Summary
本プロトコールは、定性的イメージングおよび定量的サイトメトリーアッセイを用いて腸マウスオルガノイド中の活性酸素種(ROS)を検出する方法を記載する。この研究は、選択された化合物がROSに及ぼす影響を試験するために、他の蛍光プローブに拡張される可能性があります。
Abstract
活性酸素種(ROS)は、腸の恒常性維持に不可欠な役割を果たす。ROSは細胞代謝の天然の副産物である。それらは、抗菌応答および創傷治癒に関与するので、粘膜レベルでの感染または傷害に応答して産生される。それらはまた、重要な二次メッセンジャーであり、細胞の成長および分化を含むいくつかの経路を調節する。一方、過剰なROSレベルは酸化ストレスをもたらし、これは細胞にとって有害であり、慢性炎症または癌のような腸疾患に有利であり得る。この研究は、市販の蛍光発生プローブを用いたライブイメージングおよびフローサイトメトリーによって腸内マウスオルガノイド中のROSを検出する簡単な方法を提供する。ここでのプロトコールは、GFPで遺伝的に標識された腸幹細胞の分析によってここに例示される、腸オルガノイドにおける酸化還元バランスを調節し、特定の腸細胞型におけるROSレベルを検出する化合物の効果をアッセイすることを記載する。このプロトコルは、他の蛍光プローブと共に使用され得る。
Introduction
活性酸素種(ROS)は、細胞代謝の天然の副産物である。また、膜結合型NADPH-オキシダーゼ(NOX)やデュアルオキシダーゼ(DUOX)などの特殊な酵素複合体によっても積極的に生成でき、スーパーオキシドアニオンと過酸化水素を生成します1。抗酸化酵素とROSスカベンジャーを発現させることにより、細胞は酸化還元バランスを微調整し、組織の恒常性を保護することができます2。ROSは細胞に対して非常に毒性が高く、DNA、タンパク質、脂質に損傷を与える可能性がありますが、それらは重要なシグナル伝達分子です2。腸上皮では、幹および前駆細胞の増殖に中等度のROSレベルが必要です3。高いROSレベルは、アポトーシスにつながります4。慢性酸化ストレスは、炎症性腸疾患や癌などの多くの胃腸疾患に関連しています。一例として、Wnt駆動型腸癌のマウスモデルにおいて、NADPHオキシダーゼの活性化によるROS産生の上昇が癌細胞の過剰増殖に必要であることが判明した5,6。腸細胞、特に幹細胞、幹細胞が酸化ストレスをどのように管理し、細胞環境がこの能力にどのように影響するかを定義することは、この病気の病因をよりよく理解するために不可欠です7。
組織において、異なる細胞型は、その機能および代謝、ならびに様々なレベルの酸化分子および抗酸化分子の発現に応じて変化し得る基礎酸化状態を提示する4,7。インビボでのROSモニタリングは非常に困難です。酸化還元状態に応じて蛍光を発する細胞透過性色素は、生細胞や動物における細胞ROSを可視化・測定するために開発されている。しかし、その有効性は、生体組織内での拡散と迅速な読み出しに依存しているため、動物モデルでの使用が困難です8。
過去には、ROS生成に対する化合物の効果の研究は細胞株を用いて行われていたが、これはin vivoの状況を反映していない可能性がある。Clevers9のグループによって開発された腸オルガノイドモデルは、腸の初代細胞のエクスビボでの増殖を可能にする。定義された成長因子の存在下でのマトリックス中の腸陰窩の培養は、オルガノイド(ミニ腸)と呼ばれる三次元構造をもたらし、異なる上皮系統からの細胞が内部管腔を裏打ちし、腸幹細胞が小さな陰窩様突起に存在する陰窩絨毛組織を再現する。
ここでは、このモデルを利用して、市販のROS感受性色素をオルガノイド培地に添加することにより、初代腸管細胞の酸化ストレスを単一細胞分解能で調べる簡便な方法について説明する。
プレートリーダーは、全集団におけるROS産生を検出するためによく使用されます。このプロトコルは、フローサイトメトリーまたはイメージングアッセイを使用して、遺伝子改変細胞または特定の抗体染色を用いて特定の細胞型におけるROSを検出する。この研究は、マウス腸管オルガノイド培養と共焦点イメージングによるROS可視化、フローサイトメトリーによる定量化を含む。Lgr5-GFPマウス由来小腸オルガノイドを用いて、異なる治療を受けた際の腸管幹細胞における酸化ストレスのレベルを特異的に解析することができる。このプロトコルは、選択した化合物でオルガノイドを刺激した後、微生物叢由来のムラミルジペプチド(MDP)10などの外因性分子がROSバランスに及ぼす影響をテストするために適合させることができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物実験は、パスツール使用委員会およびフランス農業省第2016-0022号の承認後に実施された。すべてのステップは、組織培養フード内で実行される。
1. 腸管オルガノイドを培養するための試薬及び材料の調製
