Diseño y desarrollo de un modelo para estudiar el efecto del oxígeno suplementario en el microbioma de las vías respiratorias de la fibrosis quística

Summary

El objetivo de este protocolo es desarrollar un sistema modelo para el efecto de la hiperoxia en las comunidades microbianas de las vías respiratorias de la fibrosis quística. El medio de esputo artificial emula la composición del esputo, y las condiciones de cultivo hiperóxico modelan los efectos del oxígeno suplementario en las comunidades microbianas pulmonares.

Abstract

Se cree que las comunidades microbianas de las vías respiratorias desempeñan un papel importante en la progresión de la fibrosis quística (FQ) y otras enfermedades pulmonares crónicas. Los microbios se han clasificado tradicionalmente en función de su capacidad para usar o tolerar el oxígeno. El oxígeno suplementario es una terapia médica común administrada a personas con fibrosis quística (pwCF); sin embargo, los estudios existentes sobre el oxígeno y el microbioma de las vías respiratorias se han centrado en cómo la hipoxia (bajo nivel de oxígeno) en lugar de la hiperoxia (alto contenido de oxígeno) afecta a las comunidades microbianas pulmonares anaeróbicas predominantemente aeróbicas y facultativas. Para abordar esta brecha crítica de conocimiento, este protocolo se desarrolló utilizando un medio de esputo artificial que imita la composición del esputo de pwCF. El uso de la esterilización por filtro, que produce un medio transparente, permite que los métodos ópticos sigan el crecimiento de microbios unicelulares en cultivos en suspensión. Para crear condiciones hiperóxicas, este sistema modelo aprovecha las técnicas de cultivo anaeróbico establecidas para estudiar las condiciones hiperóxicas; en lugar de eliminar el oxígeno, el oxígeno se agrega a los cultivos mediante el sparging diario de botellas de suero con una mezcla de oxígeno comprimido y aire. El esputo de 50 pwCF se sometió a un sparging diario durante un período de 72 horas para verificar la capacidad de este modelo para mantener condiciones diferenciales de oxígeno. La secuenciación metagenómica con escopeta se realizó en muestras de esputo cultivadas y no cultivadas de 11 pwCF para verificar la capacidad de este medio para apoyar el crecimiento de microbios comensales y patógenos que se encuentran comúnmente en el esputo de fibrosis quística. Se obtuvieron curvas de crecimiento a partir de 112 aislamientos obtenidos de pwCF para verificar la capacidad de este medio de esputo artificial para apoyar el crecimiento de patógenos comunes de fibrosis quística. Encontramos que este modelo puede cultivar una amplia variedad de patógenos y comensales en el esputo cf, recupera una comunidad muy similar al esputo no cultivado en condiciones normóxicas y crea diferentes fenotipos de cultivo en condiciones variables de oxígeno. Este nuevo enfoque podría conducir a una mejor comprensión de los efectos imprevistos inducidos por el uso de oxígeno en pwCF en las comunidades microbianas de las vías respiratorias y los patógenos respiratorios comunes.

Introduction

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética caracterizada por una incapacidad para eliminar el moco espeso de los pulmones, lo que lleva a infecciones repetidas y disminución progresiva de la función pulmonar que a menudo resulta en la necesidad de un trasplante de pulmón o la muerte. El microbioma de las vías respiratorias de los pacientes con fibrosis quística (PTCF) parece rastrear la actividad de la enfermedad^1,con una reducción de la diversidad microbiana asociada con resultados adversos a largo plazo^2,3. En estudios clínicos de pwCF, la oxigenoterapia suplementaria se ha ....

Protocol

Este estudio recibió la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de Socios (Protocolo # 2018P002934). El criterio de inclusión incluyó pacientes adultos con fibrosis quística que dieron su consentimiento informado por escrito para el estudio. No había criterio de exclusión. De acuerdo con las pautas del protocolo, todas las muestras de esputo se recolectaron de pacientes con fibrosis quística durante una visita ambulatoria programada con su proveedor clínico.

