La distancia espacial es un parámetro clave en la evaluación de la lesión por hipoxia/reoxigenación en un modelo de cocultivo de capas separadas de células endoteliales y cardiomiocitarias, lo que sugiere, por primera vez, que la optimización del entorno espacial de cocultivo es necesaria para proporcionar un modelo in vitro favorable para probar el papel de las células endoteliales en la protección de los cardiomiocitos.
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Artículo de método
Desarrollo de un modelo de cocultivo celular para imitar la isquemia/reperfusión cardíaca in vitro
En este artículo
Resumen
Resumen
La cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte y discapacidad en todo el mundo. La reperfusión causa lesiones adicionales más allá de la isquemia. Las células endoteliales (CE) pueden proteger a los cardiomiocitos (CM) de la lesión por reperfusión a través de las interacciones célula-célula. Los cocultivos pueden ayudar a investigar el papel de las interacciones célula-célula. Un cocultivo mixto es el enfoque más simple, pero es limitado ya que los tratamientos aislados y los análisis posteriores de tipos de células individuales no son factibles. Para investigar si las CE pueden atenuar el daño de las células CM dependiendo de la dosis y si esta protección puede optimizarse aún más variando la distancia de contacto entre las dos líneas celulares, utilizamos células endoteliales de la arteria coronaria primaria de ratón y cardiomiocitos de ratón adulto para probar tres tipos de insertos de cultivo celular que variaron en su distancia de capa intercelular a 0,5, 1,0 y 2,0 mm, respectivamente. Solo en los CM, la lesión celular evaluada por la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) aumentó significativamente durante la hipoxia y más adelante tras la reoxigenación cuando la distancia fue de 2,0 mm en comparación con 0,5 y 1,0 mm. Cuando los CE y los CM estaban en contacto casi directo (0,5 mm), solo hubo una atenuación leve de la lesión por reoxigenación de los CM después de la hipoxia. Esta atenuación aumentó significativamente cuando la distancia espacial fue de 1,0 mm. Con una distancia de 2,0 mm, las CE atenuaron la lesión de CM durante la hipoxia y la hipoxia / reoxigenación, lo que indica que es necesario un distanciamiento de cultivo suficiente para que las CE se diaguen con los CM, de modo que las moléculas de señal secretadas puedan circular y estimular completamente las vías protectoras. Nuestros hallazgos sugieren, por primera vez, que la optimización del entorno espacial de cocultivo CE/CM es necesaria para proporcionar un modelo in vitro favorable para probar el papel de las CE en la protección contra la CM contra la lesión simulada de isquemia/reperfusión. El objetivo de este informe es proporcionar un enfoque paso a paso para que los investigadores utilicen este importante modelo a su favor.
Introducción
La cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte y discapacidad en todo el mundo 1,2. Sin embargo, el proceso de tratamiento de la reperfusión puede causar la muerte de los cardiomiocitos, conocida como lesión por isquemia/reperfusión (IR) miocárdica, para la cual todavía no existe un remedio efectivo3. Se ha sugerido que las células endoteliales (CE) protegen los cardiomiocitos (CM) a través de la secreción de señales paracrinas, así como las interacciones de célula a célula4.
Los modelos de cocultivo celular se han utilizado ....
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Protocolo
1. Preparación/emplatado experimental
- Mantenga los CM y ECs de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Descongele ambas líneas celulares cuando lleguen de los vendedores. Placa en matraces T25 después de ser lavada con medios frescos. Se recomienda comprar cada medio de cultivo celular de los mismos proveedores a los que se compraron las células. Al día siguiente, actualice las celdas con medios y úselos cuando sean confluentes.
- Mantener la incubadora de cultivo celular a 37 °C con 21% O2, 5% CO2, 74% N2 y mantenerla humidificada.
NOTA: Las células endoteliales de la arteria corona....
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Resultados
Los tres tipos de insertos (A, B, C) utilizados en este experimento tienen el mismo tamaño de poro de 0,4 μm. La única diferencia entre ellos es la altura de inserción a base, que permite que las distancias entre las dos capas de células cocultivadas sean de 0,5, 1,0 y 2,0 mm, respectivamente, (Figura 3) y que sean de diferentes proveedores (para más detalles, consulte la Tabla de materiales).