- 増殖培養培地を調製するには、1xグルタミン、1xペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)溶液、10mMのHEPES、50ng/mLのマウスEGF、20μg/mLのマウスノギン500ng/mLのマウスR-Spondin1を添加した高度なDMEM/F-12を混合する( 材料表を参照)。陰窩の抽出中に培地を室温(RT)に放置する。
注: 未使用の培地をアリコートで -20 °C で凍結します。 凍結融解を避けてください。 - 50 mL チューブに 40 mL のアドバンスト DMEM/F-12 を充填し、氷の上に保管します。
メモ:未使用の培地は4°Cに保ちます。 オルガノイドの継代に使用されます。 - 細胞培養プレート(μ-Slide 8ウェルチャンバーおよび/または96ウェル丸底)をインキュベーター内で37°Cで予備温める。
- 基底膜マトリックス(BMM)( 材料表を参照)のアリコートを氷上で解凍する(プロトコルを開始する前、または陰窩をメッキする少なくとも1時間前)。
メモ:BMMは、冷たく保たないとすぐに固まります。 - 1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液をDPBS(DPBS-P/S)に加える洗浄/フラッシング溶液を調製する。
- 100 mm のペトリ皿に 10 mL の冷たい DPBS-P/S を充填します。6 本の 15 mL チューブに 10 mL の DPBS を充填し、F1 から F6 までのラベルを付けます。
- DPBS中の0.5 M EDTAから希釈することによって30 mLの10 mM EDTA溶液を調製する。2 本の 15 mL チューブに 10 mL の 10 mM EDTA を充填し、E1 と E2 とラベルを付けます。
- すべての溶液を4°Cで予冷し、手順中は氷の上に保管してください。
腸管オルガノイド培養
- 生後8~10週齢のLgr5-EGFP-IRES-creERT2(Lgr5-GFP)マウスを国の規則および規制に従って屠殺する。
- 十二指腸(胃から5cm)と回腸(盲腸から10cm)の間の領域を含む空腸を5〜8cm集め、氷の上の冷たいDPBS-P/Sに保管してください。
- 5〜10mLの冷たいDPBS-P/Sで洗い流して腸の内容物をきれいにしてください。
注:自家製のフラッシングシリンジは、200 μLのチップを10 mLシリンジノズルに差し込むことで入手できます。 - ボールチップハサミ( 材料表を参照)を使用して腸を縦方向に開きます(組織の損傷を防ぐため)。
- 鉗子を使用して、室温で冷たいDPBS-P/Sを入れたシャーレに組織を移し、振ってすすぎます。
- プラスチック製のパスツールピペットで、吸引によって腸をつかみ、10mLの冷たい10mM EDTAを含むE1 とラベル付けされた15mLチューブに移します。
- チューブを3回反転させ、氷上で10分間インキュベートする。
- プラスチック製パスツールピペットを用いて、10mLのDPBSを含むチューブ F1 に組織を移す。2分間の渦(通常の渦では、手でチューブを持ち、腸がうまく渦巻くようにします)。
- 10 μLの画分をシャーレに入れ、顕微鏡下で画分の品質を評価した。
注:すべての渦ステップは最高速度で実行され、各フラクションの品質は顕微鏡下で評価する必要があります(図1)。 - プラスチック製のパスツールピペットで、吸引によって腸をつかみ、10mLのDPBSと渦を含むチューブ F2 に2分間移します。
- ステップ2.10を繰り返し、10mLのDPBSおよび渦を含むチューブ F3 に組織を2分間移す。
- ステップ2.6と同様にEDTAインキュベーションを繰り返し、10mM EDTAを含むチューブE2 に組織を移す。
- チューブを3回反転させ、氷上で5分間インキュベートする。
- ステップ2.10を繰り返し、10mLのDPBSおよび渦を含むチューブ F4 に組織を3分間移す。
- ステップ2.14を繰り返し、10mLのDPBSおよび渦を含むチューブ F5 に組織を3分間移す。
- ステップ2.15を繰り返し、10mLのDPBSおよび渦を含むチューブ F6 に組織を3分間移す。
- 70 μm のセルストレーナーを通して重力でろ過する最良の画分を 50 mL チューブ (氷上) に結合して、絨毛や重大な破片を除去します。
注:通常、F5とF6は、多数の地下室とより少ない破片を含む画分です。 - 陰窩を4°Cで150 x g で3分間回転させます。
- チューブを空にし、ペレットを機械的に破砕し、5mLの冷たいDMEM/F12を加える。
- 10μLの懸濁液をシャーレに入れ、顕微鏡下でアリコート内に存在する陰窩の数を手動でカウントする。
