y negro se invierta a una frecuencia de 2.4 Hz y que la relación de aspecto sea de 4: 3, que se establece mediante la configuración del equipo.
    8. Asegúrese de que el contraste entre las damas blancas y negras sea del 96%, y que la luminancia promediada siga siendo de 200 cd / m2, que se verifica mediante un medidor de luminancia.
  2. Grabación PERG
    1. Atenúe la luz ambiental y compruebe la impedancia de contacto electrodo-tejido.
    2. Asegúrese de que la impedancia sea inferior a 10 kΩ. De lo contrario, vuelva a conectar o reemplace el electrodo.
    3. Compruebe el ruido de referencia sin estimulación lumínica.
    4. Parchee un ojo e inicie la grabación PERG desde el otro ojo a frecuencias espaciales de 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 y 12.6 ciclos / grado consecutivamente.
    5. Repita los pasos 4.2.1-4.2.4 para el ojo contralateral.
    6. Cesar el suministro de isoflurano para despertar al mono.
    7. Después de la anestesia general, trate al mono con gentamicina (4 mg / kg IM) y ceftiofur sódico (2 mg / kg IM) para prevenir la infección.
  3. Medición PERG y análisis cuantitativo
    1. Como se muestra en la Figura 1D, los primeros picos positivos y negativos en la forma de onda se designan como P1 (típicamente alrededor de 40 ms) y N1 (típicamente alrededor de 85 ms). La amplitud PERG se mide de N1 a P1.
    2. En caso de lesión monocular, utilizamos la comparación interocular de amplitud y tiempo implícito para ayudar a reducir la variación entre sesiones y aumentar la sensibilidad17.

5. PTU en cabra

  1. Preparación animal
    1. Anestesiar a la cabra usando xilazina (3 mg / kg, IM) y luego intubar.
    2. Dilatar la pupila mediante la administración tópica de colirios midriáticos con tropicamida (5%) y fenilefrina (5%).
    3. Use el espéculo del párpado para exponer completamente la pupila.
    4. Coloque la cabeza de la cabra en el reposabarrones.
      NOTA: Aunque no se realiza anestesia con gas, intubar la cabra regularmente para proteger las vías respiratorias de ser comprimidas por el reposamentón.
  2. Imágenes de OCT
    NOTA: Las imágenes de OCT retiniana se realizan utilizando el sistema OCT a una longitud de onda de 870 nm en este estudio. La resolución axial óptica del escáner OCT es de 12 μm. El modo de escaneo circular se utiliza para escanear la cabeza del nervio óptico (ONH) con el modo de alta resolución. Se promedian 100 fotogramas para optimizar la calidad de la imagen. La guía de capacitación detallada está disponible en línea (consulte la Tabla de materiales).
    1. Exploración inicial de la OCT (examen de referencia)
      1. Haga clic en el botón Inicio para ingresar a la interfaz de detección. Espere a que la máquina termine de cargarse y, a continuación, presione el botón amarillo Inicio para iniciar la creación de imágenes.
      2. Alinee la cabra con la cámara infrarroja para centrar el ONH en la imagen de oftalmoscopia láser de barrido confocal (cSLO) modificando la posición de su cabeza.
      3. Ajuste el joystick para iluminar uniformemente toda la imagen infrarroja para mejorar la calidad de la imagen.
      4. Mueva el joystick hacia adelante hasta que se muestre una imagen de OCT retiniana vertical en la pantalla vertical.
      5. Modifique el joystick para que tenga una imagen de OCT retiniana uniformemente densa y colocada horizontalmente.
      6. Presione el botón en el joystick para capturar la imagen automáticamente y mantenga presionado el joystick para mantener la calidad de la imagen en la pantalla de imagen en vivo hasta que se complete la adquisición de la imagen. A continuación, pulse Adquirir.
      7. Despierta a la cabra inyectando Idzoxan (1,5 mg/kg), que es un antagonista de la xilazina.
        NOTA: Centrar el ONH en el examen de referencia ayuda a alinear la exploración de referencia y la exploración de seguimiento de acuerdo con nuestra experiencia.
    2. Análisis de octatoria de seguimiento
      1. Seleccione una imagen de OCT inicial de alta calidad; haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione Establecer referencia.
      2. Inicie la obtención de imágenes de OCT como se mencionó anteriormente.
      3. Pulse el botón Seguimiento para permitir la coincidencia automática del análisis actual con el análisis de referencia.
      4. Una vez emparejado (el anillo de escaneo circular se vuelve verde), presione el botón en el joystick para activar el seguimiento automático en tiempo real.
      5. Despierta a la cabra inyectando Idzoxan (1,5 mg/kg), que es un antagonista de la xilazina.
        NOTA: Para facilitar el proceso de emparejamiento, (1) mueva el ONH en la ventana en vivo girando la cabeza en consecuencia o (2) gire el ONH en la ventana en vivo inclinando la cabeza para que la imagen cSLO actual parezca más similar a la imagen de línea de base. Este reflejo vestibulo-ocular funciona bien bajo anestesia con xilazina19.
  3. Medición de OCT
    1. Haga clic en el botón Medición para entrar en la ventana de medición.
    2. Elija la herramienta de borrador y limpie la línea RNFL, que el programa etiqueta automáticamente.
    3. Elija la herramienta Dibujo de línea para delinear manualmente el límite entre IPL e INL (Figura 2).
      NOTA: El espesor del CCG en seis regiones peripapilares (T, TS, TI, N, NS, NI) y el espesor promedio del CCG alrededor del ONH (G) se pueden leer en la pantalla (Figura 2). La prueba del estudiante, ANOVA unidireccional o ANOVA bidireccional se puede utilizar para cuantificar los datos de OCT en caso de distribución normal.