1. Preparación del medio de esputo artificial

NOTA: Las cantidades enumeradas aquí son para la producción de 1 L de medio de esputo artificial final, ....

Results

Estos protocolos se aplicaron a 50 muestras de esputo expectorado de pwCF que se presentaron para atención de rutina a una clínica ambulatoria de fibrosis quística en el Hospital General de Massachusetts en Boston, Massachusetts. El esputo de cada paciente se cultivó bajo condiciones de oxígeno al 21%, 50% y 100% utilizando el medio de esputo artificial, con 0,5 ml de alícuotas tomadas de cada cultivo a las 24 h, 48 h y 72 h de tiempo de cultivo para la prueba. Las culturas fueron fotografiadas cuando se hicieron extracc.......

Discussion

En este estudio, se desarrolló un modelo in vitro para estudiar el efecto de la hiperoxia en las comunidades microbianas pulmonares. Este modelo, basado en medio de esputo artificial y sparging diario de botellas de suero, mantiene concentraciones elevadas de oxígeno y apoya el crecimiento de microbios identificados en esputo de pwCF.

Hay varios pasos críticos de este enfoque. La primera es la elección de usar la esterilización por filtro en lugar de la esterilización por calor del me.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BME Vitamins (100x) Solución	MilliporeSigma	B6891	Solución concentrada de vitaminas suplementarias.
Engarzadora, 30 mm	DWK Life Sciences	224307	Engarzadora para fijar juntas de aluminio a botellas de suero.
D-(+)-Glucosa	MilliporeSigma	G7021	Glucosa sólida en polvo (isómero dextrógiro).
Bomba de diafragma ME 2	NT VACUUBRAND 20730003		Bomba de vacío para filtración al vacío.
Emulsión de Yema de Huevo	HiMedia	FD045	Emulsión estéril de 30% de yema de huevo en solución salina.
Ferritina catiónica a partir de bazo de caballo	MilliporeSigma	F7879	Solución de ferritina (proteína de almacenamiento de hierro).
Quemador Bunsen de seguridad FIREBOY plus	Integra Biosciences	144000	Quemador Bunsen con interfaz de usuario y características de seguridad.
Papel de pH Hydrion (1.0– 14.0)	Micro Essential Laboratory	94	Papel de prueba de pH para el rango de 1.0 – 14.0.
Papel de pH Hydrion (4.0– 9.0)	Micro Essential Laboratory	55	Papel de prueba de pH para el rango de 4.0 – 9.0.
Papel de pH Hydrion (6.0– 8.0)	Micro Essential Laboratory	345	Papel de prueba de pH para el rango de 6.0 – 8.0.
Dispositivo de seguridad Hypodermic Needle-Pro EDGE,	agujas Smiths Medical	401815	de 18 g con tapones de seguridad.
Manómetro en línea	MilliporeSigma	20469	Manómetro de gas para controlar la presión de las botellas.
Innova 42 Agitador Incubado	Eppendorf	2231000756	Combinación incubadora/agitador orbital.
Jeringa Luer-Lok con aguja acoplada	Becton Dickinson	309580	Combinación jeringa de 3 mL y aguja de 18 G.
Surtido de válvulas Luer World	Precision Instruments	14011	Válvulas para tubos de flujo de gas.
Agitador orbital LSE	ThermoFisher Scientific	6780-NP	Agitador orbital para agitar medios durante la filtración.
Sulfato de magnesio heptahidratado	MilliporeSigma	M2773	Sal sólida de Epsom (sulfato de magnesio heptahidratado).
Regulador de aire medicinal de una sola etapa con caudalímetro	Western Enterprises	M1-346-15FM Regulador de caudal de	aire con medidor de 15 L / min.
MEM Solución de Aminoácidos (50x)	MilliporeSigma	M5550	Solución concentrada de aminoácidos esenciales.
MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales (100x)	MilliporeSigma	M7145	Solución concentrada de aminoácidos no esenciales.