メモ: 単一細胞や小さな破片はカウントしないでください。 - 1ウェルあたり300個の陰窩が播種されていること、Wはウェルの数、Nは懸濁液の10μLのうち数えられた陰窩の数を考慮すると、μLで必要な陰窩懸濁液の体積(V)を計算します。陰窩を新しい15mLチューブに移す。
メモ: V = 300 x 幅 x 10/N計画された実験で少量を使用する場合は、1.5mL遠沈管を使用することができる。 - 陰窩を4°Cで200 x g で3分間回転させます。
- ピペットを使用して上清を慎重に取り除きます。
- ペレットを機械的に破砕し、成長培地を穏やかに添加して、90クリプト/μLの濃度を得る。
- 希釈されていないBMMを2倍量加えて、最終濃度が30クリプト/μLになるようにします。ミックスに気泡を導入せずに慎重に上下にピペットを沸かします。
注:BMMの固化を避けるために、チューブを氷の上に保管してください。 - プレート10 μLの陰窩/ BMMを各ウェルに混合する。フローサイトメトリー分析には、丸底の96ウェルプレートを使用してください。ドームとして各ウェルの中央に10 μLを分配する。イメージングには、μスライド8ウェル( 材料表を参照)を使用し、10μLを薄層として堆積させます。
注:オルガノイドをイメージングアッセイ用の薄い層としてプレートし、詳細なイメージングを可能にします。 - プレートをRTで5分間放置して、BMMが固化できるようにします。プレートを37°Cおよび5%CO2 で15分間インキュベーターに入れます。
- 各ウェルに250 μLの成長培地を加え、BMMが剥離しないように注意する。
- プレートを37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに入れます。
- 培養の4日目から6日目の間にROS分析を行う。さもなければ、培地を交換し、いくつかの長い出芽構造が出現した後、および死んだ細胞がオルガノイド内腔に蓄積したときにオルガノイドを分割する。
3. オルガノイド継代
- 培養6日目 から小腸オルガノイドの継代を開始し、有意な出芽構造が形成され、オルガノイドの内腔が暗くなった。
注:オルガノイドの内腔は、死んだ細胞、破片、粘液の蓄積のために暗くなります。分割する前にオルガノイドを過剰に成長させないでください。分割比はオルガノイドの成長に依存する。オルガノイドを6日目に1:2、10日目に1:3の比率で継代することが推奨される。 - 15 mL チューブに 4 mL の冷たいアドバンスト DMEM/F-12 を充填し、氷の上に保管します。
注: ここでは、96 ウェル培養プレートの容量が提供されています。別の形式を使用している場合は、それに応じて音量を調整します。 - BMMドームに触れることなく、ウェルからピペットまたは真空ポンプで培地を慎重に吸引し、廃棄してください。
- 1ウェルあたり100 μLのコールドアドバンストDMEM/F-12を加える。ピペットを上下に動かしてBMMを分解し、ウェルの内容物を15mLチューブに移します。
- 200 μL のコールドアドバンスト DMEM/F-12 でウェルを洗浄し、同じチューブに集めます。
注:同じ実験条件から複数のウェルを継代する場合、ウェルの内容物を同じ15mL収集チューブにプールすることができます。 - 15 mL の収集チューブを 100 x g で 4°C で 5 分間回転させます。
- 上清を捨て、1mLのコールドアドバンストDMEM/F-12をペレットに加える。P1000チップを使用して、P10チップ(フィルターなし)とピペットを少なくとも20回上下に巻き上げます。
- 4 mL の冷たいアドバンスト DMEM/F-12 をチューブに加えます。300 x g で4°Cで5分間スピンします。
- ペレットを乱すことなく、ピペットまたは真空ポンプで上清を吸引する。その後、ペレットを機械的に破壊する。
- 増殖培養液で希釈したBMMを加える(2:1比)。ミックスに気泡を導入せずに慎重に上下にピペットをピペットします。
- プレート10 μLの陰窩/ BMMを各ウェルに混合する。
- プレートをRTで5分間保持して、BMMが固化できるようにします。プレートを37°Cおよび5%CO2 で15分間インキュベーターに入れます。
- 各ウェルに250 μLの成長培地を加える。
メモ: BMM を切り離さないように注意してください。 - プレートを37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに入れます。
4. 腸管オルガノイドの酸化ストレスを評価するための試薬および材料の調製
- 阻害剤N-アセチルシステイン(NAC)の250mMストック溶液( 材料表を参照)を調製し、10mgを245μLのDPBSで再懸濁する。1 mMの最終濃度で使用してください。
- 誘導剤Tert-ブチルヒドロペルオキシド(tBHP)の50 mMストック溶液を水で70%、3.22 μLを496.8 μLのDPBSで希釈する。最終濃度200 μMで使用してください。