6. OCT en macaco rhesus

  1. Realizar imágenes de OCT retiniana en macaco rhesus utilizando el mismo equipo y procedimiento que se realiza en el caso de la cabra.

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Representative Results

La Figura 1A muestra resultados representativos de FVEP en cabra. Aunque las formas de onda en la misma intensidad de flash tienen una similitud relativa, todavía recomendamos examinar las formas de onda dos veces. Las ondas electromagnéticas generadas por dispositivos electrónicos interferirán con las señales eléctricas recogidas, lo que resultará en un alto ruido de referencia y una mala repetibilidad de la forma de onda. Por lo tanto, se recomienda asegurarse de que no haya dispositivos electrónicos redundantes conectados al entorno circundante durante el examen electrofisiológico para evitar dicha interferencia, y se recomienda repetir al menos dos mediciones para determinar la estabilidad y repetibilidad de los resultados experimentales. Al parchear ambos ojos, las formas de onda son totalmente planas en ambos ojos, lo que demuestra que las formas de onda ciertamente se están generando a partir de nuestro estímulo flash. La Figura 1B muestra resultados representativos de PERG en cabra. Debido a su estabilidad y alta señal, adquirimos una forma de onda confiable solo por una medición de tiempo en cada frecuencia espacial. A medida que aumenta la frecuencia espacial, el tamaño del tablero de ajedrez excederá gradualmente el reconocimiento de los ojos de la cabra. Así que podemos ver que a 12.7 cpd, la forma de onda pvEP ha caído mucho. Análoga a FVEP, la forma de onda desaparece cuando cerramos la pantalla. La Figura 1C muestra resultados representativos de PVEP en macaco rhesus. Repetimos la medición dos veces en cada frecuencia espacial. A medida que aumenta la frecuencia espacial, la amplitud disminuirá. Esto se debe al hecho de que la frecuencia espacial excede la percepción del ojo. La Figura 1D muestra resultados representativos de PERG en macaco rhesus. La razón por la que la amplitud disminuye con la frecuencia espacial es la misma que se describió anteriormente. Al analizar estos datos, puede optar por analizar la amplitud entre los picos y valles o el tiempo de latencia de los picos o valles como estadísticas.

La Figura 2 muestra los resultados representativos de la PTU en cabra. La imagen más a la izquierda muestra una fotografía de fondo de ojo tomada por una cámara infrarroja. Apretadamente a la derecha hay un tomograma de la retina, que muestra el grosor general de la retina alrededor de la ONH y el grosor de cada capa. Como se muestra en la imagen, podemos ver claramente que las cabras tienen vasos sanguíneos retinianos más grandes que los monos. Los discos verdes en el extremo derecho es un análisis cuantitativo del grosor del CCG alrededor del ONH. G significa general, T significa lado temporal, N significa lado nasal, S significa superior e I significa inferior. La fuente negra representa el valor de medición de espesor GCC en micrómetros, y el verde es el valor de medición de referencia clínica para humanos, no como referencia para este experimento.

Figure 1
Figura 1: Formas de onda electrofisiológicas representativas en macacos caprinos y rhesus. (A) Formas de onda FVEP representativas a diferentes intensidades de luz de una cabra individual dentro de la misma sesión anestésica. (B,D) Formas de onda PERG representativas a diferentes frecuencias espaciales de una cabra individual (B) o un macaco rhesus (D) dentro de la misma sesión anestésica. (C) Formas de onda REPRESENTATIVAS de PVEP a diferentes frecuencias espaciales de un macaco rhesus individual dentro de la misma sesión anestésica. El tiempo implícito típico de cada forma de onda se menciona en la sección Protocolo. n = 1 sujeto para cada prueba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultados de la OCT. Imágenes representativas de la OCT retiniana alrededor de la cabeza del nervio óptico (panel izquierdo) y el grosor del CCG en diferentes regiones peripapilares (panel derecho) en cabra (A) y macaco rhesus (B). n = 1 sujeto para cada prueba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este estudio, presentamos un protocolo de VEP, PERG y OCT en cabra y macaco rhesus. Estos métodos in vivo se pueden aplicar en modelos animales grandes de diversas neuropatías ópticas, como glaucoma, neuropatía óptica isquémica o traumática y neuritis óptica9.