Filtro Millex-GP, 0,22 y micro; m	MilliporeSigma	SLMP25SS	0.22 y micro; M Filtro de jeringa estéril con membrana de polietersulfona.
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	sistema de filtración de agua estéril Milli-Q.
Monitor de oxígeno MiniOX 3000 MSA		814365	Monitor de porcentaje de oxígeno de flujo de gas.
Tampón MOPS (1 M, pH 9.0)	Tampón	BOPS BBM-90	de Boston BioProducts para ajustar el pH del medio.
Mucina de Estómago Porcino	MilliporeSigma	M2378	Mucina (proteína glicosilada formadora de gel) en polvo.
Kit de conexión de púas de polipropileno natural	Harvard Apparatus	72-1413	Conectores para tubería de flujo de gas.
Kit de preparación de bibliotecas de ADN Nextera XT	Illumina	FC-131-1096 Preparación de	bibliotecas para la identificación durante la secuenciación.
Sistema de secuenciación NovaSeq 6000	Illumina	770-2016-025-N Plataforma de	secuenciación de escopeta para la generación de lecturas de muestras.
Regulador de oxígeno de una etapa con caudalímetro	Western Enterprises	M1-540-15FM Regulador de caudal de	oxígeno con medidor de 15 L/min.
Tubo de oxígeno con 2 conectores estándar	SunMed	2001-01	Tubo para conectar componentes del sistema de gas.
Solución salina tamponada con fosfato, 10x, pH 7.4	Molecular Biologicals International	MRGF-6235	Solución salina concentrada tamponada con fosfato.
PC 420 Placa calefactora/agitador	Marshall Scientific	CO-PC420	Combinación de placa calefactora/agitador.
Cloruro de potasio	MilliporeSigma	P9541	Sal sólida de cloruro de potasio.
Barras agitadoras desechables de PTFE	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Barras agitadoras magnéticas desechables.
Cinta de teflón con sello de rosca de PTFE	VWR	470042-938	Cinta de teflón para reforzar las conexiones del sistema de gas.
Cartucho de purificación Q-Gard 2	MilliporeSigma	QGARD00D2	cartucho de purificación para el sistema Milli-Q.
Botellas de almacenamiento de medios reutilizables	ThermoFisher Scientific	06-423A	Botellas para mezclar y almacenar medios de cultivo.
Tapón de goma, 30 mm, Bromobutilo gris	DWK Life Sciences	224100-331	Tapones de goma para frascos de suero.
Frasco de suero con graduaciones moldeadas, 500 mL	DWK Life Sciences	223952	Frascos de suero de vidrio para cultivo sellado.
Juego de extensión de diámetro pequeño	Braun Medical	471960	Extensión de tubo con conectores luer lock.
Cloruro de sodio	MilliporeSigma	S3014	Sal sólida de cloruro de sodio.
Spike-in Control I (alta carga microbiana)	ZymoBIOMICS	D6320	Microbios con espiga (I. halotolerans y A. halotolerans) para cálculos de carga microbiana absoluta
Stericup Quick Release Sistema de filtración al vacío estéril	MilliporeSigma	S2GPU02RE	250 mL 0.22 µ m Cámara de filtración al vacío.
Toallitas Germicidas Desechables Super Sani-Cloth	Disponables International	H04082	Toallitas germicidas desechables para esterilización.
Mezcla de metales traza, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	solución concentrada de metales traza fisiológicos.
Junta de aluminio sin revestimiento, 30 mm	DWK Life Sciences	224187-01	Juntas de aluminio engarzadas sobre los tapones de goma.
Tanque de aire de grado médico USP Airgas		AI USP200	Tanque de aire comprimido para entrada al sistema de rociado.
Tanque de oxígeno de grado médico USP Airgas		OX USP200	Tanque de oxígeno comprimido para entrada al sistema de rociado.