- フローサイトメトリー試験では、原液をDMSOで1/10希釈して、蛍光発生プローブの250μM作業溶液( 材料表を参照)を調製します。最終濃度1 μMで使用してください。
注:製造元の説明書に示されているように、蛍光発生プローブは光と酸素に敏感です。株式とアリコートは、何度も開いたり閉じたりしてはいけません。 - イメージング研究のために、原液をDMSOで1/2希釈することによって蛍光発生プローブの1.25 mM作業溶液を調製する。最終濃度5 μMで使用してください。
- DPBS中の0.1 μg/mL DAPIの最終溶液を調製し、フローサイトメトリーアッセイにおける死細胞識別に使用する。
- ヘキスト33342をDPBSで1.25 mg/mLに希釈する。イメージングアッセイにおける核染色に使用する最終濃度を 5 μg/mL で使用します。
- フェノールレッドを含まないDMEMを37°Cで温める。
注:これらのステップでは、 図2Aに示された条件を使用して、任意のアッセイに含める必要がある陰性対照および陽性対照の使用について説明します。アッセイは、抗酸化または酸化促進化合物を試験するために使用することができる。ステップは同じであり、唯一の違いは、蛍光原性染料を使用する前に化合物を添加する場合である。
5. 共焦点顕微鏡による3Dオルガノイドの酸化ストレスの可視化
- μ-Slide 8ウェルチャンバーに播種したオルガノイドを取り、対応するウェルに1 μL NACストック溶液を加えて、1mMの最終濃度を得た。
- 37°Cおよび5%CO2で1時間インキュベートする。
- 対応するウェルに1 μL tBHPストック溶液を加え、最終濃度200 μMを得た。
- 37°Cと5%CO2で30分間インキュベートする。
- 蛍光発生プローブの1.25 mM希釈液を1ウェルあたり1 μL加え、終濃度5 μMを得た。
- ヘシュトの1.25 mg/mL希釈液を1ウェルあたり1 μL加え、最終濃度5 μg/mLを得た。
- 37°Cと5%CO2で30分間インキュベートする。
- BMM を乱さずにメディアを取り外します。穏やかに、フェノールレッドを含まない250μLの温かいDMEMを加える。
注:長期的な買収が計画されている場合は、フェノールレッドを含まないDMEMに成長因子化合物を追加します。 - 蛍光発生プローブ(ROS)を検出する熱チャンバーとガス供給を備えた共焦点顕微鏡を用いてオルガノイドを画像化する。
注:蛍光発生プローブの励起/放出(ex/em)は644/665、ヘキスト(核)のex/emは361/486、GFP(Lgr5-GFPマウス由来の腸幹細胞)のex/emは488/510です。63倍の油浸対物レンズは、幹細胞のシグナルを検出するために使用されます。サンプル間でレーザー設定を変更しないでください。ROS生産の概要を可能にするために、20倍の目標を使用することができます。 - ポジティブコントロールを使用してROS信号のレーザー強度と時間露出を設定し、この信号がネガティブコントロールで低くなっていることを確認します。
- スライドの接眼レンズスクリーンを用いて、GFPオルガノイドを同定し、発現し、レーザー強度を調整した。
メモ: この手順は手動で実行されます。 - 位置を定義して、オルガノイド全体のステッチ画像を取得します。25 μm(ステップサイズ5 μm)のzスタックをセットアップして、1層の細胞を示すオルガノイドの断面を得た。
メモ:セットアップを最適化するには、顕微鏡のユーザーマニュアルを参照してください。生細胞を使用して、獲得はインキュベーション終了後1時間以内に行うべきである。 - オープンソースの画像処理ソフトウェアで画像を開きます( 材料表を参照)。
- Zスタックを調べて、オルガノイドの中央がよく表されているセクションを選択し、選択した領域で新しい画像を作成します。
- 手順 5.15.1 ~ 5.15.5 に従って画像を定量化します。
- フリーハンドラインツールを選択します。
- 核の後に線を引きます。
注:幹細胞のみを解析する場合は、GFP陽性細胞を示す領域のみを選択します。 - 線幅を広げて、管内破片を含めずにセル層を線で覆います。
- ROS信号のチャンネルを選択し、選択した領域の蛍光強度を測定し、値に注釈を付けます。
- シグナルがないところに線を引き、前の値に減算されるバックグラウンドの蛍光強度を測定して、最終的な強度を取得します。
6. フローサイトメーターを用いた解離したオルガノイドの酸化ストレスの定量化
- ネガティブコントロール用のウェルに1 μL NACストック溶液を加え、1 mMの最終濃度を得た。
メモ:96ウェルの丸底プレートにメッキされたオルガノイドを使用してください。 - 37°Cおよび5%CO2で1時間インキュベートする。
- 対応するウェルに1 μL tBHPストック溶液を加え、最終濃度200 μMを得た。