Para establecer un modelo de cocultivo in vitro
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Discusión
Pasos críticos en el protocolo
Se han utilizado modelos de cocultivo celular para estudiar los mecanismos celulares de cardioprotección. Cómo crear dos capas separadas con una distancia significativa entre ellas es, por lo tanto, crucial para el desarrollo de un modelo de co-cultura adecuado. Un desafío en el estudio de la lesión por IR simulada, es decir, la FC, es que no solo la isquemia (hipoxia) en sí, sino también la reperfusión (reoxigenación) agrava la disfunción celular. Por lo tanto, un model.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado, en parte, por el Servicio de I + D del Laboratorio Biomédico del Departamento de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos (I01 BX003482) y por fondos institucionales a M.L.R.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cardiomiocitos de ratón adulto (CMs) | Celprogen Inc | 11041-14 | Aislado de tejido cardíaco de ratón adulto C57BL/6J |
| Contador de células automatizado Countess II | Invitrogen | A27977 | Recuento de células para el cálculo del número |
| de células Cabina de bioseguridad | Nuaire | NU425400 | Campana estéril de cultivo |
| celular Medio de congelación de cultivo celular | Cell Biologics Inc | 6916 | Se utiliza para la congelación de células para el almacenamiento a largo plazo de líneas celulares |
| Incubadora de cultivo celular | Nuaire | Nu-5500 | Para proporcionar condiciones de vida celular normales (21%O2, 5%COCO2, 74%N2, 37° C, humidificado) |
| Incubadora de cultivo celular Tanque de gas | A-L Gases comprimidos | UN1013 | Gas necesario para la incubadora de cultivo celular |
| Insertos de cultivo celular A (0,5 mm) | Corning Inc | 353095 | utilizado para el cocultivo EC-CM |
| Insertos de cultivo celular B (1,0 mm) | Millicell Millipore | PIHP01250 | utilizado para el cocultivo EC-CM |
| Insertos de cultivo celular C (2,0 mm) | Greiner Bio-One | 662640 | Utilizado para el cocultivo EC-CM |
| Centrífuga | Anstel Enterprises Inc | 4235 | Para el recubrimiento y el paso de cultivos celulares |
| Matraces de cultivo celular CMs T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | Utilizado para el cultivo regular de CMs, recubierto por el fabricante |
| CMs Medio de cultivo celular completo | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs medio de cultivo completo CMs Medio de |
| cultivo celular CMs completo libre de fenol | Celprogen Inc | M11041-14PN | Medio de cultivo CMs sin rojo de fenol utilizado durante la medición de LDH |
| CMs Placas de cultivo celular 96 pozo | Celprogen Inc | E11041-14-96pozo | Utilizado para experimentos de medición de LDH, recubierto por el fabricante |
| CMs Medio de cultivo celular de hipoxia | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | Cultivo celular de CMs en condiciones hipóxicas (sin glucosa ni suero) |
| Portaobjetos de la cámara de recuento de células Countess | Invitrogen | C10283 | Portaobjetos de recuento utilizados para el contador de células |
| Cyquant LDH Kit | de citotoxicidadThermo Scientific | C20301 | Kit de medición de LDH |
| Matraces de cultivo celular ECs T25 | Fisher Scientific | FB012935 | Se utiliza para ECs de cultivo regular |
| ECs Medio de cultivo celular | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs medio completo de cultivo ECs |
| cultivo celular completo libre de fenol | Cell Biologics Inc | M1168PF | ECs medio de cultivo sin rojo de fenol utilizado durante la medición de LDH |
| ECs Placas de cultivo celular de 96 pocillos | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | Utilizado para experimentos de LDH medición |
| ECs Cultivo Solución de recubrimiento a base de gelatina | Cell Biologics Inc | 6950 | Se utiliza para el recubrimiento de matraces y placas para ECs ECs |
| Hipoxia Medio de cultivo celular Cell | Biologics Inc | GPF1168 | ECs en condiciones hipóxicas (sin glucosa ni suero) |
| Suero fetal bovino (FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI Aprobado por el USDA para cultivo y mantenimiento celular |
| Cámara de hipoxia | StemCell Technologies | 27310 | Para crear una condición hipóxica con un entorno de 0,01%O2 |
| Medidor de flujo de cámara de hipoxia | StemCell Technologies | 27311 | Para conectar con el tanque de gas hipóxico para una velocidad de flujo de gas constante |
| Tanque de gas hipóxico (0.01%O2 cilindro) | A-L Gases comprimidos | UN1956 | Se utiliza para lavar el medio hipóxico y la cámara (0.01%O2/5%CO2/94.99N2 |
| )Microscopio | Nikon | TMS | Para observar la condición de la célula |
| Células endoteliales de la arteria coronaria primaria del ratón (EC) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | Aislado de la arteria coronaria de ratones C57BL/6 |
| Tubos NUNC 15ML CONICL Fisher | Scientific | 12565269 | Para el proceso de cultivo celular, experimentos, preparación de soluciones, etc. |
| Tubos NUNC 50ML CONICL | Fisher Scientific | 12565271 | Para procesos de cultivo celular, experimentos, preparación de soluciones, etc. |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | Se utiliza para el lavado de células durante el cultivo o los experimentos |
| Lector de placas | BioTek Instrument | 11120533 | Lectura de placas colorimétricas o fluorométricas |
| Reacción 96 Bien Palte (transparente, sin tapa) | Fisher Scientific | 12565226 | Se utiliza para la lectura de placas de medición de LDH |
| Tripsina/EDTA para CM | Celprogen Inc | T1509-014 | estéril filtrada y probada en cultivo de tejidos |
| para ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25%, probado en cutura celular |
Referencias
- Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial is....
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Reimpresiones y permisos