PvEP es más estable y sensible que FVEP17; sin embargo, no se puede obtener en la cabra9. Como tal, FVEP se realiza en cabra y PVEP se realiza en macaco rhesus en nuestro laboratorio para evaluar la integridad de la vía retino-geniculo-cortical. El mecanismo subyacente a la observación de que el PERG, pero no el PVEP, puede ser inducido en la cabra aún no está claro según nuestro conocimiento. Es posible que la función y la estructura del nervio óptico de la cabra sean diferentes de las humanas.

Dado que la amplitud de FVEP puede verse afectada por el tamaño pupilar y la luz ambiental, dilatamos la pupila y colocamos una manta negra sobre la cabeza de la cabra durante la grabación de FVEP. Cabe destacar que la dilatación de la pupila no es necesaria para la FVEP en las clínicas17. Del mismo modo, aunque la adaptación a la oscuridad no es necesaria para el registro de FVEP en clínicas, encontramos que una adaptación de 5 minutos a la luz ambiental antes del registro de FVEP puede aumentar la repetibilidad intrasesión en amplitud.

Se cree que la señal PERG se originó a partir de los RGC y, por lo tanto, su amplitud podría usarse para estimar la función de los RGC13,20. En comparación con algunos componentes especiales del flash ERG, como la respuesta de umbral escotópico (STR) y la respuesta negativa fotópica (PhNR), PERG es más sensible a la disfunción de RGC13. Las limitaciones potenciales de la prueba PERG en este estudio son las siguientes. En primer lugar, ISCEV recomienda utilizar el estimulador clásico CRT (tubo de rayos catódicos) para el registro perg para mantener constante la luminancia media. Sin embargo, el estimulador CRT clásico está menos disponible que la pantalla de cristal líquido (LCD). Aunque la pantalla lcd suele presentar cambios transitorios de luminancia durante la inversión del patrón, lo que podría causar un artefacto de luminancia17, no contribuyó a la amplitud de PERG en cabra según nuestro hallazgo anterior: la amplitud de PERG a la frecuencia espacial de 12,6 cpd suele ser descuidada en comparación con aquellos a frecuencias espaciales más bajas9 . Otra limitación es que no corregimos el error de refracción antes de la prueba PERG en aras de la simplicidad. Para compensar esta limitación, la amplitud PERG basal debe registrarse como referencia.

Nuestro estudio anterior había evaluado y optimizado la variación intra e intersesión de VEP y PERG9. Encontramos que en comparación con la xilazina, el isoflurano dio lugar a FVEP más repetible pero formas de onda PERG más variables en cabras9. Por lo tanto, utilizamos isoflurano en la prueba FVEP y xilazina en perg y prueba OCT en cabras. Además, en comparación con PERG, la grabación VEP es potencialmente más variable. Como tal, repetimos regularmente la grabación VEP en cada intensidad de luz o frecuencia espacial para verificar la variación intrasesión. Por el contrario, las formas de onda PERG son mucho más estables. Por lo tanto, generalmente no repetimos la grabación PERG. Aunque generalmente se recomienda la grabación repetida en un día diferente sobre el mismo tema, no repetimos regularmente la grabación VEP o PERG sobre el mismo tema en un día diferente en aras de la simplicidad y la ética animal. Sin embargo, las grabaciones FVEP y PERG sin repetición entre sesiones son lo suficientemente sensibles como para detectar una lesión del nervio óptico según nuestro estudio anterior9.

La imagen de oct retiniana es una técnica conveniente, confiable y no invasiva para monitorear y cuantificar longitudinalmente los cambios dinámicos en la estructura de la retina. En comparación con PERG y VEP, las imágenes de OCT tienen una repetibilidad entre sesiones mucho mejor9. Además, las imágenes de OCT pueden capturar y cuantificar toda la fibra del nervio óptico en cuestión de minutos sin error de muestreo, ofreciendo una oportunidad mucho más barata y efectiva para examinar la estructura de la retina que el análisis histológico tradicional. Sin embargo, la resolución espacial de las imágenes actuales de octebra todavía es demasiado limitada para indicar soma RGC individual o fibra del nervio óptico. Además, se debe tener en cuenta que un CCG más grueso medido por oct no significa necesariamente una retina interna más intacta porque el engrosamiento del CCG puede ser causado por edema o hemorragia de retina.