- 37°Cと5%CO2で30分間インキュベートする。
- マルチチャンネルピペットで、取り付けられたBMMを乱すことなく培地を取り出し、別の96ウェル丸底プレートに移します。このプレートは脇に置いておきます。
- 100 μLのトリプシンを加え、マルチチャンネルピペットで、ピペットを少なくとも5回上下させてBMMを破壊します。
- 37°Cと5%CO2で5分以内にインキュベートする。
- マルチチャンネルピペットで、ピペットを少なくとも5回上下させてオルガノイドを解離させます。
- RTで300 x g で5分間スピンします。
- プレートを反転させて上澄み液を捨てる。ステップ6.3で回収した培地を対応するウェルに戻し、上下に5回ピペッティングして細胞を再懸濁する。
- 250 μM 希釈液から 1 ウェルあたり 1 μL を加え、37 °C および 5% CO2 で 30 分間インキュベートします。
メモ:機器の設定に必要なウェルに蛍光プローブを追加しないでください(図2B)。 - RTで300 x g で5分間スピンします。
- 細胞を250 μLの0.1 μg/mL DAPI溶液で再懸濁する。サンプルを適切なフローサイトメトリーチューブに移し、チューブを氷上に保持して分析を進めます。
メモ:DAPIの代わりにPBSを計測器の設定に必要なウェルに追加します(図2B)。 - モノ染色サンプルを使用して、各蛍光色素分子の染色されていないコントロールおよびレーザー電圧の順方向散乱電圧と側方散乱電圧設定を最適化します。
- 適切なゲーティング戦略 (図 4A) を使用して、少なくとも 20,000 個のイベントを収集します。
注: 50,000 イベントが推奨されます。詳細な集録設定は、使用する機器によって異なります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
記載されたプロトコールの概念実証として、腸幹細胞がモザイクGFP発現を示すLgr5-eGFP-IRES-CreERT2マウス系統から得られた陰窩が使用され、これはBarkerらによって確立され、腸幹細胞10 を最初に特徴付け、それらのGFP発現に基づいてこれらの細胞をマッピングすることを可能にする。これにより、異なる治療時に特定の細胞型集団におけるROSレベルを比較するためのモデルが提供される。ROS阻害剤(NAC)と、細胞ROSに作用してそのレベルの変化を可視化することが知られている誘導物質(tBHP)が用いられた。
図1Aおよび図1Bは、腸管オルガノイド培養のための陰窩抽出手順の間に得られた画分F1およびF4の代表的な画像を示す。各画分は、抽出手順中に顕微鏡または双眼でチェックして、陰窩の剥離に従い、絨毛、単一細胞、または破片ではなく、陰窩に富んだ画分を定義する必要があります。次に、選択した画分を一緒にプールし、70μmのセルストレーナーに通して、残りの絨毛の断片をすべて除去し、陰窩のみを含む調製物を得る(図1C)。陰窩はBMMに埋め込まれてから数時間以内に閉じ始め、D1では丸いオルガノイドが観察された(図1D)。3〜5日後、オルガノイドは「新しく形成された陰窩」を表す出芽構造で現れるでしょう。オルガノイドはROS分析の準備ができています(図1Eおよび1F)。
共焦点顕微鏡による酸化ストレスのイメージングのプロトコールでは、オルガノイドを含むスライドをプローブと共にインキュベートし、レーザーおよびフィルターを備えた共焦点蛍光顕微鏡で画像化し、ヘキスト(例/em:361/486)、GFP(例/em:488/510)、および蛍光発生プローブ(ex/em):644/665)シグナルを検出した。20倍の空気と63倍の油浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡により、ROSの可視化が可能になりました。Lgr5-GFPマウスにおいて、GFP陽性細胞はLgr5発現腸幹細胞である。 補足図1 は、いくつかのオルガノイドにおけるROSの概要を提供する20倍の目的で得られた代表的な画像を示す。 図3 は、GFPを発現する腸管オルガノイドの、非処置(NT)、またはROS阻害剤NACとのプレインキュベートまたは不均一、およびROS誘導物質tBHPで30分間刺激されたか否かの代表的な画像を示す。
阻害剤の存在下では、オルガノイドの内腔に含まれる死細胞からの唯一のシグナルが見える。非処理オルガノイドでは、基礎ROSレベルが示され、幹細胞が分化細胞よりも高いROSを産生することが証明されている(顕微鏡の設定によれば、ROSシグナルは非幹細胞においても可視化される可能性がある)。GFP陽性細胞は、蛍光発生プローブの存在下でインデューサーと共により有意な細胞質シグナルを提示し、特に治療後の幹細胞においてROSレベルが増加することを実証している。
