Artículo de método
El presente protocolo describe un método para detectar especies reactivas de oxígeno (ROS) en los organoides murinos intestinales utilizando imágenes cualitativas y ensayos de citometría cuantitativa. Este trabajo se puede extender potencialmente a otras sondas fluorescentes para probar el efecto de compuestos seleccionados en ROS.
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel esencial en la homeostasis intestinal. Las ROS son subproductos naturales del metabolismo celular. Se producen en respuesta a una infección o lesión a nivel de la mucosa, ya que están involucrados en las respuestas antimicrobianas y la cicatrización de heridas. También son mensajeros secundarios críticos, que regulan varias vías, incluido el crecimiento y la diferenciación celular. Por otro lado, los niveles excesivos de ROS conducen al estrés oxidativo, que puede ser perjudicial para las células y favorecer enfermedades intestinales como la inflamación crónica o el cáncer. Este trabajo proporciona un método sencillo para detectar ROS en los organoides murinos intestinales mediante imágenes en vivo y citometría de flujo, utilizando una sonda fluorogénica disponible comercialmente. Aquí el protocolo describe el ensayo del efecto de los compuestos que modulan el equilibrio redox en organoides intestinales y detectan los niveles de ROS en tipos específicos de células intestinales, ejemplificado aquí por el análisis de las células madre intestinales genéticamente marcadas con GFP. Este protocolo se puede utilizar con otras sondas fluorescentes.
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son subproductos naturales del metabolismo celular. También pueden ser producidos activamente por complejos enzimáticos especializados como las NADPH-Oxidasas (NOX) y las Oxidasas Duales (DUOX) unidas a la membrana, que generan anión superóxido y peróxido de hidrógeno1. Al expresar enzimas antioxidantes y eliminadores de ROS, las células pueden ajustar finamente su equilibrio redox, protegiendo así la homeostasis tisular2. Aunque las ROS pueden ser altamente tóxicas para las células y dañar el ADN, las proteínas y los lípidos, son moléculas de señalización crucial....
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Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo después de la aprobación del Comité de Uso del Instituto Pasteur y del Ministerio de Agricultura francés n.º 2016-0022. Todos los pasos se realizan dentro de una campana de cultivo de tejidos.
1. Preparación de reactivos y materiales para el cultivo de organoides intestinales
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Como prueba de concepto del protocolo descrito, se utilizaron las criptas obtenidas de la línea de ratones Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 en la que las células madre intestinales muestran expresión GFP en mosaico, que fue establecida por Barker et al., para caracterizar inicialmente las células madre intestinales10 y permitir mapear estas células en función de su expresión GFP. De este modo, se proporciona un modelo para comparar los niveles de ROS en una población de tipo celular específico en diferentes.......
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Este trabajo proporciona un protocolo paso a paso para aislar criptas yeyunales murinas, cultivarlas en organoides 3D y analizar ROS en organoides mediante la combinación de una sonda fluorogénica sensible a ROS con imágenes de microscopía cualitativa de organoides completos y medición cuantitativa de ROS utilizando citometría de flujo en células individuales después de la disociación organoide.
El primer paso crítico en este método es el procedimiento de extracción de criptas. De hecho, la ca.......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Este trabajo fue apoyado por la agencia nacional de investigación francesa (ANR) subvención 17-CE14-0022 (i-Stress).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, sin vitamina A | ThermoFisher | 12587010 | Concentración de existencias: 50x |
| GlutaMAX (glutamina) | ThermoFisher | 35050038 | existencias: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | concentración de existencias: 1 m |
| Murine EGF | R& D | 2028-EG-200 Concentración de | existencias: 500 y micro; g/mL en PBS |
| murine Noggin | R& D | 1967-NG/CF Concentración de | existencias: 100 y micro; g/mL en PBS |
| Murine R-spondin1 | R& D | 3474-RS-050 Concentración de | existencias: 50 y micro; g/mL en PBS |
| N-2 Suplemento | ThermoFisher | 17502048 | Concentración de Stock: 100x |
| Penicilina-Estreptomicina (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Concentración de Stock: 100x (10,000 unidades/mL de penicilina y 10,000 µ g/mL de estreptomicina) |
| Material | |||
| 70 y micro; m colador de células | Corning | 352350 | |
| Fondo redondo de 96 pocillos | Corning | 3799 | |
| tijera de punta esférica | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Reactivo | rojo intenso ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phé nylindol, diclorhidrato) (sonda fluorgénica) | ThermoFisher | D1306 | stock a 10 mg/mL |
| DPBS 1x sin calcio ni magnesio (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM sin rojo fenol) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock a 10 mg/mL |
| Matrigel Factor de Crecimiento Reducido, Libre de Rojo de Fenol (Matriz de Membrana Basal ) | Corning | 356231 | una vez recibido descongelar o/n en la nevera, mantener durante 1h en hielo y, hacer 500 mL alícuotas y almacenar a -20 ° C |
| µ-Slide 8 Cámaras de pocillos | Ibidi | 80826 | |
| N-acetilcisteína (NAC) | Sigma | A9165 | |
| terc-butil hidroperóxido (tBCHP)solución (70% wt. En H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), sin rojo de fenol (tripsina) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Inhibidor de rocas para minimizar la muerte celular por disociación de tejidos |
| fuertes | |||
| citómetros de flujo | |||
| Sistema confocal | Bruker | ||
| de alta velocidad EMCCD Camera Evolve Delta 512 | confocal | fotométrico | |
| Prisma | GraphPad Software | análisis estadístico |
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