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Disclosures

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue financiado por las siguientes subvenciones: Programa Nacional Clave de I + D de China (2021YFA1101200); Proyecto de Investigación Médica de Wenzhou (Y20170188), Programa Nacional Clave de I + D de China (2016YFC1101200); Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81770926;81800842); Programa clave de I + D de la provincia de Zhejiang (2018C03G2090634); y programa clave de I + D del Hospital de Ojos de Wenzhou (YNZD1201902). El patrocinador u organización financiadora no tuvo ningún papel en el diseño o la realización de esta investigación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
47.6 x 26.8 cm monitors DELL Inc. E2216HV The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens
6.0 mm tracheal tube Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd PVC 6.0 ensure the airway
alligator clip
atropine Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd. reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation
Carbomer Eye Gel Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb moisten the cornea and stabilize the recording electrodes
ERG-Jet recording electrodes Roland Consult Stasche&Finger GmbH 2300 La Chaux-De-Fonds ERG recording
eye speculum Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd ZYD020 open palpebral fissure
Heidelberg Spectralis OCT system Heidelberg Engineering OCT system
Imaging (https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
isoflurane RWD Life Science Co., Ltd R510-22 isoflurane anesthesia
male Saanen goats Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China) The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg
needle electrode Roland Consult Stasche&Finger GmbH U51-426-G-D use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes
periphery venous catheter intravenously BD shanghai Medical Device Co., Ltd 383019 intravenous access for atropine and propofol
propofol Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd. induce Isoflurane anesthesia in goat
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops SANTEN OY, Japan 5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride
visual electrophysiology device Gotec Co., Ltd GT-2008V-III use for FVEP & PERG
xylazine Huamu Animal Health Products Co., Ltd. xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg
zoletil50 Virbac induce Isoflurane anesthesia in monkey

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References

  1. Benowitz, L., Yin, Y. Rewiring the injured CNS: lessons from the optic nerve. Experimental Neurology. 209 (2), 389-398 (2008).
  2. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
  3. Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
  4. Bei, F., et al. Restoration of visual function by enhancing conduction in regenerated axons. Cell. 164 (1-2), 219-232 (2016).
  5. He, Z., Jin, Y. Intrinsic control of axon regeneration. Neuron. 90 (3), 437-451 (2016).
  6. Yang, S. -G., et al. Strategies to promote long-distance optic nerve regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 119 (2020).
  7. Foroozan, R. New treatments for nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Neurologic Clinics. 35 (1), 1-15 (2017).
  8. Singman, E. L., et al. Indirect traumatic optic neuropathy. Military Medical Research. 3, 2 (2016).
  9. Zhang, Y., et al. In vivo evaluation of retinal ganglion cells and optic nerve's integrity in large animals by multi-modality analysis. Experimental Eye Research. 197, 108117 (2020).
  10. Tolbert, W. D., et al. From Rhesus macaque to human: structural evolutionary pathways for immunoglobulin G subclasses. mAbs. 11 (4), 709-724 (2019).
  11. Preuss, T., et al. Specializations of the human visual system: the monkey model meets human reality. , CRC Press. Boca Raton, FL. 231-259 (2004).
  12. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
  13. Porciatti, V. Electrophysiological assessment of retinal ganglion cell function. Experimental Eye Research. 141, 164-170 (2015).
  14. Smith, C. A., Vianna, J. R., Chauhan, B. C. Assessing retinal ganglion cell damage. Eye. 31 (2), 209-217 (2017).
  15. Schuman, J. S., et al. Optical coherence tomography and histologic measurements of nerve fiber layer thickness in normal and glaucomatous monkey eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (8), 3645-3654 (2007).
  16. You, Y., et al. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Documenta Ophthalmologica. 123 (2), 109-119 (2011).
  17. Odom, J. V., et al. ISCEV standard for clinical visual evoked potentials: (2016 update). Documenta Ophthalmologica. 133 (1), 1-9 (2016).
  18. Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. eLife. 8, 45881 (2019).
  19. Seidman, S. H., Telford, L., Paige, G. D. Vertical, horizontal, and torsional eye movement responses to head roll in the squirrel monkey. Experimental Brain Research. 104 (2), 218-226 (1995).
  20. Porciatti, V. The mouse pattern electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 145-153 (2007).

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Neurociencia Número 180
<em>In vivo</em> Métodos para evaluar la función y estructura de las células ganglionares de la retina y el nervio óptico en animales grandes
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Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S.,… More

Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S., Sun, J., Li, M., Xia, Y., Zhang, S., Wu, W., Zhang, Y. In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals. J. Vis. Exp. (180), e62879, doi:10.3791/62879 (2022).

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