図4は、405nm、488nm、および630nmレーザーを搭載したフローサイトメーターを用いて、ROS阻害剤または誘導剤で刺激されたか否かの腸管オルガノイドにおけるROS産生を分析したときに得られた代表的な結果を示す。図4Aに提示されたゲーティング戦略は、オルガノイド細胞集団全体のレベルでROS産生を評価することを可能にし、物理的パラメータおよびDAPI排除(SSC−A対FSC−AおよびDAPI対FSC−A)およびFSC−H対FSC−A)に基づいてインタクトおよび生細胞を定義するか、または腸幹細胞においてのみ、GFP高シグナルを有する細胞上でさらにゲーティングする。図4Bは、50,000個の事象を収集したときの総母集団におけるROSレベルを示す。非処理(NT)細胞における基礎ROSレベルは、阻害剤(NAC)による刺激後に減少し、逆に、インデューサー(tBHP)によるチャレンジ後に増加する。インヒビターで前処理し、次いでインデューサーで刺激された細胞は、インデューサー単独で刺激されたものよりも低いレベルを提示する。次いで、結果を適切なソフトウェアを用いて分析し、蛍光強度の中央値(MFI)を求める。得られた値は、図4Bの右側に提示されたグラフに示すように、未処理細胞にわたる比率として提示される。図4Cは、GFP陽性細胞としてゲーテッド化した幹細胞における図4Bに記載したのと同じパラメータを示し、非刺激細胞に対するNAC処理時のROSレベルの3.5倍の減少およびtBHP処理時の4倍の増加を示す。この結果は、このプロトコールに従って、オルガノイドを特定の化合物で処理した際の全細胞集団のレベルまたはGFP陽性幹細胞におけるROSレベルの差異を定量化することができることを実証する。
図1:陰窩およびオルガノイドの代表的な画像。 (A)EDTAとの最初のインキュベーション後に得られた画分F1の例、絨毛(正方形)に富み、いくつかの破片(星)および陰窩(円)。(B)陰窩に富化された画分F4の例。(c)70μmのセルストレーナー(スケールバー、200μm)による濾過後に得られた単離された陰窩のみを提示する懸濁液。(D、 E、および F)。典型的なオルガノイドは、BMMに陰窩を埋め込んだ後、それぞれ1、3、および5日後に得られた(スケールバー、100μm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:実験計画の概要 (a)各実験に含まれるこのプロトコールで使用される条件:非処理ウェル(NT)、インデューサー処理ウェル(tert-ブチルヒドロペルオキシド-tBHP)、インヒビター処理ウェル(N-アセチルシステイン-NAC)、およびインヒビター処理ウェル(NAC-tBHP)。(b)フローサイトメトリーアッセイのためのプレートフォーマット。各条件は3連でメッキされます(A行目)。ラインB、C、およびDには、蛍光発生プローブのみ、DAPIのみ、または非染色(NS)サンプルを使用したフローサイトメーター設定用のウェルが含まれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:オルガノイドにおけるROS染色の代表的な共焦点画像。 高速EMCCDカメラを搭載した共焦点顕微鏡、63x/1.4オイル対物レンズ、スリット35μmでステッチ画像を取得し、レーザー405、488、640、フィルター460/50、535/50、700/75を用いて、それぞれヘキスト、GFP、蛍光発生プローブを取得しました。非処理(NT)、ROS阻害剤(NAC)、ROSインデューサー(tBHP)で処理、またはROSインヒビターで前処理し、次いでROSインデューサー(NAC-tBHP)で刺激したオルガノイドの共焦点光学切片。灰色で、核はヘキストで染色された。緑色で, Lgr5-GFP細胞;赤色で、蛍光発生プローブ(スケールバー、50μm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:オルガノイド由来の細胞におけるROSの代表的なフローサイトメトリー分析。 (a)フローサイトメトリー分析で使用されるゲーティング戦略の概略図:細胞形状に対するゲーティング(オルガノイド内腔に蓄積された死細胞および破片の排除)、生細胞(DAPI−レーザー405を組み込んでいない細胞)のためのゲーティング、単一細胞のためのゲーティング(ダブレット弁別)、および幹細胞(GFP陽性細胞−レーザー488)(FSC:前方散乱、SSC:側方散乱)。ROS信号は630レーザを使用して取得されています。(B)左側では、異なるサンプルNT:非処理における全生存集団(条件ごとに約10,000事象をゲーティングした後)の強度ROSシグナルを示す適切なソフトウェアを用いてヒストグラムが得られた。NAC:阻害剤処理;tBHPインデューサー治療;NAC-tBHP:阻害剤および誘導物質処理。右側は、条件ごとに3サンプル(平均±SDで)から開始した実験中に得られたNTサンプルに対するMFI値の計算された比の典型的な例(*** P = 0.0003)。(C)GFP陽性集団(条件当たり1,000事象)のBと同じ(*P=0.02)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:オルガノイドにおけるROS染色の代表的な共焦点画像。 高速EMCCDカメラ、20倍対物レンズ、スリット35μmを搭載した共焦点顕微鏡でステ ッチアイマージュを取得し、レーザー405、488、640、フィルター460/50、535/50、700/75を使用して、それぞれヘキスト、GFP、および蛍光発生プローブを取得しました。非処理(NT)、ROS阻害剤(NAC)、ROSインデューサー(tBHP)で処理、またはROSインヒビターで前処理し、次いでROSインデューサー(NAC-tBHP)で刺激したオルガノイドの共焦点光学切片。灰色で、核はヘキストで染色された。緑色で, Lgr5-GFP細胞;赤色の蛍光発生プローブ(スケールバー、100μm)で。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この研究は、マウスの空腸陰窩を単離し、それらを3Dオルガノイドに培養し、ROS感受性蛍光発生プローブとオルガノイド全体の定性顕微鏡イメージングおよびオルガノイド解離後の単一細胞に対するフローサイトメトリーを用いた定量的ROS測定と組み合わせることによって、オルガノイド中のROSを分析するための段階的なプロトコルを提供する。
この方法の最初の重要なステップは、暗号抽出手順です。実際、陰窩調製の質は、オルガノイド形成を成功させる鍵である。したがって、濃縮されたクリプトと少数の細胞破片または死にかけている細胞を有する画分を得ることが不可欠である。解離はマウスの年齢および健康状態によって変化する可能性があるため、陰窩はプロトコルに示されたものとは異なる画分で見出され得る。EDTAインキュベーションの数は、それに応じて変更することができる。フラクション4の後に陰窩が剥離していないように見える場合は、3分間のEDTAインキュベーションを繰り返す必要があります。逆に、最初のEDTAインキュベーション後にクリプトがすでに切り離されているとします。その場合、2回目のEDTAインキュベーションは必要なく、DPBSの連続的な渦ステップは、破片のない十分な陰窩でフラクションが得られるまで行うべきである。解離が起こらない場合は、Ca2+およびMg2+を含まないDPBSを使用して収集チューブを準備し、EDTAを新しい溶液と交換してください。地下室は壊れやすい構造なので、できるだけ氷の上に保管し、分離後に迅速にメッキする必要があります。
オルガノイドを栽培するために、異なるプレートおよび滴量を使用することができる。例えば、陰窩は、陰窩濃度、BMM滴の体積、および各ウェルに添加された培地を調整した後、24または48ウェルプレートに播種することもできる。複数の滴を12ウェルまたは6ウェルプレートの同じウェルに播種してもよい。一般に、陰窩はサイズが小さくなり、培養1日目に小さな丸いオルガノイドを形成するために丸みを帯びる。新しい芽の形成は、めっきの2〜3日後に観察されるべきである。
腸幹細胞におけるROSレベルの変化を研究するために、Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2マウス系統の利点が取られた。このモデルの注意点は、ノックインされた対立遺伝子の選択的サイレンシングと、幹細胞のパッチまたは陰窩全体に存在しない可能性があるGFP発現の結果生じるモザイク現象である。イメージングプロトコルの間、すべてのオルガノイドがGFPを発現する幹細胞を提示するわけではない。したがって、細胞の空間的位置に依存することが可能でない限り、すべてのオルガノイドが考慮されるわけではない。代わりに、フローサイトメトリープロトコルでGFP陰性細胞集団を分析する際には、これを考慮する必要があります。実際、空間的位置に頼ることは不可能であるため、GFP陰性集団は非幹細胞とGFP陰性幹細胞で構成されることになる。
ここでは、腸内オルガノイドにおけるROSの定性的評価のためのプロトコルが提供される。この部品の重要な側面は、使用される目標の作動距離にリンクされています。オルガノイドはBMM中で増殖する。それらは井戸の底に取り付けられておらず、客観的な焦点計画からの距離を導入する。このため、この問題を最小限に抑えるために、オルガノイドをBMMの薄い層にプレートすることが重要です。この最適化された設定であっても、すべてのオルガノイドが適切に画像化される正しい位置にあるわけではありません。
画像の定量分析は、適切な画像解析ソフトウェアを使用して行われ、プロトコルに記載されているようにROS信号チャネル内の画像の平均蛍光強度を評価することができる。このためには、統計的に有意であるのに十分な数の事象を得るために、多数の画像を取得する必要がある。前述のように、Lgr5-GFPマウスを使用すると、すべてのオルガノイドがGFPを発現するわけではなく、画像化するためにかなりの数のサンプルが必要です。
フローサイトメトリー手順の間、重要なステップは、オルガノイドの単一細胞への解離である。解離が厳しすぎると、細胞が死んでDNAを放出する可能性があります。アノイキスに対抗するために岩石阻害剤Y-27632、およびDNAseを解離バッファーに添加してもよい。トリプシン希釈またはインキュベーション時間の短縮が使用され得る。
最後に、異なる治療(抗酸化または酸化促進)試験後のROS産生を分析するのに最適な時点を定義することが重要です。数分または数時間以内にROSを迅速に誘導する薬物の場合、イメージングアッセイを使用して、試験化合物の前に蛍光発生プローブを添加することによって、最大誘導があるかどうかを判断することができる。オルガノイド刺激後のプローブの蛍光強度は、異なる日に実施される実験間で変化し得る。したがって、プローブの反応性を検証するために、非刺激サンプルとの比を計算し、コントロール(酸化剤/抗酸化剤)を添加することが常に重要です。NACおよびtBHPは、最も決定的な結果をもたらしたため、陰性対照および陽性対照として使用された。それでも、抗酸化剤としてレスベラトロール、または酸化剤としてパラコート/メナジオンなどの他の試薬を使用することができる。蛍光発生プローブで細胞を長時間インキュベートすると毒性があり、細胞の酸化還元バランスが変わることさえあるため、インキュベーション時間も厳密に制御する必要があります。プローブで染色された細胞は、数時間後に固定および分析され得る。この場合、フローサイトメトリー分析では、DAPIは生細胞と死細胞を区別することはできません。代わりに、固定前に生死を区別するための固定可能な染料を使用する必要があります。
オルガノイドは数日間(7日以上)増殖させることもできるが、これは、オルガノイド内腔に蓄積する生細胞および増殖細胞および死細胞の数を増加させ、特にイメージングアッセイにおいて高いバックグラウンドを生成する。蛍光発生プローブシグナルの異常な増加が観察される場合、刺激化合物を再懸濁するために使用される溶液がそれ自体の酸化促進剤(すなわち、エタノール)ではないことを確認する。
このプロトコルを使用する際に考慮すべき懸念の1つは、ライブイメージングと細胞解離に続いてフローサイトメトリーが細胞に酸化ストレスを誘導し、バックグラウンドシグナルを生成する可能性があることです。オルガノイドの固定は、実験に従って考慮され得る。別の制限は、3Dマトリックス中で成長したオルガノイドの詳細なイメージングの困難さから生じる。プロトコルで述べたように、BMMは、この側面を制限するために薄い層としてスライド上に配布する必要があります。
ここで、プロトコルは、市販の蛍光原性色素を用いて設計される。その主な利点は、特定の細胞型となるようにオルガノイドの多色染色との適合性である。例えば、蛍光発生プローブインキュベーションの直後に細胞表面マーカーに対する抗体染色は、特定のサブタイプを検出するために行われてもよい。しかし、プローブは、スーパーオキシド、亜硝酸塩過酸化物、および過酸化水素を検出できるため、特定のROS種に特異的ではありません11,12,13。このため、一般に全球酸化ストレスの検出に用いられている。細胞質のみのプローブとして商品化されているが、選択された蛍光発生プローブはミトコンドリアに到達することが見出された14。その特異性は異なる細胞コンテキスト間で異なる可能性があるため、可能であればROSを測定するために他の補完的なアプローチを使用することをお勧めします。ミトコンドリアで生成されたスーパーオキシドアニオンを検出するのに特異的なプローブなどの代替色素を使用することもできます10。ルシフェリンベースのプローブなど、特定のROS種を高感度に検出するために、化学発光プローブのレパートリーも開発されました15,16。これらは、in vivoイメージングと互換性があるという利点を有するが、ROS産生を特定の細胞型とマッピングするために使用できない。最後に、このプロトコルは、他のタイプのオルガノイド、例えば、ヒト生検に由来する結腸オルガノイドに適用することができる。この場合、培養増殖培地はそれに応じて適合させる必要があります17。腸細胞内の酸化還元機構をさらに分析するために、このプロトコールに記載されるオルガノイド培養および解離手順を、オルガノイド全体または蛍光活性化細胞選別(FACS)オルガノイド細胞に対するトランスクリプトームおよびプロテオミクスアプローチと組み合わせることができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、フランス国立研究機関(ANR)の助成金17-CE14-0022(i-Stress)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
